Name: force spectroscopy of single protein molecules using an atomic force microscope
Uploaded: 2019-02-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope at JoVE.com

كان يدعمها هذا العمل على منح "المؤسسة الوطنية للعلوم" 1244297 المجلس والمجلس-1517245 ليم.

1-إعداد البروتين
<ol><li>استنساخ الحمض النووي.<ol>
<li>تجميع تسلسل الحمض النووي للاهتمام، على سبيل المثال، تسلسل الحمض النووي ني10ج10، أو عزل عن طريق PCR من الكائن الحي المضيف باستخدام تقنيات البيولوجيا الجزيئية القياسية11. الجناح في الجينات للفائدة مع تقييد مو...

<ol>
	<li>Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+Unfolding+of+Individual+Titin+Immunoglobulin+Domains+by+AFM.">Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM.</a> Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).</li><li>Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+protein+mechanics+with+the+atomic+force+microscope.">The study of protein mechanics with the atomic force microscope.</a> Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).</li><li>Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+studies+of+protein+folding+by+atomic+force+microscopy(AFM).">Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM).</a> Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).</li><li>Rico, F., Chu, C., Moy, V. T., Braga, P. C., Ricci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology. 736, 331-353 (2011).</li><li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology.">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).</li><li>Lv, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+biomaterials+to+mimic+the+mechanical+properties+of+muscles.">Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles.</a> Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanics+of+Streptavidin+Hubs+for+Molecular+Materials.">Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials.</a> Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).</li><li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Adhesive+Hydrogels+from+Intrinsically+Unstructured+Proteins.">Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins.</a> Advanced Materials. , (2017).</li><li>Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+unfolding+of+titin+under+force-clamp+atomic+force+microscopy.">Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).</li><li>Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+Mechanical+Unfolding+Pathway+of+a+Large+Protein+with+Coiled-Coil+Probes.">Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).</li><li>Davis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in molecular biology. , (2012).</li><li>Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular,+Non-Degenerate+Polyprotein+Scaffold+for+Atomic+Force+Spectroscopy.">A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy.</a> Biomacromolecules. , (2016).</li><li>Scholl, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , (2016).</li><li>Pawlak, K., Strzelecki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopuller-open+data+acquisition+platform+for+AFM+force+spectroscopy+experiments.">Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments.</a> Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).</li><li>. Nanopuller Available from: <a target="_blank" href="https://sourceforge.net/projects/nanopuller/">https://sourceforge.net/projects/nanopuller/</a> (2018)</li><li>Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+single+molecule+force+spectroscopy+through+automated+real-time+data+collection+and+quantification+of+experimental+conditions.">Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions.</a> Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).</li><li>Bouchiat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+persistence+length+of+a+worm-like+chain+molecule+from+force-extension+measurements.">Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements.</a> Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).</li><li>Su, T., Purohit, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+forced+unfolding+of+proteins.">Mechanics of forced unfolding of proteins.</a> Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).</li><li>Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+cloning+system+for+construction+of+multimeric+proteins+for+use+in+atomic+force+microscopy.">Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy.</a> Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).</li><li>Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular,+Nondegenerate+Polyprotein+Scaffolds+for+Atomic+Force+Spectroscopy.">Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy.</a> Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).</li><li>Hoffmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Robust+Polyprotein+Production+Facilitates+Single-Molecule+Mechanical+Characterization+of+&#946;-Barrel+Assembly+Machinery+Polypeptide+Transport+Associated+Domains.">Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of &#946;-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains.</a> ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).</li><li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory,+analysis,+and+interpretation+of+single-molecule+force+spectroscopy+experiments.">Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).</li><li>Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Halotag+Tethers+to+Study+Titin+Folding+at+the+Single+Molecule+Level.">Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level.</a> Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).</li><li>Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+dynamics+in+the+unfolding+of+individual+bacteriorhodopsin+proteins.">Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins.</a> Science. 355 (6328), 945-950 (2017).</li><li>Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+force+spectroscopy+unfolds+titin+at+the+velocity+of+molecular+dynamics+simulations.">High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations.</a> Science. 342 (6159), 741-743 (2013).</li><li>He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+protein+conformations+by+single-molecule+AFM-FRET+nanoscopy.">Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy.</a> ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).</li><li>Fotiadis, D., Scheuring, S., M&#252;ller, S. A., Engel, A., M&#252;ller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+manipulation+of+biological+structures+with+the+AFM.">Imaging and manipulation of biological structures with the AFM.</a> Micron. 33 (4), 385-397 (2002).</li><li>Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Spectroscopy+with+9-&#956;s+Resolution+and+Sub-pN+Stability+by+Tailoring+AFM+Cantilever+Geometry.">Force Spectroscopy with 9-&#956;s Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry.</a> Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).</li><li>Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+kinetics+from+single-molecule+force+spectroscopy:+Nanopore+unzipping+of+DNA+hairpins.">Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins.</a> Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).</li><li>Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+Force+Spectroscopy+Reveals+the+Calcium+Dependence+of+the+Alternative+Conformations+in+the+Native+State+of+a+&#946;&#947;-Crystallin+Protein.">Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a &#946;&#947;-Crystallin Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).</li></ol>

