Name: live-cell imaging of fungal cells to investigate modes of entry and subcellular localization of antifungal plant defensins
Uploaded: 2017-12-24T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins at JoVE.com

Wir bedanken uns bei Dr. R. Howard Berg, Leiter der integrierten Mikroskopie-Einrichtung bei Donald Danforth Plant Science Center, für seine Beratung und Hilfe bei der konfokalen Mikroskopie. Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt zu erklären.

1. Kennzeichnung der Defensine mit Fluorophore
<ol>
	<li>Wählen Sie eine Fluorophore, die minimale Auswirkungen auf die antimikrobiellen Eigenschaften sowie die Aufnahme und Lokalisierung von defensin innerhalb der lebenden Zelle hat. Hinweis: Optimale Fluorophor Auswahl richtet sich nach experimentellen Einzelziele. Spektrale und chemischen Eigenschaften, Photostabilität, Größe und Ladung der Fluorophor sollten berücksichtigt werden.</li>
	<li>Label defensin mit den ausgewählten Fluorophor mit einer entsprech...

<ol>
	<li>Jones, J. D. G., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+immune+system.">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).</li><li>Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Plant+Peptidome:+An+expanding+repertoire+of+structural+features+and+biological+functions.">The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions.</a> Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).</li><li>Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+and+mechanisms+of+action+of+naturally+occurring+antifungal+peptides.">Properties and mechanisms of action of naturally occurring antifungal peptides.</a> Cell. and Mol. Life Sci. 70 (19), 3545-3570 (2013).</li><li>Van der Weerden, N. L., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+defensins:+Common+fold,+multiple+functions.">Plant defensins: Common fold, multiple functions.</a> Fungal Biol Rev. 26 (4), 121-131 (2013).</li><li>De Coninck, B., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modes+of+antifungal+action+and+in+planta+functions+of+plant+defensins+and+defensin-like+peptides.">Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides.</a> Fungal Biol Rev. 26 (4), 109-120 (2013).</li><li>Kaur, J., Sagaram, U. S., Shah, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Can+plant+defensins+be+used+to+engineer+durable+commercially+useful+fungal+resistance+in+crop+plants?.">Can plant defensins be used to engineer durable commercially useful fungal resistance in crop plants?.</a> Fungal Biol. Rev. 25 (3), 128-135 (2011).</li><li>Vriens, K., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+plant+defensins:+Mechanisms+of+action+and+production.">Antifungal plant defensins: Mechanisms of action and production.</a> Molecules. 19 (8), 12280-12303 (2014).</li><li>Sagaram, U. S., Kaur, J., Shah, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+plant+defensins:+Structure-activity+relationships,+modes+of+action,+and+biotech+applications.">Antifungal plant defensins: Structure-activity relationships, modes of action, and biotech applications.</a> ACS Symp. Ser. 1095, 317-336 (2012).</li><li>Thevissen, K., Francois, I. E. J. A., Aerts, A. M., Cammue, B. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fungal+sphingolipids+as+targets+for+the+development+of+selective+antifungal+therapeutics.">Fungal sphingolipids as targets for the development of selective antifungal therapeutics.</a> Curr. Drug Targets. 6 (8), 923-928 (2005).</li><li>Thevissen, K., Kristensen, H. H., Thomma, B. P. H. J., Cammue, B. P. A., Francois, I. E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+potential+of+antifungal+plant+and+insect+defensins.">Therapeutic potential of antifungal plant and insect defensins.</a> Drug Discov. Today. 12 (21-22), 966-971 (2007).</li><li>Aerts, A. M., Fran&#231;ois, I. E. J. A., Cammue, B. P. A., Thevissen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mode+of+antifungal+action+of+plant,+insect+and+human+defensins.">The mode of antifungal action of plant, insect and human defensins.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65 (13), 2069-2079 (2008).</li><li>Van Der Weerden, N. L., Lay, F. T., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+defensin,+NaD1,+enters+the+cytoplasm+of+Fusarium+oxysporum+hyphae.">The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae.</a> J. Biol. Chem. 283 (21), 14445-14452 (2008).</li><li>Lobo, D. S., Pereira, I. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+Pisum+sativum+Defensin+1+Interacts+with+Neurospora+crassa+Cyclin+F+Related+to+the+Cell+Cycle.">Antifungal Pisum sativum Defensin 1 Interacts with Neurospora crassa Cyclin F Related to the Cell Cycle.</a> Biochemistry. 46 (4), 987-996 (2007).