Name: force spectroscopy of single protein molecules using an atomic force microscope
Uploaded: 2019-02-28T12:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation sovvenzioni MCB-1244297 e MCB-1517245 a PEM.

1. proteina preparazione
<ol><li>Clonazione del DNA.<ol>
<li>Sintetizzare una sequenza di DNA di interesse, ad esempio, la sequenza di DNA di NI10C10, o isolare tramite PCR da organismo ospite utilizzando tecniche di biologia molecolare standard11. Fiancheggiano il gene di interesse con siti di restrizione durante la sintesi o inserendo siti in 5'-fine degli iniettori PCR di corrispondere a un modulo in pEMI91 il plasmide (Addgene #74888)<sup class="xr...

<ol>
	<li>Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+Unfolding+of+Individual+Titin+Immunoglobulin+Domains+by+AFM.">Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM.</a> Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).</li><li>Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+protein+mechanics+with+the+atomic+force+microscope.">The study of protein mechanics with the atomic force microscope.</a> Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).</li><li>Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+studies+of+protein+folding+by+atomic+force+microscopy(AFM).">Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM).</a> Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).</li><li>Rico, F., Chu, C., Moy, V. T., Braga, P. C., Ricci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology. 736, 331-353 (2011).</li><li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology.">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).</li><li>Lv, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+biomaterials+to+mimic+the+mechanical+properties+of+muscles.">Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles.</a> Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanics+of+Streptavidin+Hubs+for+Molecular+Materials.">Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials.</a> Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).</li><li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Adhesive+Hydrogels+from+Intrinsically+Unstructured+Proteins.">Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins.</a> Advanced Materials. , (2017).</li><li>Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+unfolding+of+titin+under+force-clamp+atomic+force+microscopy.">Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).</li><li>Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+Mechanical+Unfolding+Pathway+of+a+Large+Protein+with+Coiled-Coil+Probes.">Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).</li><li>Davis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in molecular biology. , (2012).</li><li>Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular,+Non-Degenerate+Polyprotein+Scaffold+for+Atomic+Force+Spectroscopy.">A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy.</a> Biomacromolecules. , (2016).</li><li>Scholl, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , (2016).</li><li>Pawlak, K., Strzelecki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopuller-open+data+acquisition+platform+for+AFM+force+spectroscopy+experiments.">Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments.</a> Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).</li><li>. Nanopuller Available from: <a target="_blank" href="https://sourceforge.net/projects/nanopuller/">https://sourceforge.net/projects/nanopuller/</a> (2018)</li><li>Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+single+molecule+force+spectroscopy+through+automated+real-time+data+collection+and+quantification+of+experimental+conditions.">Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions.</a> Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).</li><li>Bouchiat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+persistence+length+of+a+worm-like+chain+molecule+from+force-extension+measurements.">Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements.</a> Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).</li><li>Su, T., Purohit, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+forced+unfolding+of+proteins.">Mechanics of forced unfolding of proteins.</a> Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).</li><li>Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+cloning+system+for+construction+of+multimeric+proteins+for+use+in+atomic+force+microscopy.">Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy.</a> Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).</li><li>Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular,+Nondegenerate+Polyprotein+Scaffolds+for+Atomic+Force+Spectroscopy.">Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy.</a> Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).</li><li>Hoffmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Robust+Polyprotein+Production+Facilitates+Single-Molecule+Mechanical+Characterization+of+&#946;-Barrel+Assembly+Machinery+Polypeptide+Transport+Associated+Domains.">Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of &#946;-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains.</a> ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).</li><li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory,+analysis,+and+interpretation+of+single-molecule+force+spectroscopy+experiments.">Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).</li><li>Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Halotag+Tethers+to+Study+Titin+Folding+at+the+Single+Molecule+Level.">Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level.</a> Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).</li><li>Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+dynamics+in+the+unfolding+of+individual+bacteriorhodopsin+proteins.">Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins.</a> Science. 355 (6328), 945-950 (2017).</li><li>Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+force+spectroscopy+unfolds+titin+at+the+velocity+of+molecular+dynamics+simulations.">High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations.</a> Science. 342 (6159), 741-743 (2013).</li><li>He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+protein+conformations+by+single-molecule+AFM-FRET+nanoscopy.">Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy.</a> ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).</li><li>Fotiadis, D., Scheuring, S., M&#252;ller, S. A., Engel, A., M&#252;ller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+manipulation+of+biological+structures+with+the+AFM.">Imaging and manipulation of biological structures with the AFM.</a> Micron. 33 (4), 385-397 (2002).</li><li>Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Spectroscopy+with+9-&#956;s+Resolution+and+Sub-pN+Stability+by+Tailoring+AFM+Cantilever+Geometry.">Force Spectroscopy with 9-&#956;s Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry.</a> Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).</li><li>Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+kinetics+from+single-molecule+force+spectroscopy:+Nanopore+unzipping+of+DNA+hairpins.">Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins.</a> Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).</li><li>Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+Force+Spectroscopy+Reveals+the+Calcium+Dependence+of+the+Alternative+Conformations+in+the+Native+State+of+a+&#946;&#947;-Crystallin+Protein.">Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a &#946;&#947;-Crystallin Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).</li></ol>

