Name: force spectroscopy of single protein molecules using an atomic force microscope
Uploaded: 2019-02-28T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope at JoVE.com

Bu eser Ulusal Bilim Vakfı Hibe MCB-1244297 ve MCB-1517245 PEM için tarafından desteklenmiştir.

1. protein hazırlık
<ol><li>DNA klonlama.<ol>
<li>Faiz, NI10C10, örneğin, DNA dizisi DNA dizisi sentez veya üzerinden PCR standart moleküler biyoloji teknikleri11kullanarak ana bilgisayar organizmadan yalıtmak. Kısıtlama sitelerle ilgi gen sentezi sırasında veya 5'-sonu plazmid pEMI91 modülünde (Addgene #74888)12karşılık gelecek şekilde PCR astar siteleri yerleştirerek kuşatın.</li>
		<li>Böylece faiz dizisi...

<ol>
	<li>Rief, M., Gautel, M., Oesterhelt, F., Fernandez, J. M., Gaub, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reversible+Unfolding+of+Individual+Titin+Immunoglobulin+Domains+by+AFM.">Reversible Unfolding of Individual Titin Immunoglobulin Domains by AFM.</a> Science. 276 (5315), 1109-1112 (1997).</li><li>Fisher, T. E., Oberhauser, A. F., Carrion-Vazquez, M., Marszalek, P. E., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+study+of+protein+mechanics+with+the+atomic+force+microscope.">The study of protein mechanics with the atomic force microscope.</a> Trends in Biochemical Sciences. 24 (10), 379-384 (1999).</li><li>Ng, S., Rounsevell, R., Steward, A., Randles, L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+studies+of+protein+folding+by+atomic+force+microscopy(AFM).">Single molecule studies of protein folding by atomic force microscopy(AFM).</a> Abstracts of Papers of the American Chemical Society. 227, U545-U545 (2004).</li><li>Rico, F., Chu, C., Moy, V. T., Braga, P. C., Ricci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods in Molecular Biology. 736, 331-353 (2011).</li><li>Muller, D. J., Dufrene, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+as+a+multifunctional+molecular+toolbox+in+nanobiotechnology.">Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology.</a> Nature Nanotechnology. 3 (5), 261-269 (2008).</li><li>Lv, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+biomaterials+to+mimic+the+mechanical+properties+of+muscles.">Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles.</a> Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).</li><li>Kim, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomechanics+of+Streptavidin+Hubs+for+Molecular+Materials.">Nanomechanics of Streptavidin Hubs for Molecular Materials.</a> Advanced Materials. 23 (47), 5684-5688 (2011).</li><li>Gonzalez, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-Adhesive+Hydrogels+from+Intrinsically+Unstructured+Proteins.">Self-Adhesive Hydrogels from Intrinsically Unstructured Proteins.</a> Advanced Materials. , (2017).</li><li>Oberhauser, A. F., Hansma, P. K., Carrion-Vazquez, M., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stepwise+unfolding+of+titin+under+force-clamp+atomic+force+microscopy.">Stepwise unfolding of titin under force-clamp atomic force microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 98 (2), 468-472 (2001).</li><li>Li, Q., Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+the+Mechanical+Unfolding+Pathway+of+a+Large+Protein+with+Coiled-Coil+Probes.">Capturing the Mechanical Unfolding Pathway of a Large Protein with Coiled-Coil Probes.</a> Angewandte Chemie International Edition. 53 (49), 13429-13433 (2014).</li><li>Davis, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Basic methods in molecular biology. , (2012).</li><li>Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modular,+Non-Degenerate+Polyprotein+Scaffold+for+Atomic+Force+Spectroscopy.">A Modular, Non-Degenerate Polyprotein Scaffold for Atomic Force Spectroscopy.</a> Biomacromolecules. , (2016).</li><li>Scholl, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The (Un) Folding of Multidomain Proteins Through the Lens of Single-molecule Force-spectroscopy and Computer Simulation. , (2016).</li><li>Pawlak, K., Strzelecki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanopuller-open+data+acquisition+platform+for+AFM+force+spectroscopy+experiments.">Nanopuller-open data acquisition platform for AFM force spectroscopy experiments.</a> Ultramicroscopy. 164, 17-23 (2016).</li><li>. Nanopuller Available from: <a target="_blank" href="https://sourceforge.net/projects/nanopuller/">https://sourceforge.net/projects/nanopuller/</a> (2018)</li><li>Scholl, Z. N., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+single+molecule+force+spectroscopy+through+automated+real-time+data+collection+and+quantification+of+experimental+conditions.">Improving single molecule force spectroscopy through automated real-time data collection and quantification of experimental conditions.