Name: force spectroscopy of single protein molecules using an atomic force microscope
Uploaded: 2019-02-28T12:30:00
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이 작품은 국립 과학 재단 교부 금 인 m c B-1244297 및 MCB-1517245 PEM에 의해 지원 되었다.

1. 단백질 준비
<ol><li>DNA 복제입니다.<ol>
<li>관심, NI10C10, 예를 들어 DNA 시퀀스의 DNA 순서를 합성 하거나 통해 PCR 표준 분자 생물학 기법11를 사용 하 여 호스트 유기 체에서 분리 합니다. 합성 또는 5'-끝 (Addgene #74888)12에 플라스 미드 pEMI91 모듈에 해당 하는 PCR 뇌관의에 사이트를 배치 하 여 금지 사이트와 관심사의 유전자를 측면....

<ol>
	<li>Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+Unfolding+of+Individual+Titin+Immunoglobulin+Domains+by+AFM.">Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM.</a> Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).</li><li>Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+protein+mechanics+with+the+atomic+force+microscope.">The study of protein mechanics with the atomic force microscope.</a> Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).</li><li>Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+studies+of+protein+folding+by+atomic+force+microscopy(AFM).">Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM).</a> Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).</li><li>Rico, F., Chu, C., Moy, V. T., Braga, P. C., Ricci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology. 736, 331-353 (2011).</li><li>Muller, D. J., Dufrene, Y. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Adhesive+Hydrogels+from+Intrinsically+Unstructured+Proteins.">Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins.</a> Advanced Materials. , (2017).</li><li>Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+unfolding+of+titin+under+force-clamp+atomic+force+microscopy.">Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).</li><li>Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+Mechanical+Unfolding+Pathway+of+a+Large+Protein+with+Coiled-Coil+Probes.">Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).</li><li>Davis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in molecular biology. , (2012).</li><li>Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular,+Non-Degenerate+Polyprotein+Scaffold+for+Atomic+Force+Spectroscopy.">A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy.</a> Biomacromolecules. , (2016).</li><li>Scholl, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , (2016).</li><li>Pawlak, K., Strzelecki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopuller-open+data+acquisition+platform+for+AFM+force+spectroscopy+experiments.">Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments.</a> Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).</li><li>. Nanopuller Available from: <a target="_blank" href="https://sourceforge.net/projects/nanopuller/">https://sourceforge.net/projects/nanopuller/</a> (2018)</li><li>Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+single+molecule+force+spectroscopy+through+automated+real-time+data+collection+and+quantification+of+experimental+conditions.">Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions.</a> Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).</li><li>Bouchiat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+persistence+length+of+a+worm-like+chain+molecule+from+force-extension+measurements.">Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements.</a> Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).</li><li>Su, T., Purohit, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+forced+unfolding+of+proteins.">Mechanics of forced unfolding of proteins.</a> Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).</li><li>Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+cloning+system+for+construction+of+multimeric+proteins+for+use+in+atomic+force+microscopy.">Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy.</a> Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).</li><li>Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular,+Nondegenerate+Polyprotein+Scaffolds+for+Atomic+Force+Spectroscopy.">Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy.</a> Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).</li><li>Hoffmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Robust+Polyprotein+Production+Facilitates+Single-Molecule+Mechanical+Characterization+of+&#946;-Barrel+Assembly+Machinery+Polypeptide+Transport+Associated+Domains.">Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of &#946;-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains.</a> ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).</li><li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory,+analysis,+and+interpretation+of+single-molecule+force+spectroscopy+experiments.">Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).</li><li>Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Halotag+Tethers+to+Study+Titin+Folding+at+the+Single+Molecule+Level.">Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level.</a> Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).</li><li>Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+dynamics+in+the+unfolding+of+individual+bacteriorhodopsin+proteins.">Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins.</a> Science. 355 (6328), 945-950 (2017).</li><li>Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+force+spectroscopy+unfolds+titin+at+the+velocity+of+molecular+dynamics+simulations.">High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations.</a> Science. 342 (6159), 741-743 (2013).</li><li>He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+protein+conformations+by+single-molecule+AFM-FRET+nanoscopy.">Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy.</a> ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).</li><li>Fotiadis, D., Scheuring, S., M&#252;ller, S. A., Engel, A., M&#252;ller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+manipulation+of+biological+structures+with+the+AFM.">Imaging and manipulation of biological structures with the AFM.</a> Micron. 33 (4), 385-397 (2002).</li><li>Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Spectroscopy+with+9-&#956;s+Resolution+and+Sub-pN+Stability+by+Tailoring+AFM+Cantilever+Geometry.">Force Spectroscopy with 9-&#956;s Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry.</a> Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).</li><li>Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+kinetics+from+single-molecule+force+spectroscopy:+Nanopore+unzipping+of+DNA+hairpins.">Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins.</a> Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).</li><li>Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+Force+Spectroscopy+Reveals+the+Calcium+Dependence+of+the+Alternative+Conformations+in+the+Native+State+of+a+&#946;&#947;-Crystallin+Protein.">Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a &#946;&#947;-Crystallin Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).</li></ol>

