Name: force spectroscopy of single protein molecules using an atomic force microscope
Uploaded: 2019-02-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי קרן המדע הלאומית מענקים MCB-1244297 MCB-1517245 כדי PEM.

1. חלבון הכנה
<ol><li>שכפול ה-DNA.<ol>
<li>לסנתז רצף ה-DNA של עניין, לדוגמה, רצף ה-DNA של10ג ני10, או לבודד באמצעות PCR של האורגניזם המארח באמצעות שיטות בביולוגיה מולקולרית סטנדרטי11. לאגף את הגן עניין באתרים מגבלת במהלך סינתזה או על-ידי הצבת אתרים בסוף 5'-תחל PCR כדי שיתאימ...

<ol>
	<li>Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+Unfolding+of+Individual+Titin+Immunoglobulin+Domains+by+AFM.">Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM.</a> Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).</li><li>Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+protein+mechanics+with+the+atomic+force+microscope.">The study of protein mechanics with the atomic force microscope.</a> Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).</li><li>Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+studies+of+protein+folding+by+atomic+force+microscopy(AFM).">Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM).</a> Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).</li><li>Rico, F., Chu, C., Moy, V. T., Braga, P. C., Ricci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology. 736, 331-353 (2011).</li><li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology.">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).</li><li>Lv, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+biomaterials+to+mimic+the+mechanical+properties+of+muscles.">Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles.</a> Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanics+of+Streptavidin+Hubs+for+Molecular+Materials.">Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials.</a> Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).</li><li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Adhesive+Hydrogels+from+Intrinsically+Unstructured+Proteins.">Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins.</a> Advanced Materials. , (2017).</li><li>Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+unfolding+of+titin+under+force-clamp+atomic+force+microscopy.">Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).</li><li>Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+Mechanical+Unfolding+Pathway+of+a+Large+Protein+with+Coiled-Coil+Probes.">Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).</li><li>Davis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in molecular biology. , (2012).</li><li>Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular,+Non-Degenerate+Polyprotein+Scaffold+for+Atomic+Force+Spectroscopy.">A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy.</a> Biomacromolecules. , (2016).</li><li>Scholl, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , (2016).</li><li>Pawlak, K., Strzelecki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopuller-open+data+acquisition+platform+for+AFM+force+spectroscopy+experiments.">Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments.</a> Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).</li><li>. Nanopuller Available from: <a target="_blank" href="https://sourceforge.net/projects/nanopuller/">https://sourceforge.net/projects/nanopuller/</a> (2018)</li><li>Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+single+molecule+force+spectroscopy+through+automated+real-time+data+collection+and+quantification+of+experimental+conditions.">Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions.</a> Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).</li><li>Bouchiat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+persistence+length+of+a+worm-like+chain+molecule+from+force-extension+measurements.">Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements.</a> Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).</li><li>Su, T., Purohit, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+forced+unfolding+of+proteins.">Mechanics of forced unfolding of proteins.</a> Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).</li><li>Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+cloning+system+for+construction+of+multimeric+proteins+for+use+in+atomic+force+microscopy.">Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy.</a> Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).</li><li>Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular,+Nondegenerate+Polyprotein+Scaffolds+for+Atomic+Force+Spectroscopy.">Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy.</a> Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).</li><li>Hoffmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Robust+Polyprotein+Production+Facilitates+Single-Molecule+Mechanical+Characterization+of+&#946;-Barrel+Assembly+Machinery+Polypeptide+Transport+Associated+Domains.">Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of &#946;-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains.</a> ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).</li><li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory,+analysis,+and+interpretation+of+single-molecule+force+spectroscopy+experiments.">Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).</li><li>Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Halotag+Tethers+to+Study+Titin+Folding+at+the+Single+Molecule+Level.">Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level.</a> Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).</li><li>Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+dynamics+in+the+unfolding+of+individual+bacteriorhodopsin+proteins.">Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins.</a> Science. 355 (6328), 945-950 (2017).</li><li>Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+force+spectroscopy+unfolds+titin+at+the+velocity+of+molecular+dynamics+simulations.">High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations.</a> Science. 342 (6159), 741-743 (2013).</li><li>He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+protein+conformations+by+single-molecule+AFM-FRET+nanoscopy.">Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy.</a> ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).</li><li>Fotiadis, D., Scheuring, S., M&#252;ller, S. A., Engel, A., M&#252;ller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+manipulation+of+biological+structures+with+the+AFM.">Imaging and manipulation of biological structures with the AFM.</a> Micron. 33 (4), 385-397 (2002).</li><li>Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Spectroscopy+with+9-&#956;s+Resolution+and+Sub-pN+Stability+by+Tailoring+AFM+Cantilever+Geometry.">Force Spectroscopy with 9-&#956;s Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry.</a> Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).</li><li>Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+kinetics+from+single-molecule+force+spectroscopy:+Nanopore+unzipping+of+DNA+hairpins.">Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins.</a> Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).</li><li>Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+Force+Spectroscopy+Reveals+the+Calcium+Dependence+of+the+Alternative+Conformations+in+the+Native+State+of+a+&#946;&#947;-Crystallin+Protein.">Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a &#946;&#947;-Crystallin Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).</li></ol>