</a> Ultramicroscopy. 136, 7-14 (2014).</li><li>Bouchiat, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+persistence+length+of+a+worm-like+chain+molecule+from+force-extension+measurements.">Estimating the persistence length of a worm-like chain molecule from force-extension measurements.</a> Biophysical journal. 76 (1), 409-413 (1999).</li><li>Su, T., Purohit, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanics+of+forced+unfolding+of+proteins.">Mechanics of forced unfolding of proteins.</a> Acta. 5 (6), 1855-1863 (2009).</li><li>Steward, A., Toca-Herrera, J. L., Clarke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Versatile+cloning+system+for+construction+of+multimeric+proteins+for+use+in+atomic+force+microscopy.">Versatile cloning system for construction of multimeric proteins for use in atomic force microscopy.</a> Protein science. 11 (9), 2179-2183 (2002).</li><li>Scholl, Z. N., Josephs, E. A., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modular,+Nondegenerate+Polyprotein+Scaffolds+for+Atomic+Force+Spectroscopy.">Modular, Nondegenerate Polyprotein Scaffolds for Atomic Force Spectroscopy.</a> Biomacromolecules. 17 (7), 2502-2505 (2016).</li><li>Hoffmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Robust+Polyprotein+Production+Facilitates+Single-Molecule+Mechanical+Characterization+of+&#946;-Barrel+Assembly+Machinery+Polypeptide+Transport+Associated+Domains.">Rapid and Robust Polyprotein Production Facilitates Single-Molecule Mechanical Characterization of &#946;-Barrel Assembly Machinery Polypeptide Transport Associated Domains.</a> ACS. 9 (9), 8811-8821 (2015).</li><li>Dudko, O. K., Hummer, G., Szabo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Theory,+analysis,+and+interpretation+of+single-molecule+force+spectroscopy+experiments.">Theory, analysis, and interpretation of single-molecule force spectroscopy experiments.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15755-15760 (2008).</li><li>Popa, I., Berkovich, R., Alegre-Cebollada, J., Rivas-Pardo, J. A., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Halotag+Tethers+to+Study+Titin+Folding+at+the+Single+Molecule+Level.">Halotag Tethers to Study Titin Folding at the Single Molecule Level.</a> Biophysical journal. 106 (2), 391a (2014).</li><li>Yu, H., Siewny, M. G., Edwards, D. T., Sanders, A. W., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hidden+dynamics+in+the+unfolding+of+individual+bacteriorhodopsin+proteins.">Hidden dynamics in the unfolding of individual bacteriorhodopsin proteins.</a> Science. 355 (6328), 945-950 (2017).</li><li>Rico, F., Gonzalez, L., Casuso, I., Puig-Vidal, M., Scheuring, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+force+spectroscopy+unfolds+titin+at+the+velocity+of+molecular+dynamics+simulations.">High-speed force spectroscopy unfolds titin at the velocity of molecular dynamics simulations.</a> Science. 342 (6159), 741-743 (2013).</li><li>He, Y., Lu, M., Cao, J., Lu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+protein+conformations+by+single-molecule+AFM-FRET+nanoscopy.">Manipulating protein conformations by single-molecule AFM-FRET nanoscopy.</a> ACS nano. 6 (2), 1221-1229 (2012).</li><li>Fotiadis, D., Scheuring, S., M&#252;ller, S. A., Engel, A., M&#252;ller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+manipulation+of+biological+structures+with+the+AFM.">Imaging and manipulation of biological structures with the AFM.</a> Micron. 33 (4), 385-397 (2002).</li><li>Edwards, D. T., Faulk, J. K., LeBlanc, M. A., Perkins, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+Spectroscopy+with+9-&#956;s+Resolution+and+Sub-pN+Stability+by+Tailoring+AFM+Cantilever+Geometry.">Force Spectroscopy with 9-&#956;s Resolution and Sub-pN Stability by Tailoring AFM Cantilever Geometry.</a> Biophysical journal. 113 (12), 2595-2600 (2017).</li><li>Dudko, O. K., Mathe, J., Szabo, A., Meller, A., Hummer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracting+kinetics+from+single-molecule+force+spectroscopy:+Nanopore+unzipping+of+DNA+hairpins.">Extracting kinetics from single-molecule force spectroscopy: Nanopore unzipping of DNA hairpins.</a> Biophysical. 92 (12), 4188-4195 (2007).</li><li>Scholl, Z. N., Li, Q., Yang, W., Marszalek, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+Force+Spectroscopy+Reveals+the+Calcium+Dependence+of+the+Alternative+Conformations+in+the+Native+State+of+a+&#946;&#947;-Crystallin+Protein.">Single-molecule Force Spectroscopy Reveals the Calcium Dependence of the Alternative Conformations in the Native State of a &#946;&#947;-Crystallin Protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (35), 18263-18275 (2016).</li></ol>