프로토콜에 중요 한 단계는 "지문" 단일 분자 이벤트를 긍정적인 통제 역할 단계 1.1.2에서에서 설명 하는 polyprotein의 사용 이다. 일반적으로, 거기 한다 밝혀지고 있을 polyprotein 단백질의 이벤트 (I91, 즉 약 28의 약 200 pN 및 윤곽선 길이 증가의 펼쳐진 힘 nm) 관심사의 단백질의 접힌 되었습니다는 명확 하 게 결론. 예를 들어 때 관심사의 단백질은 양쪽에서 3 개의 I91 도메인에 의해 형벌 이다, 다음 있?...

AFM에 의해 단일 분자 힘 분광학 (SMF)에 발전 기계 조작 및 단일 단백질 분자의 정확한 특성화를 활성화 했습니다. 이 특성화 단백질 기계1,2,3, 단백질-리간드 상호작용4, 단백질 단백질 상호 작용5, 접히는 단백질에 대 한 새로운 통찰력을 생산 하고있다 및 단백질 기반 설계 재료6,,78. SMF는 단백질을 공부 하는 데 특히 유용 수 있습니다 제공 하는 지속적으로 증가 윤곽선 길이를 상승 그들의 강성에 따라 점차적으로 확장 하는 단백질 분자 내의 화학 및 물리적 채권 AFM에 의해 기지개로 전개. 단백질 분자의이 잡아당기고 수 파열 이벤트의 결과로 힘 확장 곡선에서 갑작스러운 변환을 (또는 강제로 피크). 강제로 피크 기계적 전개 과정에서 단백질의 펼쳐 힘 및 구조 변화에 직접 정보를 제공합니다. AFM을 사용 하 여 첫 번째 연구 중 하나 titin1 을 측정 하 고 전개 하 고 집중된 화학 물질 또는 극단적인 온도 같은 부자연 스러운 denaturants의 사용 없이 생리 적인 조건 하에서 refolding 단백질의 새로운 측면을 발견.
여기 우리가 고려만 AFM SMF 실험 다양 한 악기에 수행 됩니다. AFM은 4 개의 주요 요소로 구성: 프로브, 검출기, 샘플 홀더 및 압 전 스캐너. 프로브는 캔틸레버의 중세 끝에 날카로운 끝 이다. 교정, 후 연결 된 분자의 스트레칭 하는 동안 캔틸레버의 휨 측정 된다 Hooke의 법률을 사용 하 여 힘을 정확 하 게 결정 하는 캔틸레버의 뒤쪽에서 반영 되는 레이저 빔을 사용 하 여. 레이저 빔 다이오드 센터에서의 변위에 비례하여 전압을 생성 하는 사분면 포토 다이오드 검출기에 반사 된 레이저 빔 프로젝트. 액체에 단백질 샘플 기판 하위 나노미터 정밀도로 제어할 수 있는 3 차원 압 전 단계에 거치 된다. 컴퓨터 포토 다이오드 감지기에서 전압을 읽는다 고 컴퓨터 제어 전압 공급을 통해 3D 단계를 제어 합니다. 이러한 압 전 액추에이터 단계는 일반적으로 장착 용량 성 또는 스트레인 게이지 위치 센서 정확 하 게 측정 압 전 변위 및 피드 백 제어 시스템을 통해 정확한 히스테리시스. 압 전 컨트롤러에서 센서 신호 출력은 공장에서 캘리브레이션 된 압 전 전압 상수를 사용 하 여 거리 변환 됩니다. 당기는 실험에서 예 힘 확장 곡선 그림 2에 표시 됩니다.
AFM SMF 실험의 두 가지 유형이 있다: 일정 한 속도 지속적인 힘 측정을 당기. 지속적인 힘 SMF 측정 Oberhauser 외 에 설명 되어 있습니다. 9, 여기 우리가 일정 속도 측정에 집중 하는 동안. 전형적인 AFM 상수 속도 당기 실험 기판 캔틸레버 끝에 상대적으로 부드럽게 이동 하는 압 전 전압을 제공 하 여 수행 됩니다. 전형적인 실험 표면에 대해 처음 누르면 팁이 있다. 당기 측정 접촉에서가지고 팁에서 기판으로 이동 하 여 시작 됩니다. 단백질 처음 팁의 접촉으로 온다, 당겨 질 것 이다 하 고 변위에 대 한 힘의 펼쳐진 추적 측정 됩니다. 기판은 다음 팁 접촉 돌아온 것 고 편안한 추적 어디 단백질 접기 결정 될 수 있다 힘 변위에서 측정 된다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM Specimen Discs, 15mm diameter</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>16218</td>
