Name: force spectroscopy of single protein molecules using an atomic force microscope
Uploaded: 2019-02-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope at JoVE.com

Эта работа была поддержана Национальный научный фонд грантов MCB-1244297 и MCB-1517245 к PEM.

1. белка подготовка
<ol><li>Клонирование дна.<ol>
<li>Синтезировать последовательности ДНК интерес, например, последовательности ДНК NI10C10, или изолировать через PCR от организм хозяина, с использованием стандартных молекулярной биологии методы11. Пашина ге?...

<ol>
	<li>Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+Unfolding+of+Individual+Titin+Immunoglobulin+Domains+by+AFM.">Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM.</a> Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).</li><li>Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+protein+mechanics+with+the+atomic+force+microscope.">The study of protein mechanics with the atomic force microscope.</a> Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).</li><li>Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+studies+of+protein+folding+by+atomic+force+microscopy(AFM).">Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM).</a> Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).</li><li>Rico, F., Chu, C., Moy, V. T., Braga, P. C., Ricci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology. 736, 331-353 (2011).</li><li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology.">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).</li><li>Lv, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+biomaterials+to+mimic+the+mechanical+properties+of+muscles.">Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles.</a> Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanics+of+Streptavidin+Hubs+for+Molecular+Materials.">Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials.</a> Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).</li><li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Adhesive+Hydrogels+from+Intrinsically+Unstructured+Proteins.">Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins.</a> Advanced Materials. , (2017).</li><li>Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+unfolding+of+titin+under+force-clamp+atomic+force+microscopy.">Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).</li><li>Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+Mechanical+Unfolding+Pathway+of+a+Large+Protein+with+Coiled-Coil+Probes.">Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).</li><li>Davis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in molecular biology. , (2012).</li><li>Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular,+Non-Degenerate+Polyprotein+Scaffold+for+Atomic+Force+Spectroscopy.">A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy.</a> Biomacromolecules. , (2016).</li><li>Scholl, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , (2016).</li><li>Pawlak, K., Strzelecki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopuller-open+data+acquisition+platform+for+AFM+force+spectroscopy+experiments.">Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments.</a> Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).</li><li>. Nanopuller Available from: <a target="_blank" href="https://sourceforge.net/projects/nanopuller/">https://sourceforge.net/projects/nanopuller/</a> (2018)</li><li>Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+single+molecule+force+spectroscopy+through+automated+real-time+data+collection+and+quantification+of+experimental+conditions.">Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions.</a> Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).</li><li>Bouchiat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+persistence+length+of+a+worm-like+chain+molecule+from+force-extension+measurements.">Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements.</a> Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).</li><li>Su, T., Purohit, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+forced+unfolding+of+proteins.">Mechanics of forced unfolding of proteins.</a> Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).</li><li>Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+cloning+system+for+construction+of+multimeric+proteins+for+use+in+atomic+force+microscopy.">Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy.</a> Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).</li><li>Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular,+Nondegenerate+Polyprotein+Scaffolds+for+Atomic+Force+Spectroscopy.">Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy.</a> Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).</li><li>Hoffmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Robust+Polyprotein+Production+Facilitates+Single-Molecule+Mechanical+Characterization+of+&#946;-Barrel+Assembly+Machinery+Polypeptide+Transport+Associated+Domains.">Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of &#946;-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains.</a> ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).</li><li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory,+analysis,+and+interpretation+of+single-molecule+force+spectroscopy+experiments.">Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).</li><li>Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Halotag+Tethers+to+Study+Titin+Folding+at+the+Single+Molecule+Level.">Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level.</a> Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).</li><li>Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+dynamics+in+the+unfolding+of+individual+bacteriorhodopsin+proteins.">Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins.</a> Science. 355 (6328), 945-950 (2017).</li><li>Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+force+spectroscopy+unfolds+titin+at+the+velocity+of+molecular+dynamics+simulations.">High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations.</a> Science. 342 (6159), 741-743 (2013).</li><li>He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+protein+conformations+by+single-molecule+AFM-FRET+nanoscopy.">Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy.</a> ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).</li><li>Fotiadis, D., Scheuring, S., M&#252;ller, S. A., Engel, A., M&#252;ller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+manipulation+of+biological+structures+with+the+AFM.">Imaging and manipulation of biological structures with the AFM.</a> Micron. 33 (4), 385-397 (2002).</li><li>Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Spectroscopy+with+9-&#956;s+Resolution+and+Sub-pN+Stability+by+Tailoring+AFM+Cantilever+Geometry.">Force Spectroscopy with 9-&#956;s Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry.</a> Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).</li><li>Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+kinetics+from+single-molecule+force+spectroscopy:+Nanopore+unzipping+of+DNA+hairpins.">Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins.</a> Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).</li><li>Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+Force+Spectroscopy+Reveals+the+Calcium+Dependence+of+the+Alternative+Conformations+in+the+Native+State+of+a+&#946;&#947;-Crystallin+Protein.">Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a &#946;&#947;-Crystallin Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).</li></ol>