</li><li>El-Mounadi, K., Islam, K. T., Hernandez-Ortiz, P., Read, N. D., Shah, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antifungal+mechanisms+of+a+plant+defensin+MtDef4+are+not+conserved+between+the+ascomycete+fungi+Neurospora+crassa+and+Fusarium+graminearum.">Antifungal mechanisms of a plant defensin MtDef4 are not conserved between the ascomycete fungi Neurospora crassa and Fusarium graminearum.</a> Mol. Microbiol. 100 (3), 542-559 (2016).</li><li>Baxter, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Tomato+Defensin+TPP3+Binds+Phosphatidylinositol+(4,5)-Bisphosphate+via+a+Conserved+Dimeric+Cationic+Grip+Conformation+To+Mediate+Cell+Lysis.">The Tomato Defensin TPP3 Binds Phosphatidylinositol (4,5)-Bisphosphate via a Conserved Dimeric Cationic Grip Conformation To Mediate Cell Lysis.</a> Mol. and Cell. Biol. 35 (11), 1964-1978 (2015).</li><li>Kvansakul, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Binding+of+phosphatidic+acid+by+NsD7+mediates+the+formation+of+helical+defensin-lipid+oligomeric+assemblies+and+membrane+permeabilization.">Binding of phosphatidic acid by NsD7 mediates the formation of helical defensin-lipid oligomeric assemblies and membrane permeabilization.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 113, 11202-11207 (2016).</li><li>Poon, I. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphoinositide-mediated+oligomerization+of+a+defensin+induces+cell+lysis.">Phosphoinositide-mediated oligomerization of a defensin induces cell lysis.</a> eLife. 3, e01808 (2014).</li><li>Mu&#241;oz, A., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+imaging+and+analysis+shed+light+on+the+complexity+and+dynamics+of+antimicrobial+Peptide+action.">Live-cell imaging and analysis shed light on the complexity and dynamics of antimicrobial Peptide action.</a> Front. Immunol. 3, 248 (2012).</li><li>Hayes, B. M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+mechanism+of+action+of+the+plant+defensin+NaD1+as+a+new+member+of+the+antifungal+drug+arsenal+against+candida+albicans.">Identification and mechanism of action of the plant defensin NaD1 as a new member of the antifungal drug arsenal against candida albicans.</a> Antimicrob. Agents Chemother. 57 (8), 3667-3675 (2013).</li><li>Mu&#241;oz, A., Marcos, J. F., Read, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concentration-dependent+mechanisms+of+cell+penetration+and+killing+by+the+de+novo+designed+antifungal+hexapeptide+PAF26.">Concentration-dependent mechanisms of cell penetration and killing by the de novo designed antifungal hexapeptide PAF26.</a> Mol. Microbiol. 85 (1), 89-106 (2012).</li><li>Eaton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+guanine+nucleotide+exchange+factor+RIC8+regulates+conidial+germination+through+G&#945;+proteins+in+Neurospora+crassa.">The guanine nucleotide exchange factor RIC8 regulates conidial germination through G&#945; proteins in Neurospora crassa.</a> PLoS One. 7 (10), e48026 (2012).</li><li>Leslie, J. F., Summerell, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Fusarium. laboratory manual. , (2006).</li><li>Broekaert, W. F., Terras, F. R. G., Cammue, B. P. A., Vanderleyden, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+automated+quantitative+assay+for+fungal+growth+inhibition.">An automated quantitative assay for fungal growth inhibition.</a> FEMS Microbiol.Lett. 69 (1-2), 55-59 (1990).</li><li>Sagaram, U. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+studies+of+a+phosphatidic+acid-binding+antifungal+plant+defensin+MtDef4:+Identification+of+an+RGFRRR+motif+governing+fungal+cell+entry.">Structural and functional studies of a phosphatidic acid-binding antifungal plant defensin MtDef4: Identification of an RGFRRR motif governing fungal cell entry.</a> PLoS One. 8 (12), 1-22 (2013).</li><li>Uchida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soft+X-ray+tomography+of+phenotypic+switching+and+the+cellular+response+to+antifungal+peptoids+in+Candida+albicans.">Soft X-ray tomography of phenotypic switching and the cellular response to antifungal peptoids in Candida albicans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (46), 19375-19380 (2009).</li><li>Nair, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Better+prediction+of+sub-cellular+localization+by+combining+evolutionary+and+structural+information.">Better prediction of sub-cellular localization by combining evolutionary and structural information.</a> Proteins Struct. Funct. Bioinform. 53 (4), 917-930 (2003).</li><li>Scott, M. S., Calafell, S. J., Thomas, D. Y., Hallett, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refining+protein+subcellular+localization.">Refining protein subcellular localization.</a> PLoS Comput. Biol. 1 (6), e66 (2005).</li><li>Shagaghi, N., Bhave, M., Palombo, E., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+sequence+of+interactions+of+PuroA+peptide+with+Candida+albicans+cells+by+live-cell+imaging.">Revealing the sequence of interactions of PuroA peptide with Candida albicans cells by live-cell imaging.</a> Sci. Rep. 7, 43542 (2017).</li></ol>