Protokol kritik bir adımda "parmak izi tek molekül olaylar için" olumlu bir denetim olarak hizmet veren 1.1.2, adımda anlatılan bir polyprotein kullanımıdır. Genel olarak, orada polyprotein proteinler olayların unfolding gerekir (I91 için bu yaklaşık 28 yaklaşık 200 pN ve kontur uzunluğu artışı bir açılım güç anlamına gelir nm) belirsizliğe yer bırakmadan faiz protein gelişeceğini olmuştur sonuçlandırmak için. Örneğin, ne zaman faiz protein her iki taraftan üç I91 etki alanı tarafınd...

Tek molekül kuvvet spektroskopisi (SMFS) tarafından AFM gelişmeler tek protein molekülleri malzemelerin mekanik manipülasyon ve hassas etkinleştirdiniz. Bu karakterizasyonu protein mekaniği1,2,3, protein-ligand etkileşimleri4, protein-protein etkileşimleri5, katlama protein hakkında yeni anlayışlar üretti ve protein bazlı mühendislik malzemeler6,7,8. SMFS protein eğitimi için özellikle yararlı unfolding, yavaş yavaş kendi sertlik verir rise için sürekli artan bir kontur uzunluğu göre genişletmek için protein molekül içinde kimyasal ve fiziksel Tahvil sağlar AFM tarafından germe olarak. Bu bir protein molekülünün esneme ani geçişe rüptürü olayında ortaya çıkan kuvvet-uzantısı eğri üretmek (veya tepe zorla). Gücü en yüksek mekanik açılım sürecinde protein unfolding kuvvet ve yapısal değişikliği doğrudan bilgi verir. AFM kullanarak ilk çalışmalar titin1 ölçülen ve roman yönlerini unfolding ve yoğun kimyasal madde veya aşırı sıcaklıklara gibi doğal olmayan denatüranlar kullanmaya gerek kalmadan fizyolojik koşullar altında refolding protein bulundu.
Burada sadece AFM dikkate da SMFS deneyler aletleri, çeşitli üzerinde yapılmaktadır. AFM dört ana öğelerden oluşur: sonda, Dedektör, örnek sahibi ve piezoelektrik inceden inceye gözden geçirmek. Sonda bir konsol free-swinging ucunda keskin bir yolgösterendir. Kalibrasyon sonra konsol ekli bir molekülünün germe sırasında bükme tam Kuvvetleri Hooke'un Kanunu kullanarak belirlemek için konsol rahat yansıyan lazer ışını kullanılarak ölçülür. Bir lazer ışını diyot Merkezi'nden çıkarılması ile orantılı olarak Sinus bir çeyreği fotodiyot dedektörü yansıyan lazer ışını projelere. Substrat sıvı protein örneği ile alt nanometre hassasiyetle kontrol edilebilir bir 3D piezoelektrik sahne üzerine monte edilmiştir. Bir bilgisayar gerilim fotodiyot dedektörleri okur ve bilgisayar kontrollü voltaj kaynağı 3D adımında denetler. Bu piezo aktüatör aşamalar genellikle kapasitif ile donatılmıştır veya germe-pozisyon sensörleri tam ölçü piezo deplasman ve geri besleme kontrol sistemi aracılığıyla doğru histeresis detektörler. Sensör sinyal çıkış piezo denetleyicisinden fabrika kalibre piezo gerilim sabiti kullanılarak mesafe içine dönüştürülür. Çekerek bir deneme bir örnek kuvvet-uzantısı eğrisi Şekil 2' de gösterilmiştir.
AFM-SMFS deneyler iki türü vardır: sabit hız ve sürekli kuvvet ölçümleri çekerek. Sürekli kuvvet SMFS ölçümleri Oberhauser vd. açıklanan Burada sabit hız ölçümleri üzerinde ele iken 9. Tipik bir AFM sabit hızda çekme deneyi yavaşça bir substrat prensibine göre bahşiş göre taşımak için bir piezo gerilim sağlayarak yapılır. Tipik bir deney başlangıçta yüzeyine karşı basarak ucu vardır. Çekerek ölçü belgili tanımlık substrate temasımız getirmek için belgili tanımlık uç uzak hareket ettirerek başladı. Bir protein ile temas ipucu başlangıçta gelirse çekilmiş olacak ve deplasman karşı kuvvet unfolding izleme ölçülecektir. Belgili tanımlık substrate ipucu ile temas geri getirilir ve rahatlatıcı bir izleme nerede protein katlanması kuvvet uzaklığı belirlenebilir ölçülür.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>AFM Specimen Discs, 15mm diameter</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>16218</td>
			<td>Serve as base for glass substrate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>26024</td>
			<td>serve as glass substrate and base for gold coating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Tabs</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>16079</td>
			<td>Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>STD Multimode head assembly</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>1B75C</td>
			<td>AFM head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass probe holder</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>MTFML-V2</td>
			<td>Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlever AFM probes</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>MLCT</td>
			<td>Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM probes with Au coated tips</td>
			<td>Bruker Nano Inc.</td>
			<td>OBL-10</td>
			<td>Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs</td>
			<td>National Instruments</td>
			<td>PCI-6259</td>
			<td>Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LISA Linear Piezo Stage Actuators</td>
			<td>Physik Instrumente LP</td>
			<td>P-753.11C</td>
			<td>Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XY Piezo Stage</td>
			<td>Physik Instrumente LP</td>
			<td>P-541.2CD</td>
			<td>Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