Un passo fondamentale nel protocollo è l'utilizzo di una poliproteina, descritto al punto 1.1.2, che serve come controllo positivo a singola molecola eventi "impronte digitali". In genere, ci deve svolgersi eventi delle proteine poliproteina (per I91, ciò significa una forza spiegamento di incremento di lunghezza circa 200 pN e contorno di circa 28 nm) a concludere in modo inequivocabile che la proteina di interesse è stata spiegata. Ad esempio, quando la proteina di interesse è affiancata da tre I91 domini da entram...

Gli avanzamenti nella spettroscopia di forza di singola molecola (SMF) mediante AFM hanno permesso la manipolazione meccanica e precisa caratterizzazione di singole molecole proteiche. Questa caratterizzazione ha prodotto nuove conoscenze su proteina meccanica1,2, proteina pieghevole3, di interazioni proteina-ligando4, di interazioni proteina-proteina5, e su base proteica ingegnerizzati materiali6,7,8. SMF sono particolarmente utile per lo studio di proteine sta svolgendo, come lo stretching di AFM permette i legami chimici e fisici all'interno della molecola di proteina di estendere gradualmente secondo la loro rigidità, che dà origine ad una lunghezza di contorno continuamente crescente. Questo overstretching di una molecola di proteina può produrre una transizione brusca della curva forza-estensione con conseguente in un evento di rottura (o forza di picco). Il picco di forza dà informazioni dirette sul cambiamento spiegamento di forza e strutturali della proteina durante il processo di distensione meccanico. Uno dei primi studi utilizzando AFM misurato titin1 e trovato nuovi aspetti della proteina dispiegamento e ripiegamento in condizioni fisiologiche, senza l'uso di denaturanti innaturali come prodotti chimici concentrati o temperature estreme.
Anche se qui consideriamo solo l'AFM, una varietà di strumenti, vengono condotti esperimenti di SMF. L'AFM è composto da quattro elementi principali: la sonda, il rivelatore, il portacampioni e lo scanner piezoelettrico. La sonda è una punta forte sull'estremità di oscillazione libera di un cantilever. Dopo la calibrazione, flessione del cantilever durante l'allungamento di una molecola associata viene misurata utilizzando un raggio laser che viene riflessa dalla parte posteriore del cantilever per determinare con precisione le forze usando la legge di Hooke. I progetti del fascio laser riflessa in un rivelatore di fotodiodo del quadrante che produce una tensione in proporzione lo spostamento del raggio laser dal centro del diodo. Il substrato con il campione della proteina nel liquido è montato su un palcoscenico piezoelettrico 3D che può essere controllato con precisione sub-nanometrica. Un computer legge la tensione dai rivelatori fotodiodo e controlla la fase 3D attraverso un rifornimento di tensione controllati dal computer. Queste fasi di azionatore piezo sono solitamente dotate di capacitivo o estensimetri sensori di posizione di precisamente lo spostamento di piezo-elettrico di misura e di isteresi corretta attraverso il sistema di controllo retroazionato. L'uscita di segnale del sensore dal controller di piezo è convertito in distanza utilizzando la costante tensione di piezo che è calibrato in fabbrica. Una curva di forza-estensione di esempio da un esperimento di trazione è illustrata nella Figura 2.
Ci sono due tipi di esperimenti di AFM-SMF: velocità costante e costante forza tirando misurazioni. Misurazioni di forza costante SMF sono descritti in Oberhauser et al. 9, mentre qui ci concentriamo sulle misurazioni di velocità costante. Un tipico esperimento di trazione omocinetico AFM avviene fornendo tensione a un piezo per spostare delicatamente un substrato rispetto una punta a sbalzo. Un tipico esperimento ha la punta inizialmente premendo contro la superficie. La misurazione di trazione è cominciata spostando il substrato distanza dalla punta per portare fuori contatto. Se una proteina entra in contatto con la punta inizialmente, esso sarà tirato e la traccia di spiegamento della forza contro lo spostamento sarà misurata. Il substrato allora è portato di nuovo in contatto con la punta e una traccia rilassante è misurata dove piegatura della proteina può essere determinato dallo spostamento di forza.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM Specimen Discs, 15mm diameter</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>16218</td>
			<td>Serve as base for glass substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>26024</td>
			<td>serve as glass substrate and base for gold coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Tabs</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>16079</td>
			<td>Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STD Multimode head assembly</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>1B75C</td>
			<td>AFM head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass probe holder</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>MTFML-V2</td>
			<td>Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlever AFM probes</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM probes with Au coated tips</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>OBL-10</td>
			<td>Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6259</td>
			<td>Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LISA Linear Piezo Stage Actuators</td>
			<td>Physik Instrumente LP</td>
			<td>P-753.11C</td>
			<td>Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Piezo Stage</td>
			<td>Physik Instrumente LP</td>
			<td>P-541.2CD</td>
			<td>Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