שלב קריטי בפרוטוקול הוא השימוש polyprotein, שמתואר בשלב 1.1.2, אשר משמש פקד חיובי כדי "טביעות אצבע" אירועים מולקולה בודדת. באופן כללי, יש חייב להיות התגלגלות אירועים של החלבונים polyprotein (עבור I91, המשמעות היא כוח התגלגלות כ-200 pN, מתאר אורך קבועה של 28 ננומטר) למסקנה חד משמעית כי החלבון עניין כבר פרש. לדוגמ...

ההתקדמות ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת (SMFS) על ידי AFM אפשרו במחרוזות מכני, אפיון מדויק של מולקולות חלבון יחיד. אפיון זה הפיק הרומן תובנות על חלבון מכניקה1,2, קיפול3, אינטראקציות חלבון-ליגנד4, אינטראקציות חלבון-חלבון5, החלבון ומתוכננים מבוססי חלבונים חומרים6,7,8. SMFS שימושית במיוחד עבור לימוד חלבון התגלגלות, כמו מתיחה על ידי AFM מאפשרת את הקשר הכימי והפיזי בתוך מולקולת חלבון להרחיב בהדרגה על פי שלהם נוקשות, אשר נותן לעלות באורך מתאר גדל ללא הרף. זו מתיחת של מולקולה חלבון יכול לייצר מעבר פתאומי בתוך עקומת כוח-סיומת וכתוצאה אירוע קרע (או לאלץ את שיא). הפסגה כוח נותן מידע ישיר על השינוי כוח מבניים התגלגלות של החלבון במהלך התגלגלות תהליך מכני. אחד המחקרים הראשונים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי נמדד titin1 ומצאו היבטים חדשניים של חלבון התגלגלות, refolding בתנאים פיזיולוגיים ללא שימוש denaturants לא טבעיים כמו כימיקלים מרוכזים או טמפרטורות קיצוניות.
SMFS הניסויים נערכים על מגוון מכשירים, אך כאן אנו רואים רק AFM. AFM מורכב ארבעה מרכיבים עיקריים: החללית, הגלאי, המחזיק לדוגמה, הסורק פיזואלקטריים. המכשיר הוא קצה חד על קצה זיז שמתנדנדת חופשי. לאחר כיול, כיפוף הזיז בזמן מתיחות של מולקולה המצורפת נמדד באמצעות קרן לייזר זה משתקף מעל גבי הזיז במדויק לקבוע כוחות באמצעות חוק הוק. הפרויקטים קרן לייזר משתקף לתוך גלאי פוטודיודה רביע אשר מייצר מתח בפרופורציה העקירה של קרן הלייזר מהמרכז דיודה. המצע עם הדגימה החלבון בנוזל נטענה על שלב פיזואלקטריים 3D יכול להיות נשלט עם דיוק תת ננומטר. מחשב קורא את המתח מתוך גלאי פוטודיודה ופקדים השלב 3D דרך ספק מתח מבוקר-מחשב. אלה שלבים למפעיל piezo מצוידים בדרך כלל עם קיבולי או זן-מד חיישני מיקום בדיוק המידה piezo הזחה וכדי היסטרזיס הנכון באמצעות מערכת בקרת הזנה-בחזרה. הפלט אות חיישן של הבקר piezo מומר מרחק באמצעות מתח קבוע piezo זה לבצע כיול במפעל. מעגל הרחבת כוח דוגמה של ניסוי מושך מוצג באיור2.
ישנם שני סוגים של AFM-SMFS ניסויים: מהירות קבועה וכוח קבוע משיכת מדידות. מדידות SMFS כוח קבוע מתוארים Oberhauser. et al. 9, ואילו כאן נתמקד מדידות מהירות קבועה. טיפוסי AFM מהירות קבועה מושך ניסוי נעשית על-ידי אספקת מתח piezo להעביר בעדינות מצע ביחס טיפ זיז. ניסוי טיפוסי כולל הטיפ בהתחלה לוחצת כנגד פני השטח. המדידה מושך הוא התחיל על ידי הזזת את המצע מן העצה להביא איתו קשר. אם חלבון בא במגע עם הטיפ בתחילה, זה ששולפים, נמדד המעקב התגלגלות בכוח נגד העקירה. המצע ואז מובאת בחזרה במגע עם הטיפ, עקבות מרגיעה נמדד איפה קיפול חלבונים יכול להיקבע מתוך העקירה כוח.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM Specimen Discs, 15mm diameter</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>16218</td>
			<td>Serve as base for glass substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>26024</td>
			<td>serve as glass substrate and base for gold coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Tabs</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>16079</td>
			<td>Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STD Multimode head assembly</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>1B75C</td>
			<td>AFM head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass probe holder</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>MTFML-V2</td>
			<td>Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlever AFM probes</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM probes with Au coated tips</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>OBL-10</td>
			<td>Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6259</td>
			<td>Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LISA Linear Piezo Stage Actuators</td>
			<td>Physik Instrumente LP</td>
			<td>P-753.11C</td>
			<td>Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Piezo Stage</td>
			<td>Physik Instrumente LP</td>
			<td>P-541.2CD</td>
			<td>Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