			<td>Serve as base for glass substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>26024</td>
			<td>serve as glass substrate and base for gold coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Tabs</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>16079</td>
			<td>Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STD Multimode head assembly</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>1B75C</td>
			<td>AFM head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass probe holder</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>MTFML-V2</td>
			<td>Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlever AFM probes</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM probes with Au coated tips</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>OBL-10</td>
			<td>Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6259</td>
			<td>Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LISA Linear Piezo Stage Actuators</td>
			<td>Physik Instrumente LP</td>
			<td>P-753.11C</td>
			<td>Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Piezo Stage</td>
			<td>Physik Instrumente LP</td>
			<td>P-541.2CD</td>
			<td>Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

force spectroscopy of single protein molecules using an atomic force microscope

그들의 네이티브 3D 구조에 그들의 아미노산 시퀀스 로부터 단백질의 접히는 과정의 결정은 생물학에 있는 중요 한 문제 이다. 원자 힘 현미경 (AFM) 스트레칭과 휴식 단일 단백질 분자의 특정 전개 및 refolding 특성의 직접 증거를 제공 함으로써이 문제를 해결할 수 있습니다. AFM 기반 단일-분자 힘-분광학 AFM-SMF () 일관 되 게 에너지 conformations 전통적인 대량 (생화학) 측정에 가능 하지 않은 단백질을 측정 하는 수단을 제공 합니다. 수많은 논문 AFM SMF의 원리를 보여주는에 게시 된, 하지만 그것은 철저 하 게 완전 한 프로토콜의 부족 때문에 SMF 실험을 실시 쉽지 않다. 이 연구에서 우리는 AFM의 원리를 간단히 설명 하 고 광범위 하 게 세부 프로토콜, 절차, 및 데이터 분석 SMF 실험에서 좋은 결과 달성 하는 지침. 단일 단백질 기계 펼쳐진 측정의 대표적인 SMF 결과 설명 하 고 우리가 제공 하는 문제가 발생 하는 일반적으로 몇 가지 문제 해결 전략.