force spectroscopy of single protein molecules using an atomic force microscope

La determinazione del processo di folding delle proteine da loro sequenza dell'amminoacido alla loro struttura 3D nativo è un problema importante nella biologia. Microscopia a forza atomica (AFM) può risolvere questo problema, consentendo di stretching e rilassamento delle singole molecole proteiche, che dà prova diretta di specifici dispiegamento e ripiegamento caratteristiche. AFM-base singola molecola-spettroscopia della forza (AFM-SMF) fornisce un mezzo per misurare costantemente conformazioni ad alta energia in proteine che non sono possibili nelle misurazioni (biochimica) tradizionale alla rinfusa. Sebbene numerosi lavori sono stati pubblicati per mostrare i principi di AFM-SMF, non è facile per condurre esperimenti di SMF a causa della mancanza di un protocollo esaustivamente completo. In questo studio, abbiamo brevemente illustrare i principi di AFM e dettaglio estesamente i protocolli, procedure e analisi dei dati come linee guida per ottenere buoni risultati dagli esperimenti di SMF. Dimostriamo risultati rappresentativi di SMF di misure svolgimento meccaniche singole proteine e forniamo troubleshooting strategie per alcuni comunemente incontrato problemi.

Risultati rappresentativi da questo protocollo sono mostrati nella Figura 2. Entrambi i pannelli mostrano curve di forza-estensione rappresentativi da proteine. La parte superiore mostra i risultati da una poliproteina I91, mentre la parte inferiore mostra la proteina I91 che fiancheggiano una proteina di interesse, la molecola di10C NI. Queste registrazioni mostrano la forza caratteristica di I91 (200 pN) e contorno di incremento di lunghezza (28 ...

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Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Spettroscopia della forza delle singole molecole proteiche utilizzando un microscopio a forza atomica

Descriviamo le procedure dettagliate e le strategie per misurare le proprietà meccaniche e percorsi meccanici spiegamento di singole molecole proteiche utilizzando un microscopio a forza atomica. Mostriamo anche risultati rappresentativi come riferimento per la selezione e giustificazione delle registrazioni di buona singola proteina molecola.