In dieser Studie wurde eine zuverlässige live-Cell Image Methodik mit dem Einsatz von Eindringmittel beschrifteten antimykotische Defensine beschrieben, die Kinetik der Internalisierung dieser Peptide in Pilzzellen zu studieren und ihre subzelluläre Ziele zu bestimmen. Diese Methode ist ein mächtiges Werkzeug, um die Dynamik der Interaktion zwischen Defensine und Pilzzellen zeitlich und räumlich zu visualisieren.
Verschiedene Methoden wurden zur Untersuchung der Verinnerlichung und intraze...

Pflanzen haben eine anspruchsvolle angeborene Immunsystem zur Abwehr der mikrobiellen Werk Krankheitserreger1entwickelt. Sie äußern zahlreiche Gen kodiert Host Verteidigung Peptide mit vermeintlichen antimikrobielle Aktivität2. In der Tat, viele dieser Peptide antimikrobielle Aktivität in Vitro3anzeigen Defensine bilden eine der größten Gruppen von Host Verteidigung Peptiden in der Pflanze Königreich4. Diese reich an Cystein, kationischen Peptide zeigen starkes Wachstum hemmende Aktivität gegen Pilz- und Eipilz Krankheitserreger in mikromolaren Konzentrationen und repräsentieren eine der ersten Linien der Verteidigung gegen diese Erreger5,6. Wegen ihrer starken antimykotische Aktivität kann Defensine ausgenutzt werden, in Agribiotechnological Anwendungen um Krankheiten resistente Pflanzen zu erzeugen. Konstitutive Überexpression von mehreren pflanzlichen Defensine hat sich gezeigt, Resistenz gegen Krankheiten in Gewächshaus und Freiland-Tests von transgenen Pflanzen6zu verbessern. Es ist wichtig, die Mechanismen der Wirkung (MOA) dieser antimykotische Peptide zu entwirren, um ihr Potenzial voll und ganz als wirksame Instrumente für den Pflanzenschutz zu erschließen. Die MOA diese Pflanze Defensine sind jedoch kaum erforscht. Aktuelle Hinweise darauf, dass sie verschiedene MOA5,6,7,8aufweisen. Einige Defensine wirken extrazellulär auf Pilze und gezielt bestimmte Zellwand/Plasma Membran resident Sphingolipide, Membran Integrität stören und aktivieren zelluläre Toxizität Wege9,10,11. Jedoch vor kurzem, wurden antimykotische Defensine, die in Pilzzellen translozieren entdeckten12,13,14. Einige von diesen Defensine binden an Membran-Resident bioaktive Phospholipide, bilden Oligomere komplexe und Plasmamembranen15,16,17permeabilize. So haben einige Aspekte des MOA von pflanzlichen Defensine aufgeklärt. Allerdings beinhalten die MOA von pflanzlichen Defensine wahrscheinlich eine komplexe Reihe von Ereignissen, die noch nicht identifiziert und in ein umfassendes Modell integriert wurden. Insbesondere bleibt eine große Lücke in unserem Verständnis der zellulären Ziele dieser Peptide.
Mit jüngsten Fortschritte in der Mikroskopie-Technologien und die Entwicklung von neuen fluoreszierende Sonden sind Leben-Zelle bildgebende Verfahren jetzt häufig verwendet, um die MOA antimikrobielle Peptide (AMPs) zu studieren. Diese Techniken ergänzen verbreitete Methoden wie Immunolocalization, Elektronenmikroskopie, Rasterkraftmikroskopie oder Röntgen-Tomographie18, die angewandt wurden, vor allem auf die Auswirkungen von Antimykotika Peptiden auf die Morphologie zu analysieren und Wachstum von Pilzzellen einschließlich der Untersuchung der Zellwand Integrität, Veränderungen in der