이 프로토콜에서 대표적인 결과 그림 2에 표시 됩니다. 두 패널 단백질에서 대표적인 힘 확장 곡선을 표시합니다. 상단 하단 표시는 단백질--관심, NI10C 분자 측면 I91 단백질 I91 polyprotein에서 결과 표시 합니다. 이러한 녹음 표시 I91의 특성 힘 (200 pN) 윤곽선 길이 증가 (28 nm) 정렬 및 AFM의 교정 되었는지 나타냅니다. 이러한 힘 확장 곡선 다음 웜 ...

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Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자 힘 분광학

우리는 상세한 절차 및 전략 기계적 특성 및 기계적 전개 경로 원자 힘 현미경을 사용 하 여 단일 단백질 분자의 측정을 설명 합니다. 우리는 또한 선택과 좋은 단일 단백질 분자 기록의 정당성에 대 한 참조로 대표적인 결과 보여줍니다.

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

단일 분자 힘 분광법은 우리가 힘으로 단 하나 분자를 조작할 수 있게 함으로써 원자 규모의 분자 생물학에 대한 엄청난 통찰력을 제공할 수 있습니다. 여기서, 우리는 원자력 현미경을 사용하여 일정한 속도 측정을 보여줍니다. 우리는 궁극적으로 단백질 안정성, 전개 속도 및 전개 경로를 결정하기 위해 데이터를 사용할 수 있습니다.절차를 시작하려면 비전도성 접착제 탭을 15mm 너비의 깨끗한 철 디스크에 부착합니다. 커버 시트를 제거하고 깨끗하고 코팅되지 않은 유리 슬라이드를 노출된 접착제에 단단히 누릅니다. 깨끗하고 덮인 페트리 접시에 슬라이드를 보관합니다.다음으로, 정제된 다단백을 원심 필터에 농축한 다음 컬럼을 반전시키고 단백질을 실험에 사용되는 완충제로 엘류한다. 280 나노미터의 흡광도에 기초하여 적절한 단백질 농도를 결정한 다음 단백질의 밀리리터 용액당 100 마이크로그램의 100 마이크로리터를 준비합니다. 단백질 용액의 60 마이크로리터 드롭을 슬라이드 중앙에 적용합니다.이 실험 중에 제어되지 않은 샘플 움직임으로 이어질 것이기 때문에 액체가 슬라이드와 철 디스크 사이에 미끄러지지 않도록주의하십시오. 샘플이 실온에서 최소 10분 동안 앉게 하십시오. 먼저, 캔틸레버를 끝까지 조심스럽게 집어 들고 있는 프로브에 놓습니다.캔틸레버가 단단히 앉는지 확인합니다. 그런 다음 보유 셀을 AFM 헤드에 놓습니다. 반전 된 현미경 단계에 머리를 설정하고 레이저에 전원을 공급하기 위해 AFM 헤드에 배터리 팩을 연결합니다.모니터 또는 TV 화면에서 레이저 빛을 시각화하기 위해 현미경 검출기에 대한 카메라를 설정합니다. 현미경에 의해 유도, 그것은 캔틸레버 팁에 지시 되도록 레이저를 배치. 샘플이 준비되면 실험 버퍼10 마이크로리터를 프로브 홀딩 셀의 각 포트에 플러시합니다.샘플 슬라이드에서 약 40 마이크로리터의 유체를 데수하고 40 마이크로리터의 버퍼를 추가합니다. 한편, 측정을 위한 원자력 현미경을 준비하기 시작한다. 먼저, 슬라이드를 압착 모터 위에 놓습니다.AFM 스테이지가 높은 위치에 있는지 확인한 다음 샘플 액적 위에 캔틸레버를 사용하여 AFM 헤드를 무대에 배치합니다. 다음으로, AFM 포토다이오드 앞에 작은 종이를 놓습니다. 용지의 반점이 밝고 집중될 때까지 레이저를 조정한 다음 용지를 제거합니다.포토디오드에서 신호를 보려면 AFM 소프트웨어를 시작합니다. 4개의 포토다이오드 사분면에서 레이저 신호가 최대화되고 상단과 하단 사분면 쌍 사이의 다른 신호가 0이 되도록 AFM 헤드 미러를 조정합니다. AFM 보정을 시작하려면 AFM 헤드 신호의 필터 설정을 전체 대역폭으로 전환하고 압착이 꺼져 있는지 확인합니다.AFM 소프트웨어에서는 계산당 1, 024 데이터 포인트로 전력 스펙트럼의 평균 512 계산을 측정합니다. 캔틸레버의 주요 진동 모드에 해당하는 첫 번째 피크에 걸쳐 전력 스펙트럼 밀도를 통합합니다. 