force spectroscopy of single protein molecules using an atomic force microscope

Katlama işlemi yerel 3D yapıları için onların amino asit dizisi üzerinden proteinlerin tayini Biyolojide önemli bir sorundur. Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) germe ve belirli unfolding ve özellikleri refolding doğrudan kanıt veren gevşeme tek protein moleküllerinin sağlayarak bu sorunu ele alabilir. AFM tabanlı tek molekül kuvvet-spektroskopisi (AFM-SMFS) sürekli olarak geleneksel toplu (biyokimyasal) ölçümlerde mümkün olmayan proteinler yüksek enerjili biçimler ölçmek için bir yol sağlar. AFM-SMFS prensipleri göstermek için pek çok makalesi yayımlandı rağmen etraflıca bir iletişim eksikliği nedeniyle SMFS deney kolay değildir. Bu çalışmada kısaca AFM prensipleri göstermek ve kapsamlı detay iletişim kuralları, yordamlar ve veri analizi SMFS deneyler iyi sonuçlar elde etmek için bir kılavuz olarak. Biz tek protein mekanik unfolding ölçümleri temsilcisi SMFS sonuçlarını göstermek ve stratejileri için bazı yaygın karşılaşılan sorun giderme sorunları sağlar.

Bu protokolden temsilcisi sonuçları Şekil 2' de gösterilmiştir. Her iki panelleri temsilcisi kuvvet-uzantısı eğrileri proteinler üzerinden göster. Alt protein--ilgi çekici bir, NI10C molekül kanat I91 protein gösterirken üst I91 polyprotein sonuçlarını gösterir. Bu kayıtlar I91 karakteristik gücünü göstermek (200 pN) ve kontur uzunluğu artışı (28 nm) hangi gösterir hizalama ve AFM kalibrasyonu başarılı oldu. Bu kuvvet...

Watch this Scientific Journal Video about Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope at JoVE.com

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

Kuvvet spektroskopisi bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak tek Protein moleküllerinin

Biz ayrıntılı yordamlar ve mekanik özellikleri ve mekanik unfolding yollar tek protein moleküllerinin bir Atomik kuvvet mikroskobu kullanarak ölçmek için stratejileri açıklar. Ayrıca seçim ve bloklama iyi tek protein molekülü kayıtları için bir başvuru olarak temsilcisi sonuçları göster.