force spectroscopy of single protein molecules using an atomic force microscope

הקביעה של תהליך קיפול חלבונים מרצף חומצות אמיניות שלהם למבנה תלת-ממד מקורי שלהם היא בעיה חשוב בביולוגיה. מיקרוסקופ כוח אטומי (AFM) ניתן לפתור בעיה זו על-ידי הפעלת מתיחה והרפיה של מולקולות חלבון יחיד, אשר נותן עדות ישירה של התגלגלות, refolding מאפיינים ספציפיים. מבוסס AFM מולקולה בודדת כוח-ספקטרוסקופיה (AFM-SMFS) מספק אמצעים למדוד באופן עקבי הייצורים החיים אנרגיה גבוהה בחלבונים אשר אינן אפשריות במדידות (ביוכימית) בצובר מסורתי. למרות מספר רב של מאמרים פורסמו כדי להציג את העקרונות של AFM-SMFS, זה לא קל לערוך ניסויים SMFS בשל העדר פרוטוקול ומגובה מלאה. במחקר זה, אנו להמחיש בקצרה את העקרונות של AFM, פירוט בהרחבה את הפרוטוקולים, נהלים, ניתוח נתונים כקו מנחה כדי להשיג תוצאות טובות מן הניסויים SMFS. נדגים נציג SMFS תוצאות מדידות התגלגלות מכני חלבון יחיד, אנו מספקים פתרון בעיות אסטרטגיות עבור כמה נפוץ נתקל בבעיות.

תוצאות נציג של פרוטוקול זה מוצגים באיור2. שני לוחות הצג נציג חיל-סיומת עקומות של חלבונים. העליון מציג תוצאות polyprotein I91, בעוד החלק התחתון מציג את החלבון I91 איגוף חלבון-של-עניין, מולקולת10ג ני. הקלטות אלו הראו את כוחם אופייני של I91 (200 pN) מתאר תוספת אורך (28 ננ...