Важнейшим шагом в протоколе является использование polyprotein, описанный в шаге 1.1.2, который служит в качестве позитивного элемента управления «отпечатки пальцев» сингл молекула события. Как правило, должны разворачиваются события polyprotein белков (для I91, это означает разворачиваются силы ок...

Достижения в одной молекулы силой спектроскопии (SMF) на AFM позволили механические манипуляции и точная характеристика одного белковых молекул. Эта характеристика выпустила новые идеи о белка механики1,2, белка складной3, белок лиганд взаимодействия4, белок белковых взаимодействий5, и на основе белков инженерии материалы6,,78. Эти функции особенно полезны для изучения белков разворачивается, как растяжения, АСМ позволяет химических и физических связей внутри молекулы белка постепенно расширить согласно их жесткость, которая порождает постоянно растущего контурная длина. Этот распыления белковой молекулы могут производить резкий переход в кривой силы расширение, что приводит к разрыву событие (или силы пик). Пик сил дает прямую информацию о разворачивающихся силы и структурные изменения белка во время механической разворачивающегося процесса. Один из первых исследований с помощью AFM измеряется Титин1 и нашли новые аспекты белка разворачивается и складывая в физиологических условиях без использования неестественным denaturants как концентрированных химических веществ или экстремальных температур.
SMF-функции эксперименты проводятся на целый ряд инструментов, хотя здесь мы рассмотрим только AFM. AFM состоит из четырех основных элементов: зонд, детектор, держателя образца и пьезоэлектрические сканера. Зонд является острый кончик на самозванца конце кантилевера. После калибровки изгиба кантилевера при растяжении прилагаемый молекулы измеряется с помощью лазерного луча, который отражается от задней стороне кантилевера точно определить силы, используя закон Гука. Проекты отраженного лазерного луча в квадрант фотодиод детектор, который производит напряжения пропорционально перемещению лазерного луча из центра диода. Подложке, с образец протеина в жидкости монтируется на 3D пьезоэлектрический сцену, которая может управляться с суб нанометровой точностью. Компьютер считывает напряжение от детекторов фотодиод и контролирует 3D сцене через компьютерным управлением напряжения питания. Эти этапы привод piezo обычно оборудованы с емкостным или тензометрические датчики положения именно мера пьезо перемещения и правильно гистерезиса через систему обратной связи управления. Выходной сигнал датчика от контроллера пьезо преобразуется в расстоянии с помощью напряжения константа piezo который завод Калиброванный. Пример кривой силы расширение от потянув эксперимента показано на рисунке 2.
Существует два типа функций SMF AFM экспериментов: постоянная скорость и постоянной силой потянув измерений. Измерения постоянной силы SMF-функции описаны в Oberhauser и др. 9, хотя здесь мы сосредоточены на постоянной скорости измерения. Типичный AFM константа скорости потянув эксперимент осуществляется путем предоставления напряжения пьезо осторожно двигаться подложке относительно кончика консольный. Типичная эксперимент имеет наконечник, сначала нажав против поверхности. Вытягивая измерение начинается перемещение подложки от кончика довести из контакта. Если белок прикоснулась кончик изначально, он будет быть вытащил и разворачивается след силы против перемещения будет оцениваться. Субстрат затем возвращается контакт с кончика и расслабляющий след измеряется где сворачивания белка может быть определено из перемещения сил.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM Specimen Discs, 15mm diameter</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>16218</td>
			<td>Serve as base for glass substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>26024</td>
			<td>serve as glass substrate and base for gold coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Tabs</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>16079</td>
			<td>Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STD Multimode head assembly</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>1B75C</td>
			<td>AFM head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass probe holder</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>MTFML-V2</td>
			<td>Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlever AFM probes</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM probes with Au coated tips</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>OBL-10</td>
			<td>Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6259</td>
			<td>Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LISA Linear Piezo Stage Actuators</td>
			<td>Physik Instrumente LP</td>
			<td>P-753.11C</td>
			<td>Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Piezo Stage</td>
			<td>Physik Instrumente LP</td>
			<td>P-541.2CD</td>
			<td>Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