خطوة حاسمة في البروتوكول هو استخدام بوليبروتين، الموضحة في الخطوة 1-1-2، الذي يعمل كعنصر تحكم إيجابية "البصمات" الأحداث جزيء واحد. عموما، هناك يجب أن تكون تتكشف أحداث البروتينات بوليبروتين (ل I91، وهذا يعني قوة تتكشف لزيادة طول السند الإذني وكفاف حوالي 200 من حوالي 28 nm) تختتم دون لبس أن بروتين ا?...

وقد مكنت السلف في جزيء واحد قوة التحليل الطيفي (SMFS) بفؤاد التلاعب الميكانيكية وتوصيف دقيق لجزيئات البروتين وحيد. وهذا الوصف قد أنتجت رؤى رواية عن البروتين ميكانيكا1،2، البروتين قابلة للطي3، البروتين-يجند التفاعلات4، تفاعلات البروتين البروتين5، والقائم على البروتين المهندسة المواد6،،من78. SMFS مفيد بشكل خاص لدراسة البروتين تتكشف، كما تمتد من فؤاد يسمح السندات الكيميائية والفيزيائية في جزيء البروتين تدريجيا تمديد وفقا صلابة، مما يثير بطول كفاف متزايدة باستمرار. هذا إرهاق لجزيء البروتين يمكن أن تنتج انتقال مفاجئ في منحنى القوة-ملحق أسفر عن حدث تمزق (أو القوة الذروة). ذروة القوة يعطي معلومات مباشرة على تغيير الهيكلية والقوة التي تتكشف من البروتين أثناء عملية تتكشف الميكانيكية. واحدة من أولى الدراسات استخدام فؤاد قياس تيتين1 والاطلاع على جوانب الرواية من البروتين التي تتكشف وريفولدينج تحت الظروف الفسيولوجية دون استخدام ديناتورانتس غير طبيعية مثل تركيز المواد الكيميائية أو درجات الحرارة القصوى.
SMFS تجارب تجري على مجموعة متنوعة من الصكوك، على الرغم من هنا ننظر فقط فؤاد. فؤاد يتكون من أربعة عناصر رئيسية: التحقيق والكاشف وصاحب العينة والماسح الضوئي كهرضغطية. التحقيق تلميح حاد في نهاية فريسوينجينج ناتئ. بعد المعايرة، يقاس منحنية ناتئ خلال تمتد من جزيء المرفقة استخدام شعاع ليزر الذي ينعكس قبالة الجزء الخلفي ناتئ لتحديد دقة باستخدام قانون هوك للقوات. المشاريع شعاع الليزر المنعكس في جهاز كشف الضوئي رباعي، التي تنتج من جهد ما يتناسب مع تشريد شعاع الليزر من مركز صمام ثنائي. الركيزة مع العينة البروتين في سائل محمل على خشبة المسرح كهرضغطية ثلاثية الأبعاد التي يمكن التحكم بدقة نانومتر الفرعية. كمبيوتر يقرأ الجهد من أجهزة الكشف الضوئي وضوابط مرحلة ثلاثية الأبعاد من خلال إمداد بجهد تسيطر على جهاز الكمبيوتر. هذه المراحل صمام بيزو عادة ما تكون مجهزة بالسعة أو السلالة-قياس أجهزة استشعار الموقف بدقة قياس بيزو التشرد وإلى التباطؤ الصحيحة من خلال نظام مراقبة التغذية المرتدة. يتم تحويل الناتج الاستشعار الإشارات من وحدة تحكم بيزو إلى المسافة باستخدام الجهد المستمر من بيزو هو معايرة مصنع. ويرد في الشكل 2منحنى قوة-ملحق مثال من تجربة سحب.
هناك نوعان من التجارب SMFS فؤاد: سرعة ثابتة ومستمرة قوة سحب القياسات. ويرد وصف القياسات SMFS قوة ثابتة في أوبيرهاوسير et al. 9، بينما نركز هنا على قياسات السرعة ثابتة. نموذجي فؤاد ثابت-سرعة سحب تجربة يتم عن طريق توفير الجهد إلى بيزو المضي بلطف ركيزة بالنسبة إلى طرف ناتئ. تجربة نموذجية بنصيحة في البداية الضغط على السطح. هو بدأ قياس سحب عن طريق تحريك الركيزة بعيداً عن التلميح ﻹخراج من جهة الاتصال. إذا كان بروتين يأتي في اتصال مع التلميح في البداية، فإنه سوف يتم سحب وسيقاس التتبع التي تتكشف للقوة ضد التشرد. الركيزة هو إعادته ثم اتصال مع التلميح ويتم قياس أثر استرخاء حيث يمكن تحديد طي البروتين من تشريد القوة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM Specimen Discs, 15mm diameter</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>16218</td>
			<td>Serve as base for glass substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>26024</td>
			<td>serve as glass substrate and base for gold coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Tabs</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>16079</td>
			<td>Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STD Multimode head assembly</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>1B75C</td>
			<td>AFM head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass probe holder</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>MTFML-V2</td>
			<td>Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlever AFM probes</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM probes with Au coated tips</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>OBL-10</td>
			<td>Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6259</td>
			<td>Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LISA Linear Piezo Stage Actuators</td>
			<td>Physik Instrumente LP</td>
			<td>P-753.11C</td>
			<td>Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Piezo Stage</td>
			<td>Physik Instrumente LP</td>
			<td>P-541.2CD</td>
			<td>Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

