Name: force spectroscopy of single protein molecules using an atomic force microscope
Uploaded: 2019-02-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af National Science Foundation støtte MCB-1244297 og MCB-1517245 til PEM.

1. protein forberedelse
<ol><li>DNA kloning.<ol>
<li>Syntetisere en DNA sekvens af interesse, for eksempel DNA-sekvens af NI10C10, eller isolere via PCR fra værtsorganismen ved hjælp af standard molekylærbiologiske teknikker11. Flanke gen af interesse med begrænsning websteder under syntese eller ved at placere websteder i 5'-enden af PCR-primere svarer til et modul i plasmidet pEMI91 (Addgene #74888)12.</li>
		<li>Separat f...

<ol>
	<li>Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+Unfolding+of+Individual+Titin+Immunoglobulin+Domains+by+AFM.">Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM.</a> Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).</li><li>Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+protein+mechanics+with+the+atomic+force+microscope.">The study of protein mechanics with the atomic force microscope.</a> Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).</li><li>Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+studies+of+protein+folding+by+atomic+force+microscopy(AFM).">Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM).</a> Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).</li><li>Rico, F., Chu, C., Moy, V. T., Braga, P. C., Ricci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology. 736, 331-353 (2011).</li><li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology.">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).</li><li>Lv, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+biomaterials+to+mimic+the+mechanical+properties+of+muscles.">Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles.</a> Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanics+of+Streptavidin+Hubs+for+Molecular+Materials.">Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials.</a> Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).</li><li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Adhesive+Hydrogels+from+Intrinsically+Unstructured+Proteins.">Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins.</a> Advanced Materials. , (2017).</li><li>Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+unfolding+of+titin+under+force-clamp+atomic+force+microscopy.">Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).</li><li>Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+Mechanical+Unfolding+Pathway+of+a+Large+Protein+with+Coiled-Coil+Probes.">Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).</li><li>Davis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in molecular biology. , (2012).</li><li>Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular,+Non-Degenerate+Polyprotein+Scaffold+for+Atomic+Force+Spectroscopy.">A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy.</a> Biomacromolecules. , (2016).</li><li>Scholl, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , (2016).</li><li>Pawlak, K., Strzelecki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopuller-open+data+acquisition+platform+for+AFM+force+spectroscopy+experiments.">Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments.</a> Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).</li><li>. Nanopuller Available from: <a target="_blank" href="https://sourceforge.net/projects/nanopuller/">https://sourceforge.net/projects/nanopuller/</a> (2018)</li><li>Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+single+molecule+force+spectroscopy+through+automated+real-time+data+collection+and+quantification+of+experimental+conditions.">Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions.</a> Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).</li><li>Bouchiat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+persistence+length+of+a+worm-like+chain+molecule+from+force-extension+measurements.">Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements.</a> Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).</li><li>Su, T., Purohit, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+forced+unfolding+of+proteins.">Mechanics of forced unfolding of proteins.</a> Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).</li><li>Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+cloning+system+for+construction+of+multimeric+proteins+for+use+in+atomic+force+microscopy.">Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy.</a> Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).</li><li>Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular,+Nondegenerate+Polyprotein+Scaffolds+for+Atomic+Force+Spectroscopy.">Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy.</a> Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).</li><li>Hoffmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Robust+Polyprotein+Production+Facilitates+Single-Molecule+Mechanical+Characterization+of+&#946;-Barrel+Assembly+Machinery+Polypeptide+Transport+Associated+Domains.">Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of &#946;-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains.</a> ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).</li><li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory,+analysis,+and+interpretation+of+single-molecule+force+spectroscopy+experiments.">Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).</li><li>Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Halotag+Tethers+to+Study+Titin+Folding+at+the+Single+Molecule+Level.">Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level.</a> Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).</li><li>Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+dynamics+in+the+unfolding+of+individual+bacteriorhodopsin+proteins.">Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins.</a> Science. 355 (6328), 945-950 (2017).</li><li>Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+force+spectroscopy+unfolds+titin+at+the+velocity+of+molecular+dynamics+simulations.">High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations.</a> Science. 342 (6159), 741-743 (2013).</li><li>He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+protein+conformations+by+single-molecule+AFM-FRET+nanoscopy.">Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy.</a> ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).</li><li>Fotiadis, D., Scheuring, S., M&#252;ller, S. A., Engel, A., M&#252;ller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+manipulation+of+biological+structures+with+the+AFM.">Imaging and manipulation of biological structures with the AFM.</a> Micron. 33 (4), 385-397 (2002).</li><li>Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Spectroscopy+with+9-&#956;s+Resolution+and+Sub-pN+Stability+by+Tailoring+AFM+Cantilever+Geometry.">Force Spectroscopy with 9-&#956;s Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry.</a> Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).</li><li>Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+kinetics+from+single-molecule+force+spectroscopy:+Nanopore+unzipping+of+DNA+hairpins.">Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins.</a> Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).</li><li>Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+Force+Spectroscopy+Reveals+the+Calcium+Dependence+of+the+Alternative+Conformations+in+the+Native+State+of+a+&#946;&#947;-Crystallin+Protein.">Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a &#946;&#947;-Crystallin Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).</li></ol>