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Tek moleküllü kuvvet spektroskopisi, tek molekülleri kuvvetle manipüle etmemize izin vererek atomik ölçekte moleküler biyoloji hakkında muazzam bilgiler sağlayabilir. Burada, atomik kuvvet mikroskobu kullanılarak sabit bir hız ölçümü gösteriyoruz. Sonuçta protein kararlılığını belirlemek için verileri kullanabilirsiniz, açılma hızı, ve açılma yolu.Yordamı başlatmak için, 15 milimetre genişliğindeki temiz bir demir diske iletken olmayan bir yapışkan sekmesi takın. Kapak sayfasını çıkarın ve açıkta kalan yapıştırıcının üzerine temiz, kaplamasız veya altın kaplı cam bir kaydırağa sıkıca basın. Kaydırağı temiz, kapalı bir Petri kabında saklayın.Daha sonra, arınmış poliproteini bir santrifüj süzgeçte yoğunlaştırın, ardından kolontersine çevirin ve deneyde kullanılmak üzere proteini tampona dönüştürün. 280 nanometredeki absorbansa göre uygun protein konsantrasyonu belirleyin ve sonra proteinin mililitre çözeltisi başına 100 mikrogram 100 mikrolitre hazırlayın. Protein çözeltisinin 60 mikrolitrelik damlasını slaytın ortasına uygulayın.Bu, deney sırasında kontrolsüz numune hareketlerine yol açacağından, sıvının slayt ve demir disk arasında kaymasına izin vermemeye dikkat edin. Numune nin oda sıcaklığında en az 10 dakika oturmasını bekleyin. İlk olarak, dikkatlice sonuna kadar kantilever almak ve sonda tutma hücresine yerleştirin.Kantilin sıkıca oturduğundan emin olun. Ardından tutucu hücreyi AFM kafasına yerleştirin. Başı ters bir mikroskop aşamasına ayarlayın ve lazere güç sağlamak için bir pil takımını AFM kafasına bağlayın.Bir monitör veya TV ekranında lazer ışığını görselleştirmek için mikroskop dedektörü için bir kamera ayarlayın. Mikroskop tarafından yönlendirilen lazer, kantilever ucuna yönlendirilen şekilde konumlandırın. Numune hazır olduğunda, deney tamponunun 10 mikrolitresini sonda tutan hücrenin her bir noktasına boşaltın.Örnek slayttan yaklaşık 40 mikrolitre sıvı çıkarve 40 mikrolitre arabellek ekleyin. Bu arada, ölçüm için atomik kuvvet mikroskobu hazırlamaya başlayın. İlk olarak, piezo motor üzerinde mıknatıs üzerinde slayt yerleştirin.AFM aşamasının yüksek konumda olduğunu doğrulayın ve afm kafasını örnek damlacıkların üzerinde kantilever ile sahneye yerleştirin. Ardından, AFM fotodiyotunun önüne küçük bir kağıt parçası yerleştirin. Kağıt üzerindeki nokta parlak ve odaklanmış olana kadar lazeri ayarlayın ve sonra kağıdı çıkarın.Fotodiyottan gelen sinyali görüntülemek için AFM yazılımını başlatın. AFM kafa aynasını lazer sinyalinin dört fotodiyot çeyreğinde de maksimize edilebis ve üst ve alt dörtlü çiftleri arasında farklı bir sinyal sıfır olacak şekilde ayarlayın. AFM'yi kalibre etmeye başlamak için, AFM kafa sinyali için filtre ayarını tam bant genişliğine çevirin ve piezo'nun kapalı olduğundan emin olun.AFM yazılımında, hesaplama başına 1,024 veri puanı yla güç spektrumunun ortalama 512 hesaplamasını ölçün. Güç spektral yoğunluğunu ilk tepeye entegre edin, bu da kantilin ana titreşim moduna karşılık gelir. Ardından, piezo denetleyicisini açın ve filtreyi 500 Hertz'e ayarlayın.Farklı sinyali izlerken AFM kafasını birkaç yüz mikrometre aşağı doğru hızla hareket ettirin. Farklı sinyal tutarlı atlar izlerken bir seferde birkaç yüz mikrometre aşağı baş hareket devam edin. Sinyal atlayışları yüksekliği artmaya başladığında, uç örnek yüzeye çok yakındır.Sapma sinyali yüzeyle uç teması nda doygunlaştığında, başı hafifçe kaldırın, ardından örnek yüzeyi bulmak için AFM kafasını 100 ila 5 000 nanometre yukarı veya aşağı hareket ettirecek piezo gerilimini ayarlayın. Bundan sonra, uç yüzey, ya da piezo motor seyahat yaklaşık 100 nanometre temas böylece yaklaşık 500 nanometre bir tarayın bir çekme deneyi yapın. Yay sabitini ve hassasiyetini hesaplamak için sonuçları kullanın.Yazılımda, tbmm boyutunu ortaya çıkan poliproteinin toplam teorik boyutundan %40 daha büyük olarak ayarlayın. Kantili, tazyim boyutunun %80'ini yüzeyden uzakta olacak şekilde yerleştirin. Tarayın hızını saniyede 300 nanometreye ayarlayın.Bir çekme deneyi gerçekleştirin ve elde edilen piezo konumunu ve fotodiyot sinyalini ölçün. Numunenin kurumasını engellemek için ölçüm boyunca sıvı hücresine saat başı deney arabelleği ekleyin. Bir I91 poliproteininin ve üç I91 etki alanının her iki taraftaki NI10C molekülünü kuşattığı bir poliproteinin kayıtlarında ortaya çıkan olaylar, solucan benzeri bir zincir modeliyle donatılmıştır.Her iki kayıt da I91'in karakteristik kuvvetini ve kontur uzunluğu artışlarını göstererek AFM kalibrasyonunun başarılı olduğunu gösterir. N110C molekülünü içeren poliproteinkayıtları, yeni olayların ortaya çıkan ilgi proteininden geldiğini doğrulayacak kadar I91 olayı gösterdi. Ankyrin tekrarı için ortalama kontur uzunluğu yaklaşık 10.5 nanometre, ve açılma kuvvetleri sekiz ila 25 pikonewton arasındaydı.Bir poliprotein kullanmak çok önemlidir çünkü yan proteinlerin gelişen olayları tek molekül olayını parmak izi için pozitif bir kontrol sağlar. Bu olmadan, veriler yanlış yorumlamaya karşı sorumludur.