force spectroscopy of single protein molecules using an atomic force microscope

تصميم عملية قابلة للطي للبروتينات من تسلسل الأحماض الأمينية بها إلى بنيتها ثلاثية الأبعاد الأصلية تعتبر مشكلة هامة في مجال البيولوجيا. مجهر القوة الذرية (AFM) ويمكن معالجة هذه المشكلة عن طريق تمكين التمدد والاسترخاء من جزيئات البروتين وحيد، الذي يعطي الأدلة المباشرة تتكشف وريفولدينج خصائص محددة. المستندة إلى فؤاد جزيء واحد القوة-التحليل الطيفي (فؤاد-SMFS) يوفر وسيلة لقياس ثبات والتشكلات الجسيمات ذات الطاقة العالية في البروتينات التي غير ممكنة في القياسات التقليدية الأكبر (البيوكيميائية). رغم أنه تم نشر العديد من الأوراق لإظهار مبادئ فؤاد SMFS، فإنه ليس من السهل إجراء تجارب SMFS نظراً لعدم وجود بروتوكول استفاضة كاملة. في هذه الدراسة، ونحن بإيجاز توضيح مبادئ فؤاد وتفاصيل البروتوكولات والإجراءات، وتحليل البيانات على نطاق واسع كمبدأ توجيهي لتحقيق نتائج جيدة من تجارب SMFS. نظهر الممثل SMFS نتائج القياسات التي تتكشف الميكانيكية البروتين وحيد ونحن نقدم استكشاف استراتيجيات لبعض شيوعاً واجه مشاكل.

وتظهر نتائج تمثيلية من هذا البروتوكول في الشكل 2. إظهار كلا الفريقين منحنيات تمديد القوة التمثيلية من البروتينات. يظهر الأعلى النتائج من بوليبروتين I91، بينما يظهر الأسفل البروتين I91 المرافقة بروتين من فائدة، جزيء10ج ني. هذه التسجيلات إظهار القوة الم?...