다음으로, 압전 컨트롤러를 켜고 필터를 500 Hertz로 설정합니다.다른 신호를 모니터링하는 동안 신속하게 AFM 헤드를 수백 마이크로미터 아래로 이동합니다. 다른 신호에서 일관된 점프를 보면서 한 번에 수백 마이크로미터 아래로 머리를 계속 움직입니다. 신호 점프가 높이가 증가하기 시작하면 팁이 샘플 표면에 매우 가깝습니다.변압 신호가 표면과의 팁 접촉 시 포화되면 머리를 약간 올린 다음 압전 전압을 조정하여 AFM 헤드를 100~ 5, 000 나노미터로 위아래로 이동하여 샘플 표면을 찾습니다. 그 후, 팁이 표면에 닿을 수 있도록 약 500 나노미터의 스캔 크기로 당기는 실험을 실시하거나 약 100 나노미터의 압조 모터 이동을 수행한다. 결과를 사용하여 스프링 상수 및 감도를 계산합니다.소프트웨어에서, 전개 폴리 단백의 총 이론적 크기보다 40 % 더 큰 스캔 크기를 설정합니다. 캔틸레버를 배치하여 스캔 크기의 80%가 표면에서 멀리 떨어져 있도록 합니다. 스캔 속도를 초당 300 나노미터로 설정합니다.당기는 실험을 수행하고 결과 압전 위치와 포토다이오드 신호를 측정합니다. 측정 전반에 걸쳐 시간당 유체 세포에 실험 버퍼를 추가하여 샘플이 건조되지 않도록 합니다. I91 폴리단백질과 3개의 I91 도메인이 양쪽에 NI10C 분자를 측면에 있는 다단백의 기록에서 전개되는 사건은 웜과 같은 체인 모델이 장착되었습니다.두 녹음 모두 I91의 특징적인 힘과 윤곽 길이 증가가 AFM 교정이 성공적이었음을 나타냅니다. N110C 분자를 포함하는 다단백의 기록은 새로운 사건이 전개관심의 단백질로부터 이었다는 것을 확인하기 위하여 충분한 I91 사건을 보여주었습니다. 안키린 반복의 평균 윤곽 길이는 약 10.5 나노미터였으며, 전개되는 힘은 8~25피코뉴턴 사이였다.측면 단백질의 전개 이벤트가 단일 분자 이벤트를 지문에 긍정적 인 제어를 제공하기 때문에 다단백을 사용하는 것이 필수적입니다. 이없이, 데이터는 오해에 대한 책임이 있습니다.

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Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

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생화학

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

바이오-레이어 간섭계 분석 결과 의해 작은 분자와 이온 채널 단백질의 상호 작용 활동을 캡처

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

단일 분자 힘 분광학에 대 한 단백질의 화학식 동원 정지

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

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Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

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원자력 현미경 검사법에 의한 세포 외 소포의 화상 진찰

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

단일 분자 추적 현미경 검사법 - 세포화 분자의 확산 상태를 결정하는 도구

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

포유류 세포에서 세포내 아연 풀을 측정 하는 원자 흡 광도 분광학

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

적외선 나노 스펙트로펙트 및 원자력 현미경으로 개별 단백질 응집체 특성화

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...