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

La spettroscopia di forza a singola molecola può fornire enormi intuizioni sulla biologia molecolare su scala atomica permettendoci di manipolare singole molecole con la forza. Qui, dimostriamo una misurazione della velocità costante usando il microscopio a forza atomica. Alla fine possiamo usare i dati per determinare la stabilità proteica, il tasso di spiegamento e il percorso di dispiegamento.Per iniziare la procedura, collegare una linguetta adesiva non conduttiva a un disco di ferro pulito largo 15 millimetri. Rimuovere il foglio di copertura e premere con fermezza uno scivolo di vetro pulito, non rivestito o rivestito in oro sull'adesivo esposto. Conservare lo scivolo in una piastra di Petri pulita e coperta.Quindi, concentrare la poliproteina purificata in un filtro centrifugo, quindi invertire la colonna ed elutare la proteina nel tampone da utilizzare nell'esperimento. Determinare la concentrazione proteica appropriata in base all'assorbanza a 280 nanometri, quindi preparare 100 microlitri di una soluzione di 100 microgrammi per millilitro della proteina. Applicare una goccia di 60 microliter della soluzione proteica al centro dello scivolo.Fare attenzione a non lasciare che il liquido scivoli tra lo scivolo e il disco di ferro, in quanto ciò porterà a movimenti incontrollati del campione durante l'esperimento. Lasciare riposare il campione a temperatura ambiente per almeno 10 minuti. In primo luogo, raccogliere attentamente il sbalzino entro la fine e posizionarlo nella cella di tenuta della sonda.Assicurarsi che il cantilever sia saldamente seduto. Quindi posizionare la cella di tenuta nella testa AFM. Impostare la testa su uno stadio di microscopio invertito e collegare un pacco batteria alla testa AFM per alimentare il laser.Impostare una fotocamera per il rilevatore di microscopio per visualizzare la luce laser su un monitor o uno schermo TV. Guidati dal microscopio, posizionare il laser in modo che sia diretto sulla punta a sbalzi. Una volta che il campione è pronto, sciacquare 10 microlitri del buffer dell'esperimento in ogni porta della cella di attesa della sonda.Decantare circa 40 microlitri di fluido dallo scivolo del campione e aggiungere 40 microlitri di tampone. Nel frattempo, inizia a preparare il microscopio a forza atomica per la misurazione. Per prima cosa, posizionare lo scivolo sul magnete sopra il motore piezo.Verificare che lo stadio AFM sia in posizione elevata, quindi posizionare la testa AFM sul palco con il sbalzino sopra la goccia campione. Quindi, posizionare un piccolo pezzo di carta di fronte al fotodiodo AFM. Regolare il laser fino a quando il punto sulla carta è luminoso e focalizzato, quindi rimuovere la carta.Avviare il software AFM per visualizzare il segnale dal fotodiodo. Regolare lo specchio della testa AFM in modo che il segnale laser sia massimizzato in tutti e quattro i quadranti fotodiodi e un segnale diverso tra le coppie di quadranti superiore e inferiore sia zero. Per iniziare a calibrare l'AFM, ruotare l'impostazione del filtro per il segnale della testa AFM a larghezza di banda completa e assicurarsi che il piezo sia spento.Nel software AFM, misurare la media di 512 calcoli dello spettro di potenza, con 1.024 punti dati per calcolo. Integrare la densità spettrale di potenza attraverso il primo picco, che corrisponde alla principale modalità di vibrazione per il cantilever. Quindi, accendere il controller piezo e impostare il filtro su 500 Hertz.Spostare rapidamente la testa AFM verso il basso di alcune centinaia di micrometri monitorando il diverso segnale. Continua a muovere la testa verso il basso di alcune centinaia di micrometri alla volta mentre guardi salti coerenti nel diverso segnale. Quando i salti del segnale iniziano ad aumentare in altezza, la punta è molto vicina alla superficie del campione.Una volta che il segnale di deflessione si satura al contatto della punta con la superficie, sollevare leggermente la testa, quindi regolare la tensione piezo per spostare la testa AFM verso l'alto o verso il basso di 100-5.000 nanometri per trovare la superficie del campione. Successivamente, condurre un esperimento di trazione con una dimensione di scansione di circa 500 nanometri in modo che la punta contatti la superficie, o circa 100 nanometri di corsa del motore piezo. Utilizzare i risultati per calcolare la costante e la sensibilità della molla.Nel software, impostare la dimensione della scansione su 40% più grande della dimensione teorica totale della poliproteina in corso. Posizionare il sbalzino in modo che sia l'80% della dimensione della scansione lontano dalla superficie. Impostare la velocità di scansione su 300 nanometri al secondo.Eseguire un esperimento di trazione e misurare la posizione del piezo risultante e il segnale del fotodiodo. Aggiungere il buffer dell'esperimento alla cella del fluido ogni ora durante la misurazione per evitare che il campione si asciughi. Gli eventi in corso nelle registrazioni di una poliproteina I91 e di una poliproteina in cui tre domini I91 fiancheggiavano la molecola NI10C su ciascun lato, erano dotati di un modello a catena simile a un verme.Entrambe le registrazioni mostrano gli incrementi caratteristici della forza e della lunghezza del contorno di I91, indicando che la calibrazione AFM ha avuto successo. Le registrazioni della poliproteina contenente la molecola N110C mostrarono abbastanza eventi I91 da confermare che i nuovi eventi provengono dalla proteina di interesse che si svolge. La lunghezza media del contorno per la ripetizione dell'anchirina era di circa 10,5 nanometri, e le forze dispiegate erano tra gli otto e i 25 piconewton.È essenziale usare una poliproteina perché gli eventi di dispiegamento delle proteine di fianco forniscono un controllo positivo per rilevare l'impronta digitale dell'evento della singola molecola. In caso di ciò, i dati sono suscettibili di interpretazione errata.

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The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Immobilizzazione covalente di proteine per la spettroscopia di forza di singola molecola

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Un'analisi di spettroscopia di fluorescenza fluttuazione delle interazioni proteina-proteina a contatti cellula-cellula

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

La struttura e la dinamica dei nucleosomi usando la formazione immagine di microscopia di forza atomica di sondaggio

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Imaging delle vescibole extracellulari mediante microscopia a forza atomica

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Microscopia di tracciamento a singola molecola - Uno strumento per determinare gli stati diffusivi delle molecole citosoliche

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Spettroscopia di assorbanza atomica per misurare le piscine di zinco intracellulare nelle cellule di mammifero

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Valutazione delle interazioni tra proteine e proteine utilizzando una tecnica di digestione On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Caratterizzazione degli aggregati proteici individuali mediante nanospettroscopia a infrarossi e microscopia a forza atomica

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...