Et kritisk trin i protokollen er brugen af en polyprotein, beskrevet taktfast 1.1.2, der tjener som en positiv kontrol til "fingeraftryk" enkelt-molekyle begivenheder. Generelt, der skal udfoldelsen begivenheder af polyprotein proteiner (for I91, betyder det en udfoldelsen kraft af omkring 200 pN og kontur længde tilvækst af omkring 28 nm) til utvetydigt konkludere, at protein af interesse har været udfoldet. For eksempel, når protein af interesse er flankeret af tre I91 domæner fra begge sider, skal så der være m...

Fremskridt i enkelt molekyle kraft spektroskopi (SMF'ER) af AFM har aktiveret mekaniske manipulation og præcise karakterisering af enkelt proteinmolekyler. Denne Karakteristik har produceret nye indsigter om protein mekanik1,2, proteinfoldning3, protein-ligand interaktioner4, protein-protein interaktioner5, og protein-baserede manipuleret materialer6,7,8. SMF'ER er især nyttigt for at studere protein udspiller sig, som strækker sig af AFM tillader de kemiske og fysiske obligationer inden for protein molekyle gradvist udvide ifølge deres stivhed, som giver anledning til et stadigt stigende contour længde. Denne overstretching af et protein molekyle kan producere en brat overgang i kraft-udvidelse kurven resulterer i et brud begivenhed (eller tvinge peak). Force bjergtop giver direkte oplysninger om udfoldelsen kraft og strukturelle ændring af protein under den mekaniske udfoldelsen proces. En af de første undersøgelser ved hjælp af AFM målt titin1 og fundet nye aspekter af protein, udfoldning og hvorved man genfolder fysiologiske betingelser uden brug af unaturlige denatureringsmidler ligesom koncentreret kemikalier eller ekstreme temperaturer.
SMF'ER eksperimenter er udført på en bred vifte af instrumenter, men her mener vi kun AFM. AFM består af fire hovedelementer: sonden, detektoren, prøveholderen og den piezoelektriske scanner. Sonden er en skarp spids på en cantilever prægtig slutningen. Efter kalibrering, er bøjning af cantilever under udspænding af en vedhæftet molekyle målt ved hjælp af en laserstråle, der er reflekteres fra bagsiden af udlægget til netop afgøre styrker ved hjælp af Hookes lov. Afspejles laser stråle projekter i en kvadrant fotodiode detektor, som producerer en spænding i forhold til fordrivelse af laserstråle fra byens diode. Substratet med protein prøven i væske er monteret på en 3D piezoelektriske scene, der kan styres med sub nanometer præcision. En computer læser spændingen fra fotodiode detektorer og styrer den 3D scene gennem en computer-styrede spændingsforsyning. Disse piezo aktuator stadier er normalt udstyret med kapacitive eller stammen-gauge holdning sensorer til netop foranstaltning piezo deplacement og korrekte hysterese gennem feed-back control system. Sensor signaludgang fra piezo-controller er omdannet til afstand ved hjælp af konstanten spænding af piezo thats fabrik-kalibreret. Et eksempel force-udvidelsen kurve fra en trækker eksperiment er vist i figur 2.
Der er to typer af AFM-SMF'ER eksperimenter: konstant hastighed og konstant kraft trække målinger. Konstant kraft SMF'ER målinger er beskrevet i Oberhauser et al. 9, mens her vi fokuserer på konstant hastighed målinger. En typisk AFM konstant-velocity trækker eksperiment er udført af giver spænding til et piezo forsigtigt flytte et substrat i forhold til en cantilever tip. En typisk eksperiment har spidsen oprindeligt trykker mod overfladen. Den trækker måling er begyndt ved at flytte substrat fra spids til at bringe ud af kontakt. Hvis et protein, der kommer i kontakt med spids i første omgang, det vil blive trukket og udfoldelsen sporingen af magt mod fordrivelse vil blive målt. Underlaget er derefter bragt tilbage i kontakt med spidsen og en afslappende trace måles hvor proteinfoldning kan bestemmes fra force forskydning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM Specimen Discs, 15mm diameter</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>16218</td>
			<td>Serve as base for glass substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>26024</td>
			<td>serve as glass substrate and base for gold coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Tabs</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>16079</td>
			<td>Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STD Multimode head assembly</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>1B75C</td>
			<td>AFM head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass probe holder</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>MTFML-V2</td>
			<td>Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlever AFM probes</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM probes with Au coated tips</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>OBL-10</td>
			<td>Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6259</td>
			<td>Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LISA Linear Piezo Stage Actuators</td>
			<td>Physik Instrumente LP</td>
			<td>P-753.11C</td>
			<td>Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Piezo Stage</td>
			<td>Physik Instrumente LP</td>
			<td>P-541.2CD</td>
			<td>Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