Watch this Scientific Journal Video about Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope at JoVE.com

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

כוח ספקטרוסקופיה של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

אנו מתארים את הליכים מפורטים על מנת למדוד את תכונות מכניות מסלולים מכני התגלגלות של מולקולות חלבון יחיד באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. אנו גם מראים תוצאות נציג כנקודת התייחסות הבחירה ואת ההצדקה של הקלטות מולקולת חלבון אחד טוב.

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

ספקטרוסקופיית כוח של מולקולה אחת יכולה לספק תובנות עצומות על ביולוגיה מולקולרית בקנה מידה אטומי בכך שהיא מאפשרת לנו לתפעל מולקולות בודדות בכוח. כאן אנו מדגימים מדידת מהירות מתמדת באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. בסופו של דבר אנו יכולים להשתמש בנתונים כדי לקבוע את יציבות החלבון, קצב ההתגלות והמסלול המתפתח.כדי להתחיל את ההליך, צרף לשונית דבק לא מוליך לדיסק ברזל נקי ברוחב 15 מ"מ. הסר את עמוד השער ולחץ בחוזקה על מגלשת זכוכית נקייה, לא מצופה או מצופה זהב על ההיצמדות החשופה. אחסן את המגלשה בצלחת פטרי נקייה ומכסה.לאחר מכן, לרכז את פוליפרוטאין מטוהרים במסנן צנטריפוגלי, ולאחר מכן להפוך את העמודה ולחמק החלבון לתוך המאגר כדי לשמש בניסוי. לקבוע את ריכוז החלבון המתאים בהתבסס על הספיגה ב 280 ננומטר, ולאחר מכן להכין 100 microliters של 100 מיקרוגרם לכל פתרון מיליליטר של החלבון. יש למרוח טיפה של 60 מיקרוליטר של תותר החלבון על מרכז השקופית.יש לדאוג לא לתת את הנוזל להחליק בין השקופית דיסק הברזל, כמו זה יוביל תנועות מדגם בלתי מבוקרת במהלך הניסוי. תן את המדגם לשבת בטמפרטורת החדר לפחות 10 דקות. ראשית, בזהירות להרים את cantilever עד הסוף ולמקום אותו בתא החזקת החללית.ודא כי cantilever הוא יושב היטב. ואז למקם את תא המעצר בראש AFM. הגדר את הראש על שלב מיקרוסקופ הפוך וחבר ערכת סוללות לראש AFM כדי להפעיל את הלייזר.הגדר מצלמה עבור גלאי המיקרוסקופ כדי להמחיש את אור הלייזר בצג או במסך טלוויזיה. מונחה על ידי המיקרוסקופ, למקם את הלייזר, כך שהוא מופנה על קצה cantilever. ברגע שהדגימה מוכנה, יש לשטוף 10 מיקרוליטרים של מאגר הניסויים לכל יציאה של תא המעצר של הגשוש.Decant כ 40 microliters של נוזלים מן השקופית מדגם ולהוסיף 40 microliters של חיץ. בינתיים, התחילו להכין את מיקרוסקופ הכוח האטומי למדידה. ראשית, מניחים את המגלשה על המגנט מעל מנוע הפיזו.אשר כי שלב AFM הוא בעמדה מוגבהת, ולאחר מכן למקם את ראש AFM על הבמה עם cantilever מעל טיפת המדגם. לאחר מכן, מניחים פיסת נייר קטנה מול פוטודיודה AFM. כוונן את הלייזר עד שהנקודה על הנייר בהירה וממוקדת ולאחר מכן הסר את הנייר.הפעל את תוכנת AFM כדי להציג את האות מהפוטודיודה. כוונן את מראה ראש ה-AFM כך שאות הלייזר יוגדל בכל ארבעת הרבעים הפוטודיודים, ואות שונה בין זוגות הרבע העליון והתחתון הוא אפס. כדי להתחיל לכייל את ה- AFM, סובב את הגדרת המסנן עבור אות ראש ה- AFM ורוחב פס מלא וודא שה-piezo כבוי.בתוכנת AFM, למדוד את הממוצע של 512 חישובים של ספקטרום החשמל, עם 1, 024 נקודות נתונים לכל חישוב. שלב את צפיפות ספקטרלית הכוח על פני הפסגה הראשונה, אשר תואמת את המצב העיקרי של רטט עבור cantilever. לאחר מכן, הפעל את בקר הפיזו והגדר את המסנן ל- 500 הרץ.הזיזו במהירות את ראש ה-AFM כמה מאות מיקרומטרים תוך ניטור האות השונה. המשך להזיז את הראש למטה כמה מאות מיקרומטרים בכל פעם תוך צפייה בקפיצות עקביות באות השונה. כאשר קפיצות האות מתחילות לעלות בגובה, הקצה קרוב מאוד למשטח המדגם.לאחר אות ההטיה רווי על מגע קצה עם פני השטח, להרים את הראש מעט, ולאחר מכן להתאים את מתח פיזו כדי להזיז את ראש AFM למעלה או למטה על ידי 100 כדי 5, 000 ננומטר כדי למצוא את משטח המדגם. לאחר מכן, לבצע ניסוי משיכה עם גודל סריקה של כ 500 ננומטר, כך הקצה יוצר קשר עם פני השטח, או כ 100 ננומטר של נסיעה מוטורית פיזו. השתמש בתוצאות כדי לחשב את קבוע האביב ואת הרגישות.בתוכנה, הגדר את גודל הסריקה ל- 40% גדול יותר מהגודל התיאורטי הכולל של הפוליפרוטאין המתפתח. מקם את ה- cantilever כך שהוא יהיה 80% מגודל הסריקה הרחק מפני השטח. הגדר את מהירות הסריקה ל-300 ננומטר לשנייה.בצע ניסוי משיכה ולמדוד את מיקום פיזו וכתוצאה מכך ואת אות photodiode. הוסף מאגר ניסוי לתא הנוזלי מדי שעה לאורך המדידה כדי למנוע מהדגימה להתייבש. האירועים שהתרחשו בהקלטות של פוליפרוטאין I91 ופוליפרוטאין שבו שלושה תחומי I91 מאגפים את מולקולת NI10C מכל צד, צוידו במודל שרשרת דמוי תולעת.שתי ההקלטות מציגות את הכוח האופייני ואת אורך קווי המתאר של I91, מה שמצביע על כך כי כיול AFM היה מוצלח. ההקלטות של הפוליפרוטאין המכיל את מולקולת N110C הראו מספיק אירועי I91 כדי לאשר כי האירועים החדשים היו מחלבון העניין המתפתח. אורך קווי המתאר הממוצע לחזרת האנקירין היה כ-10.5 ננומטר, והכוחות שהתפתחו היו בין שמונה ל-25 פיקונוטון.זה חיוני כדי להשתמש פוליפרוטאין כי האירועים המתפתחים של חלבוני האגף לספק שליטה חיובית טביעת אצבע האירוע מולקולה אחת. בלי זה, הנתונים עלולים להפוך את ההתגנות השגויה.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Visualizing Cells, Tissues, and Molecules