Watch this Scientific Journal Video about Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope at JoVE.com

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

التحليل الطيفي لجزيئات البروتين وحيد باستخدام مجهر قوة ذرية قوة

نحن وصف إجراءات مفصلة واستراتيجيات لقياس الخواص الميكانيكية والميكانيكية مسارات تتكشف من الجزيئات البروتينية مفرد باستخدام مجهر قوة ذرية. ونحن أيضا إظهار نتائج الممثل كمرجع للتحديد وتبرير لتسجيلات جزيء بروتين واحد جيد.

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

يمكن أن يوفر التحليل الطيفي للقوة أحادية الجزيء رؤى هائلة في البيولوجيا الجزيئية على النطاق الذري من خلال السماح لنا بالتلاعب بجزيئات واحدة بقوة. هنا، نُظهر قياس السرعة الثابت باستخدام مجهر القوة الذرية. يمكننا في نهاية المطاف استخدام البيانات لتحديد استقرار البروتين ، ومعدل تتكشف ، ومسار تتكشف.لبدء الإجراء، قم بتوصيل علامة تبويب لاصقة غير موصلة إلى قرص حديدي نظيف بعرض 15 ملليمترًا. قم بإزالة ورقة الغلاف واضغط بقوة على شريحة زجاجية نظيفة أو غير مغلفة بالذهب على اللصق المكشوف. تخزين الشريحة في نظيفة، مغطاة طبق بيتري.بعد ذلك، ركز البوليبروتين المنقى في فلتر الطرد المركزي، ثم عكس العمود والعكس البروتين في المخزن المؤقت لاستخدامه في التجربة. تحديد تركيز البروتين المناسب على أساس امتصاص في 280 نانومتر، ومن ثم إعداد 100 ميكرولتر من 100 ميكروغرام في الميلليلتر من البروتين. تطبيق 60 ميكرولتر قطرة من محلول البروتين إلى مركز الشريحة.الحرص على عدم السماح للسائل زلة بين الشريحة والقرص الحديدي، وهذا سيؤدي إلى حركات العينة غير المنضبط خلال التجربة. دع العينة تجلس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق على الأقل. أولاً، التقط بعناية الـ"كانتليفر" في النهاية وضعه في خلية المُسبار المُحتجزة.تأكد من أن الـ cantilever مُقعد بقوة. ثم ضع الخلية القابضة في رأس AFM. تعيين الرأس على مرحلة المجهر المقلوب وتوصيل حزمة بطارية إلى رئيس AFM لتشغيل الليزر.قم بإعداد كاميرا للكشف عن المجهر لتصور ضوء الليزر على شاشة العرض أو شاشة التلفزيون. تسترشد المجهر، ضع الليزر بحيث يتم توجيهه إلى تلميح cantilever. مرة واحدة في العينة جاهزة، تدفق 10 ميكرولترات من المخزن المؤقت التجربة في كل ميناء من خلية مسبار عقد.decant ما يقرب من 40 ميكرولترات من السوائل من الشريحة عينة وإضافة 40 ميكرولترات من العازلة. في غضون ذلك، تبدأ إعداد مجهر القوة الذرية للقياس. أولاً، ضع الشريحة على المغناطيس فوق محرك بيزو.تأكد من أن مرحلة AFM في وضعية مرتفعة، ثم ضع رأس AFM على المسرح مع الـ cantilever فوق قطرات العينة. بعد ذلك، ضع قطعة صغيرة من الورق أمام الصمام الضوئي AFM. اضبط الليزر حتى تصبح البقعة على الورق ساطعة ومركزة، ثم قم بإزالة الورق.بدء تشغيل برنامج AFM لعرض إشارة من الصمام الضوئي. اضبط مرآة رأس AFM بحيث يتم تكبير إشارة الليزر في جميع رباعيات الدايود الضوئي الأربعة، وإشارة مختلفة بين أزواج الربع العلوي والسفلي هي صفر. للبدء في معايرة AFM، قم بتشغيل إعداد الفلتر لإشارة رأس AFM إلى عرض النطاق الترددي الكامل، وتأكد من إيقاف جهاز بيزو.في برنامج AFM، قم بقياس متوسط 512 حسابًا لطيف الطاقة، مع 1,024 نقطة بيانات لكل حساب. دمج كثافة الطيفية السلطة عبر الذروة الأولى، والذي يتوافق مع الوضع الرئيسي للاهتزاز ل cantilever. بعد ذلك، قم بتشغيل وحدة تحكم بيزو وتعيين عامل التصفية إلى 500 هيرتز.