force spectroscopy of single protein molecules using an atomic force microscope

Определение процесса складывания белков от их аминокислотной последовательности в их родной 3D структура является важной проблемой в биологии. Атомно-силовой микроскопии (АСМ) могут решить эту проблему, позволяя растяжение и расслабление одного белковых молекул, которая дает прямых доказательств конкретные разворачивается и складывая характеристики. На базе AFM одной молекулы силой спектроскопии (AFM-SMF) предоставляет средства для последовательно измерения высокоэнергетических конформации в белки, которые не возможны в традиционных массовых (биохимические) измерений. Хотя многочисленные документы были опубликованы Показать принципы AFM-функций SMF, это не легко для проведения экспериментов SMF-функций из-за отсутствия исчерпывающе полной протокола. В этом исследовании мы кратко проиллюстрировать принципы AFM и широко подробно протоколов, процедур и анализ данных в качестве ориентира для достижения хороших результатов от экспериментов SMF-функции. Мы продемонстрировать представитель SMF-функций результаты одного белка механические разворачивается измерений и мы предоставляем стратегии устранения неполадок для некоторых часто возникающих проблем.

Представитель результаты от этого протокола показано на рисунке 2. Обе панели показывают кривых представитель сил продление от белков. Верхней показывает результаты от I91 polyprotein, а внизу показывает фланговые белка интересов, NI10C молекулы белка I91. ...

Watch this Scientific Journal Video about Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope at JoVE.com

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Спектроскопия силы одного белковых молекул с помощью атомно-силового микроскопа

Мы описываем подробных процедур и стратегий для измерения механических свойств и механических разворачивается пути единого белковых молекул с помощью атомно-силового микроскопа. Мы также показать представителя результаты как ссылку для выбора и обоснования хороший один белок молекулы записей.