force spectroscopy of single protein molecules using an atomic force microscope

Bestemmelse af de folde proces af proteiner fra deres aminosyresekvens til deres native 3D struktur er et vigtigt problem i biologi. Atomic force mikroskopi (AFM) kan løse dette problem ved at aktivere stretching og lempelse af enkelt proteinmolekyler, som giver direkte dokumentation for specifikke udfoldning og hvorved man genfolder karakteristika. AFM-baserede enkelt-molekyle kraft-spektroskopi (AFM-SMF'ER) giver mulighed for at måle konsekvent højenergi konformationer i proteiner, der ikke er muligt i traditionelle bulk (biokemiske) målinger. Skønt mange papirerne blev udgivet for at vise principper af AFM-SMF'ER, er det ikke let at udføre SMF'ER eksperimenter på grund af mangel på en udtømmende fuldstændig protokol. I denne undersøgelse, vi kort illustrerer principperne af AFM og detaljer omfattende protokoller, procedurer og analyse af data som en retningslinje til at opnå gode resultater fra SMF'ER eksperimenter. Vi demonstrere repræsentative SMF'ER resultater af enkelt protein mekaniske udfoldelsen målinger og vi leverer fejlfinding strategier for nogle almindeligt stødt på problemer.

Repræsentative resultater fra denne protokol er vist i figur 2. Begge paneler viser repræsentativ kraft-udvidelse kurver fra proteiner. Top viser resultater fra en I91 polyprotein, mens bunden viser I91 protein flankerende en protein-af-interesse, NI10C molekyle. Disse optagelser viser I91 karakteristiske kraft (200 pN) og kontur længde tilvækst (28 nm) som angiver, at den justering og kalibrering af AFM var vellykket. Disse force-udvidelsen ku...

Watch this Scientific Journal Video about Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope at JoVE.com

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kraft spektroskopi af enkelt proteinmolekyler ved hjælp af en Atomic Force mikroskop

Vi beskriver de detaljerede procedurer og strategier til at måle de mekaniske egenskaber og mekaniske udfoldelsen veje af enkelt proteinmolekyler ved hjælp af en atomic force mikroskop. Vi viser også repræsentative resultater som reference for valg af og begrundelse for god enkelt protein molekyle optagelser.