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biochemistry

Unit 1

Visualizing Cells, Tissues, and Molecules

SCIENTISTS IN ACTION

Atomic Scale Structural Studies of Macromolecular Assemblies by Solid-state Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Supramolecular protein assemblies play fundamental roles in biological processes ranging from host-pathogen interaction, viral infection to the ...

Capturing the Interaction Kinetics of an Ion Channel Protein with Small Molecules by the Bio-layer Interferometry Assay

Bir iyon kanal protein biyo-katman Interferometry tahlil tarafından küçük molekülleri ile etkileşimi Kinetik yakalama

The bio-layer interferometry (BLI) assay is a valuable tool for measuring protein-protein and protein-small molecule interactions. Here, we first describe ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Proteinler kovalent immobilizasyon için tek molekül kuvvet spektroskopisi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

A Fluorescence Fluctuation Spectroscopy Assay of Protein-Protein Interactions at Cell-Cell Contacts

Bir floresan dalgalanma spektroskopisi tahlil Protein-Protein etkileşimlerinin hücre-hücre kişiler

A variety of biological processes involves cell-cell interactions, typically mediated by proteins that interact at the interface between neighboring ...

Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging

Atomik kuvvet mikroskobu Imaging'i kullanma oluşturarlar dinamikleri ve yapısını sondalama

Chromatin, which is a long chain of nucleosome subunits, is a dynamic system that allows for such critical processes as DNA replication and transcription ...

Imaging of Extracellular Vesicles by Atomic Force Microscopy

Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Hücre Dışı Veziküllerin Görüntülenmesi

Exosomes and other extracellular vesicles (EVs) are molecular complexes consisting of a lipid membrane vesicle, its surface decoration by membrane ...

Single-Molecule Tracking Microscopy - A Tool for Determining the Diffusive States of Cytosolic Molecules

Tek Moleküllü İzleme Mikroskobu - Sitosolik Moleküllerin Diffüz Durumlarını Belirlemede Bir Araç

Single-molecule localization microscopy probes the position and motions of individual molecules in living cells with tens of nanometer spatial and ...

Atomic Absorbance Spectroscopy to Measure Intracellular Zinc Pools in Mammalian Cells

Mammalin hücrelerinde hücre Içi çinko havuzlarını ölçmek için atomik absorbance spektroskopisi

Transition metals are essential micronutrients for organisms but can be toxic to cells at high concentrations by competing with physiological metals in ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Bir on-membran sindirim tekniği kullanılarak protein-protein etkileşimlerinin değerlendirilmesi

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

Bireysel Protein Agregalarının Kızılötesi Nanospektroskopi ve Atomik Kuvvet Mikroskobu ile Karakterizeleştirilmesi

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...