Zelle Wachstum/Verzweigung Muster sowie Permeabilisierung der Plasmamembran und töten. Allerdings wurden diese Studien beschränkt Imaging Zellen zu einem bestimmten Zeitpunkt nach der Behandlung mit der Peptide anstatt Zeitraffer-Aufnahme die gleichen Zellen, ihre dynamischen Veränderungen in Reaktion auf defensin Herausforderung zu überwachen. In den letzten Jahren hat die Verwendung von Eindringmittel beschriftete Peptide in Verbindung mit live Cell imaging mit der konfokalen Mikroskopie Echtzeit-Visualisierung der Dynamik des AMP-Mikroben-Interaktionen ermöglicht. Beide natürlich gereinigt und chemisch synthetisierten antimykotische Peptide können mit Fluoreszenzmarkierungen markiert werden (z.B., DyLight, Rhodamin, BODIPY oder Alexa Fluor basierend Farbstoffe) und direkt während ihrer Interaktion mit Zellen von Time-Lapse beobachtet Live Cell Imaging. Die Verwendung dieser Peptide beschriftet unser Verständnis für die verschiedenen Aspekte der ihre MOA einschließlich Modus Eintritt, subzelluläre Lokalisation, intrazellulären Menschenhandel und Websites antimykotische Maßnahmen im lebenden Pilzzellen deutlich gestiegen 18.
Vor kurzem, haben mehrere Studien gezeigt, dass verschiedene Antimykotika Peptide einschließlich Anlage Defensine Leben Pilzzellen12,14,19,20internalisiert werden. Die MOA diese Defensine wahrscheinlich beinhalten Interaktion mit intrazellulären Ziele. Wir haben vor kurzem die antimykotische Wirkung von einer Pflanze defensin MtDef4 in zwei Schlauchpilz Pilzen, Neurospora Crassa und Fusarium Graminearumberichtet. MtDef4 wurde gezeigt, um verschiedene Wege für die Pilzzelle ein- und subzelluläre Lokalisation in diesen Pilzen14zu verwenden. Diese Studie verwendet chemisch synthetisiert Tetramethyl Rhodamin (TAMRA)-mit der Bezeichnung MtDef4 in Kombination mit lebenswichtigen Fluoreszenzfarbstoffen (Membran-permeationsfähigen Farbstoff, SYTOX Green, der Membran selektiv Farbstoff, FM4-64; der Zelle Tod Reporter Farbstoff, Propidium Jodid) und metabolische Inhibitoren. Diese Analysen zeigten die Kinetik der Internalisierung von MtDef4, die Mechanismen der intrazellulären Transport und seine subzelluläre Ziele14.
Hier ist ein Protokoll für live Cell Imaging mit der konfokalen Mikroskopie vorgestellt. Das Protokoll nutzt Eindringmittel beschriftete Peptide in Kombination mit lebenswichtigen Fluoreszenzfarbstoffen Pflanze defensin-Pilz-Interaktionen, insbesondere zu studieren, die Pfade der Translokation und die intrazellulären Ziele der Defensine in Pilzzellen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FM4-64 Dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 550 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>84530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>Mat TeK</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mira cloth</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8-X confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>FiJi</td>
			<td></td>
			<td>For Image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>For Image analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of fungal cells to investigate modes of entry and subcellular localization of antifungal plant defensins