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Enkeltmolekyle kraftspektroskopi kan give enorm indsigt i molekylærbiologi på atomskalaen ved at give os mulighed for at manipulere enkelte molekyler med magt. Her demonstrerer vi en konstant hastighedsmåling ved hjælp af atomkraftmikroskop. Vi kan i sidste ende bruge dataene til at bestemme proteinstabiliteten, udfolde hastigheden og foldevejen ud.For at starte proceduren, vedhæfte en ikke-ledende klæbende fane til en ren, 15 millimeter bred jern disk. Fjern dækpladen, og tryk fast på et rent, ubestrøget eller guldbelagt glasrutsjebane på det eksponerede klæbemiddel. Opbevar diaset i en ren, overdækket petriskål.Dernæst koncentreres det rensede polyprotein i et centrifugalfilter, og vend derefter kolonnen om og eluter proteinet ind i den buffer, der skal anvendes i forsøget. Den passende proteinkoncentration bestemmes på grundlag af absorbansen ved 280 nanometer, og der tilberedes derefter 100 mikroliter af en 100 mikrogram pr. milliliteropløsning af proteinet. Påfør en 60 mikroliter dråbe af proteinopløsningen til midten af diaset.Pas på ikke at lade væsken glide mellem diaset og jerndisken, da dette vil føre til ukontrollerede prøvebevægelser under forsøget. Lad prøven sidde ved stuetemperatur i mindst 10 minutter. Først skal du forsigtigt afhente cantilever ved udgangen og læg den i sonden bedrift celle.Sørg for, at cantilever sidder fast. Placer derefter holdecellen i AFM-hovedet. Indstil hovedet på en omvendt mikroskop fase og tilslut en batteripakke til AFM hovedet til magten laseren.Opret et kamera til mikroskopdetektoren for at visualisere laserlyset på en skærm eller tv-skærm. Styret af mikroskopet, skal du placere laseren, så den rettes mod cantilever spidsen. Når prøven er klar, skylles 10 mikroliter af eksperimentbufferen ind i hver port i sondeholdecellen.Dekantere ca. 40 mikroliter væske fra prøveskredsen og tilsæt 40 mikroliter buffer. I mellemtiden begynde at forberede atomstyrkemikroskopet til målingen. Først skal du placere diaset på magneten over piezomotoren.Bekræft, at AFM-fasen er i den forhøjede position, og placer derefter AFM-hovedet på scenen med udkræjsen over prøvedråberne. Dernæst skal du placere et lille stykke papir foran AFM fotodiode. Juster laseren, indtil pletten på papiret er lyst og fokuseret, og fjern derefter papiret.Start AFM-softwaren for at se signalet fra fotodioden. Juster AFM-hovedspejlet, så lasersignalet maksimeres i alle fire fotodiodekvadranter, og et andet signal mellem de øverste og nederste kvadrantpar er nul. Hvis du vil begynde at kalibrere AFM'en, skal du slå filterindstillingen for AFM-hovedsignalet til fuld båndbredde og sikre, at piezoen er slukket.I AFM-softwaren skal du måle gennemsnittet af 512 beregninger af effektspektret med 1.024 datapunkter pr. beregning. Integrer den effektspektrale tæthed på tværs af den første top, hvilket svarer til den vigtigste tilstand af vibrationer for cantilever. Tænd derefter for piezo-controlleren, og indstil filteret til 500 Hertz.Hurtigt flytte AFM hovedet ned et par hundrede mikrometer, mens overvågning af de forskellige signal. Fortsæt med at flytte hovedet ned et par hundrede mikrometer ad gangen, mens du ser for konsekvente spring i de forskellige signal. Når signalet springer begynder at stige i højden, spidsen er meget tæt på prøven overflade.Når afbøjningssignalet mættes ved spidskontakt med overfladen, skal du løfte hovedet en smule, og derefter justere piezospændingen for at flytte AFM hovedet op eller ned med 100 til 5.000 nanometer for at finde prøveoverfladen. Efter at foretage en trække eksperiment med en scanning størrelse på omkring 500 nanometer, således at spidsen kontakter overfladen, eller omkring 100 nanometer af piezo motorrejser. Brug resultaterne til at beregne fjederkonstant og følsomhed.I softwaren skal du indstille scanningsstørrelsen til 40% større end den samlede teoretiske størrelse af det udfoldende polyprotein. Placer cantilever, så det er 80% af scanningen størrelse væk fra overfladen. Indstil scanningshastigheden til 300 nanometer pr. sekund.Udfør et trækeksperiment, og mål den resulterende piezoposition og fotodiodesignalet. Tilføj eksperimentbufferen til væskecellen hver time i hele målingen for at forhindre prøven i at tørre ud. De udfoldende begivenheder i optagelser af en I91 polyprotein og af et polyprotein, hvor tre I91 domæner flankeret NI10C molekyle på hver side, blev udstyret med en orm-lignende kæde model.Begge optagelser viser de karakteristiske kraft- og konturlængdeintervaller i I91, hvilket indikerer, at AFM-kalibreringen lykkedes. Optagelserne af polyproteinet, der indeholdt N110C-molekylet, viste nok I91 hændelser til at bekræfte, at de nye hændelser var fra det protein af interesse, der udfoldede sig. Den gennemsnitlige kontur længde for ankyrin gentage var omkring 10,5 nanometer, og udfoldelse kræfter var mellem otte og 25 piconewtons.Det er vigtigt at bruge et polyprotein, fordi de flankerende proteiners udfoldelser giver en positiv kontrol til at tage fingeraftryk af enkeltmolekylehændelsen. Uden dette kan dataene misfortolkes.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Visualizing Cells, Tissues, and Molecules

SCIENTISTS IN ACTION

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomar skala strukturelle undersøgelser af makromolekylære forsamlinger af Solid-state Kernemagnetisk resonans-spektroskopi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Indfange interaktion kinetik af en Ion-kanal Protein med små molekyler af Bio-lag interferometri Assay

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering af proteiner for enkelt molekyle kraft spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Et fluorescens udsving spektroskopi Assay af Protein-Protein interaktioner på celle-celle kontakter

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Sondering struktur og dynamik af Nucleosomes ved hjælp af Atomic Force mikroskopi Imaging

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Billeddannelse af ekstracellulære vesikler ved atomkraften mikroskopi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Enkelt-molekyle tracking mikroskopi-et værktøj til bestemmelse af Difvøse tilstande af Cytosolic molekyler

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Atomabsorptionsspektroskopi til måling af intracellulære zink puljer i pattedyrsceller

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluering af protein-protein interaktioner ved hjælp af en on-membran fordøjelse teknik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Karakterisering af individuelle protein aggregater ved infrarød Nanospektroskopi og atomkraften mikroskopi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...