SCIENTISTS IN ACTION

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

מחקרים מבניים אטומי בקנה מידה של הרכבות Macromolecular על ידי תהודה מגנטית גרעינית solid-state ספקטרוסקופיה

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

לכידת את האינטראקציה קינטיקה החלבון תעלת יונים עם מולקולות קטנות על ידי וזמינותו אינטרפרומטריה ביו-שכבה

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Assay ספקטרוסקופיה התנודות זריחה של אינטראקציות חלבון-חלבון באנשי קשר תא-תא

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של נוקליאוזומים באמצעות הדמיה מיקרוסקופ כוח אטומי

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

הדמיה של שלפוחיות ומסחטות על ידי מיקרוסקופ כוח אטומי

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

מיקרוסקופ מעקב חד-מולקולה-כלי לקביעת המדינות התפוצבניות של מולקולות ציטוסולג

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

ספקטרוסקופיה לספיגה אטומית כדי למדוד בריכות אבץ תאיים בתאי מיונקים

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

הערכה של אינטראקציות חלבונים-חלבונים באמצעות טכניקת העיכול האנטי-ממברנה

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

אפיון מצרפים לחלבונים בודדים ע י ננו-ספקטרוסקופיה אינפרא-אדום ומיקרוסקופ כוח אטומי

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...