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Одномекулярная силовая спектроскопия может дать огромное представление о молекулярной биологии в атомном масштабе, позволяя нам манипулировать одиночными молекулами силой. Здесь мы демонстрируем постоянное измерение скорости с помощью атомного силового микроскопа. В конечном счете, мы можем использовать данные для определения стабильности белка, скорости раскрытия и разворачивающегося пути.Чтобы начать процедуру, прикрепите непроводяную клеевую вкладку к чистому, шириной 15 миллиметров железному диску. Снимите крышку листа и твердо нажмите чистый, неокрашенный, или с золотым покрытием стеклянную горку на открытый клей. Храните слайд в чистой, покрытой чашкой Петри.Затем сконцентрируйте очищенный полипротеин в центробежном фильтре, затем переверните столбец и перевестите белок в буфер, который будет использоваться в эксперименте. Определите соответствующую концентрацию белка на основе поглощения на 280 нанометров, а затем приготовьте 100 микролитров 100 микрограмм на миллилитр раствора белка. Нанесите 60 микролитровую каплю белкового раствора на центр слайда.Позаботьтесь о том, чтобы жидкость не проскользнула между слайдом и железным диском, так как это приведет к неконтролируемым движениям образца во время эксперимента. Пусть образец сидит при комнатной температуре, по крайней мере 10 минут. Во-первых, тщательно подобрать кантилевер к концу и поместить его в ячейку зонда.Убедитесь, что кантилевер прочно сидит. Затем поместите камеру в голову AFM. Установите голову на перевернутой стадии микроскопа и подключите батарею к голове AFM для питания лазера.Настройка камеры для детектора микроскопа для визуализации лазерного света на мониторе или экране телевизора. Руководствуясь микроскопом, распорежь лазер так, чтобы он был направлен на кончик кантилевера. Как только образец будет готов, смойте 10 микролитров буфера эксперимента в каждый порт ячейки, удерживаваемой зондом.Декант около 40 микролитров жидкости из образца слайд и добавить 40 микролитров буфера. В то же время, начать подготовку атомной микроскоп силы для измерения. Во-первых, поместите слайд на магнит над мотором пьезо.Подтвердите, что этап AFM находится в повышенном положении, а затем поместите головку AFM на сцену с кантилевером над каплей образца. Затем поместите небольшой листок бумаги перед фотодиодом AFM. Отрегулируйте лазер до тех пор, пока пятно на бумаге не будет ярким и сфокусированным, а затем удалите бумагу.Запустите программное обеспечение AFM для просмотра сигнала с фотодиода. Отрегулируйте головное зеркало AFM таким образом, чтобы лазерный сигнал был максимизироваен во всех четырех квадрантах фотодиодов, а другой сигнал между верхней и нижней квадрантными парами обнулен. Чтобы начать калибровку AFM, включите настройку фильтра для головного сигнала AFM до полной пропускной способности и убедитесь, что пьезо выключен.В программном обеспечении AFM, измерить в среднем 512 расчетов спектра мощности, с 1024 точек данных на расчет. Интегрируйте спектральную плотность мощности через первый пик, что соответствует основному режиму вибрации для кантилевера. Затем включите контроллер пьезо и установите фильтр до 500 Герц.Быстро перемещать голову AFM вниз несколько сотен микрометров при мониторинге различных сигналов. Продолжайте двигать головой вниз несколько сотен микрометров за один раз, наблюдая за последовательными прыжками в различных сигналах. Когда скачки сигнала начинают увеличиваться в высоту, кончик находится очень близко к поверхности образца.После того, как сигнал отклонения насыщает при контакте кончика с поверхностью, поднимите голову немного, а затем настроить напряжение пьезо, чтобы переместить голову AFM вверх или вниз на 100 до 5000 нанометров, чтобы найти поверхность образца. После этого проведем потянув эксперимент с сканированием размером около 500 нанометров, так что кончик контактов поверхности, или около 100 нанометров пьезо двигатель путешествия. Используйте результаты для расчета пружинной постоянности и чувствительности.В программном обеспечении установите размер сканирования на 40%больше, чем общий теоретический размер разворачивающегося полипротеина. Распоитите кантилевер так, чтобы он был на 80% от размера сканирования от поверхности. Установите скорость сканирования до 300 нанометров в секунду.Выполните потянув эксперимент и измерить в результате пьезо позиции и фотодиод сигнала. Добавьте буфер эксперимента к жидкости клетки почасово на протяжении всего измерения, чтобы сохранить образец от высыхания. Разворачивающиеся события в записях полипротеина I91 и полипротеина, в котором три домена I91 обрамляли молекулу NI10C с каждой стороны, были оснащены червь-подобной цепной моделью.Обе записи показывают характерную силу и длину контура шагом I91, что указывает на то, что калибровка AFM была успешной. Записи полипротеина, содержащего молекулу N110C, показали достаточное количество событий I91, чтобы подтвердить, что новые события были из белка интереса разворачивается. Средняя длина контура для повторения анкирина составила около 10,5 нанометров, а разворачивающиеся силы были между 8 и 25 пиконьютонами.Очень важно использовать полипротеин, потому что разворачивающиеся события фланговых белков обеспечивают положительный контроль для отпечатков пальцев одного события молекулы. Без этого данные могут быть неправильно истолкованы.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Visualizing Cells, Tissues, and Molecules

SCIENTISTS IN ACTION

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Структурные исследования атомной шкале макромолекулярных сборок, твердотельного ЯМР спектроскопии

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Захват кинетика взаимодействия ионного канала белка с малых молекул в Assay интерферометрии био слоя

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Ковалентной иммобилизации белков для одной молекулы силой спектроскопии

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Флуоресценции колебания спектроскопии Assay белок белковых взаимодействий в ячейке контакты

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Проверка структуры и динамики нуклеосом с помощью атомно-силовой микроскопии изображений

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Изображение внеклеточных пузырьков с помощью атомной микроскопии силы

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Одномолекулярная слежение за микроскопией - инструмент для определения диффузивных состояний цитосолильных молекул

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Атомная спектроскопия поглощения для измерения внутриклеточного цинка бассейны в клетках млекопитающих

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Оценка взаимодействия белкови-белков с использованием метода пищеварения On-Membrane

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Характеристика индивидуальных белковых агрегатов с помощью инфракрасной наноспектроскопии и микроскопии атомной силы

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...