Kleinen Cystein-reiche Defensine sind eine der größten Gruppen von Host Verteidigung Peptiden in allen Pflanzen vorhanden. Viele pflanzlichen Defensine potente in Vitro antimykotische Aktivität gegen ein Breitspektrum Pilzerreger auszustellen und haben daher das Potenzial, als Antimykotika in transgenen Pflanzen verwendet werden. Um das volle Potenzial der Pflanze Defensine für Krankheiten Kontrolle zu erschließen, ist es wichtig, ihre Wirkmechanismen (MOA) aufzuklären. Mit dem Aufkommen der modernen Mikroskopiertechniken ist live Cell Imaging ein leistungsfähiges Werkzeug für das Verständnis der Dynamik von Antimykotika MOA von pflanzlichen Defensine geworden. Hier wird ein konfokalen Mikroskopie basierend live-Cell imaging Verfahren beschrieben mit zwei Eindringmittel bezeichnete Pflanze Defensine (MtDef4 und MtDef5) in Kombination mit lebenswichtigen Fluoreszenzfarbstoffen. Diese Technik ermöglicht Echtzeit-Visualisierung und Analyse der dynamischen Ereignisse der MtDef4 und MtDef5 Internalisierung in Pilzzellen. Wichtig ist, erzeugt dieser Assay eine Fülle von Informationen, einschließlich der Internalisierung Kinetik, Modus für die Einreise und subzelluläre Lokalisation dieser Peptide. Zusammen mit anderen biologischen Zelle-Tools haben diese Methoden kritische Einblicke in die Dynamik und Komplexität der MOA dieser Peptide zur Verfügung gestellt. Diese Tools können auch verwendet werden, die MOA dieser Peptide gegen verschiedene Pilze zu vergleichen.

Live Cell Imaging wurde durchgeführt, um zu verfolgen und vergleichen Sie die Internalisierung und subzelluläre Lokalisation der zwei Defensine, MtDef4 und MtDef5 von Medicago Truncatula; in Pilzzellen. TMR-MtDef4 wurde chemisch synthetisiert, während MtDef5 mit Dylight550 beschriftet war (Dylight550-MtDef5). Konidien inkubiert mit entweder defensin in Kombination mit der Membran selektiv Farbstoff FM4-64. Abbildung 1 zeigt, dass TMR-MtDef4 versch...

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Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

Pflanzlichen Defensine spielen eine wichtige Rolle in der Verteidigung der Pflanze gegen Krankheitserreger. Für effektive Nutzung dieser antimykotische Peptide als Antimykotika, verstehen ihre Wirkungsweisen (MOA) entscheidend ist. Hier ist eine live-Cell-imaging-Methode beschrieben, um kritische Aspekte der MOA dieser Peptide zu studieren.

Live Cell Imaging von Pilzzellen Modi des Eintrags und subzelluläre Lokalisation der antimykotische Pflanze Defensine zu untersuchen

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

Research

JoVE Journal

Biology

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Live-Cell-Imaging und Quantitative Analyse der embryonalen Epithelzellen in Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Forschung

Biologie

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Protokolle für Problematische Pflanze, Oomycete und Pilzproben

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live-Zelle Bildgebung von Platelet Degranulation und Sekretion unter Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

Hochauflösende Live-Cell-Bildgebung subzellulärer Strukturen

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

Isolierung von kultivierbaren Hefen und Schimmelpilzen aus Böden zur Untersuchung der Pilzpopulationsstruktur

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Microscopy Techniques for Interpreting Fungal Colonization in Mycoheterotrophic Plants Tissues and Symbiotic Germination of Seeds

Mikroskopische Techniken zur Interpretation der Pilzbesiedlung in mykoheterotrophen Pflanzengeweben und der symbiotischen Keimung von Samen

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Visualization of Cellular Interactions Between the Maize Sheaths and Fungi

Detached Maize Sheaths for Live-Cell Imaging of Infection by Fungal Foliar Maize Pathogens

Investigating Fungal Pathogenicity Mechanisms in Maize (Video) | JoVE

Abgetrennte Maisscheiden für die Lebendzell-Bildgebung der Infektion durch pilzliche Blattmais-Erreger

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