تحرك بسرعة رئيس AFM أسفل بضع مئات من ميكرومترات أثناء مراقبة إشارة مختلفة. مواصلة تحريك الرأس إلى أسفل بضع مئات من ميكرومتر في وقت بينما يراقب لقفزات متسقة في إشارة مختلفة. عندما يقفز إشارة تبدأ في زيادة في الارتفاع، غيض هو قريب جدا من سطح العينة.مرة واحدة في إشارة انحراف تشبع على اتصال تلميح مع السطح، ورفع الرأس قليلا، ثم ضبط الجهد بيزو لتحريك رئيس AFM صعودا أو إلى أسفل من قبل 100 إلى 5، 000 نانومتر للعثور على سطح العينة. بعد ذلك، إجراء تجربة سحب مع حجم مسح من حوالي 500 نانومتر بحيث الطرف اتصالات السطح، أو حوالي 100 نانومتر من السفر الحركي بيزو. استخدم النتائج لحساب ثابت الربيع و حساسيته.في البرنامج، تعيين حجم المسح الضوئي إلى 40٪ أكبر من الحجم النظري الإجمالي للبوليبروتين تتكشف. ضع الكانتيليف بحيث يكون 80٪ من حجم المسح الضوئي بعيدًا عن السطح. تعيين سرعة المسح الضوئي إلى 300 نانومتر في الثانية الواحدة.تنفيذ تجربة سحب وقياس موقف بيزو الناتجة وإشارة الصمام الضوئي. أضف مخزن التجربة المؤقت إلى خلية السوائل كل ساعة خلال القياس للحفاظ على العينة من الجفاف. الأحداث التي تتكشف في تسجيلات لـ I91 polyprotein وبوليبروتين الذي يحيط ثلاثة مجالات I91 جزيء NI10C على كل جانب ، تم تركيبها مع نموذج سلسلة تشبه الديدان.كل من التسجيلات تظهر القوة المميزة وزيادات الطول كفاف من I91، مما يدل على أن المعايرة AFM كانت ناجحة. وأظهرت تسجيلات البوليبروتين التي تحتوي على جزيء N110C ما يكفي من الأحداث I91 للتأكد من أن الأحداث الجديدة كانت من البروتين من الاهتمام تتكشف. وكان متوسط طول كفاف لتكرار أنكرين حوالي 10.5 نانومتر، وكانت القوات التي تتكشف بين ثمانية و 25 piconewtons.من الضروري استخدام البوليبروتين لأن الأحداث التي تتكشف للبروتينات المرافقة توفر تحكمًا إيجابيًا لبصمات الإصبع على حدث الجزيء الواحد. وبدون ذلك، فإن البيانات عرضة لسوء التفسير.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Visualizing Cells, Tissues, and Molecules

SCIENTISTS IN ACTION

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

الحجم الذري الدراسات الهيكلية للتجميعات الجزيئات بالتحليل الطيفي الرنين المغناطيسي النووي الصلبة

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

التقاط حركية التفاعل البروتين قناة أيون مع جزيئات صغيرة بمقايسة التداخلي بيو-طبقة

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

تحليل الطيفي تقلب Fluorescence من تفاعلات البروتين البروتين في الخلية جهات الاتصال

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

سبر بنية وديناميات Nucleosomes استخدام Imaging مجهر القوة الذرية

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

تصوير الحويصلات خارج الخلية عن طريق الفحص المجهري للقوة الذرية

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

مجهريتتبع جزيء واحد - أداة لتحديد الدول المنافية للجزيئات الخلوية

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

الطيفية الامتصاص الذري لقياس برك الزنك داخل خلايا الثدييات

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

تقييم تفاعلات البروتين والبروتين باستخدام تقنية الهضم على الغشاء

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

وصف مجاميع البروتين الفردية عن طريق الفحص النانوي بالأشعة تحت الحمراء والفحص المجهري للقوة الذرية

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...