Name: quantitative localization of a golgi protein by imaging its center of fluorescence mass
Uploaded: 2017-08-10T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass at JoVE.com

Ö Stephens (University of Bristol, Bristol, İngiltere) TPST1-EGFP DNA plazmid yanı sıra için Lakshmi Narasimhan Govindarajan yazılım optimizasyonu ile yardımcı olduğunuz için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser L.L. Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi (NMRC/CBRG/007/2012), Milli Eğitim Bakanlığı (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 ve RG132/15 ve AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) hibe tarafından desteklenmiştir

Not: Işık adım adım bir protokol tyrosylprotein EGFP LQ öğesini sulfotransferazlar 1 (TPST1), bir Golgi ikamet enzimi, HeLa hücreleri belirlemek için aşağıdadır.
1. Golgi Floresans etiketli Mini-yığınlar hazırlanması
<ol><li>
Cam coverslips hazırlamak
	<ol>
<li>Aliquot 0.3 mL steril Dulbecco modifiye kartal'ın orta (DMEM) 24-şey plaka bir doku kültürü başlıklı bir kuyu için.</li>
		<li>Bir parça Φ 12 mm No.1.5 cam coverslip cam coverslip yüzeyin...

<ol>
	<li>Glick, B. S., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+for+Golgi+traffic:+a+critical+assessment.">Models for Golgi traffic: a critical assessment.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005215 (2011).</li><li>Klumperman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+the+mammalian+Golgi.">Architecture of the mammalian Golgi.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).</li><li>Lu, L., Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+endosomes+to+the+trans-Golgi+network.">From endosomes to the trans-Golgi network.</a> Semin Cell Dev Biol. , (2014).</li><li>De Matteis, M. A., Luini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exiting+the+Golgi+complex.">Exiting the Golgi complex.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 273-284 (2008).</li><li>Lu, L., Ladinsky, M. S., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisternal+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Mol Biol Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190 (2), 165-175 (2010).</li><li>Tie, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+imaging+method+for+quantitative+Golgi+localization+reveals+differential+intra-Golgi+trafficking+of+secretory+cargoes.">A novel imaging method for quantitative Golgi localization reveals differential intra-Golgi trafficking of secretory cargoes.</a> Mol Biol Cell. 27 (5), 848-861 (2016).</li><li>Trucco, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secretory+traffic+triggers+the+formation+of+tubular+continuities+across+Golgi+sub-compartments.">Secretory traffic triggers the formation of tubular continuities across Golgi sub-compartments.</a> Nat Cell Biol. 6 (11), 1071-1081 (2004).</li><li>Cole, N. B., Sciaky, N., Marotta, A., Song, J., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Golgi+dispersal+during+microtubule+disruption:+regeneration+of+Golgi+stacks+at+peripheral+endoplasmic+reticulum+exit+sites.">Golgi dispersal during microtubule disruption: regeneration of Golgi stacks at peripheral endoplasmic reticulum exit sites.</a> Mol Biol Cell. 7 (4), 631-650 (1996).</li><li>Rogalski, A. A., Bergmann, J. E., Singer, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+microtubule+assembly+status+on+the+intracellular+processing+and+surface+expression+of+an+integral+protein+of+the+plasma+membrane.">Effect of microtubule assembly status on the intracellular processing and surface expression of an integral protein of the plasma membrane.</a> J Cell Biol. 99 (3), 1101-1109 (1984).</li><li>Van De Moortele, S., Picart, R., Tixier-Vidal, A., Tougard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nocodazole+and+taxol+affect+subcellular+compartments+but+not+secretory+activity+of+GH3B6+prolactin+cells.">Nocodazole and taxol affect subcellular compartments but not secretory activity of GH3B6 prolactin cells.</a> Eur J Cell Biol. 60 (2), 217-227 (1993).</li><li>Nakamura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+cis-Golgi+matrix+protein,+GM130.">Characterization of a cis-Golgi matrix protein, GM130.</a> J Cell Biol. 131, 1715-1726 (1995).</li><li>Roth, J., Berger, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+localization+of+galactosyltransferase+in+HeLa+cells:+codistribution+with+thiamine+pyrophosphatase+in+trans-Golgi+cisternae.">Immunocytochemical localization of galactosyltransferase in HeLa cells: codistribution with thiamine pyrophosphatase in trans-Golgi cisternae.</a> J Cell Biol. 93 (1), 223-229 (1982).</li><li>Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tyrosine+sulfation+is+a+trans-Golgi-specific+protein+modification.">Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification.</a> J Cell Biol. 105 (6), 2655-2664 (1987).</li><li>Honda, A., Al-Awar, O. S., Hay, J. C., Donaldson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+of+Arf-1+to+the+early+Golgi+by+membrin,+an+ER-Golgi+SNARE.">Targeting of Arf-1 to the early Golgi by membrin, an ER-Golgi SNARE.</a> J Cell Biol. 168 (7), 1039-1051 (2005).</li><li>Lavieu, G., Zheng, H., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stapled+Golgi+cisternae+remain+in+place+as+cargo+passes+through+the+stack.">Stapled Golgi cisternae remain in place as cargo passes through the stack.</a> Elife. 2, 00558 (2013).</li><li>Zhao, X., Lasell, T. K., Melancon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+large+ADP-ribosylation+factor-guanine+nucleotide+exchange+factors+to+different+Golgi+compartments:+evidence+for+distinct+functions+in+protein+traffic.">Localization of large ADP-ribosylation factor-guanine nucleotide exchange factors to different Golgi compartments: evidence for distinct functions in protein traffic.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 119-133 (2002).</li><li>Dejgaard, S. Y., Murshid, A., Dee, K. M., Presley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Confocal+microscopy-based+linescan+methodologies+for+intra-Golgi+localization+of+proteins.">Confocal microscopy-based linescan methodologies for intra-Golgi localization of proteins.</a> J Histochem Cytochem. 55 (7), 709-719 (2007).</li><li>Fourriere, L., Divoux, S., Roceri, M., Perez, F., Boncompain, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule-independent+secretion+requires+functional+maturation+of+Golgi+elements.">Microtubule-independent secretion requires functional maturation of Golgi elements.</a> J Cell Sci. 129 (17), 3238-3250 (2016).</li><li>Volchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Countercurrent+distribution+of+two+distinct+SNARE+complexes+mediating+transport+within+the+Golgi+stack.">Countercurrent distribution of two distinct SNARE complexes mediating transport within the Golgi stack.</a> Mol Biol Cell. 15 (4), 1506-1518 (2004).</li><li>Popoff, V., Adolf, F., Brugger, B., Wieland, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COPI+budding+within+the+Golgi+stack.">COPI budding within the Golgi stack.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (11), 005231 (2011).</li></ol>

Daha önce yerelleştirme ışık mikroskobu altında Golgi protein ağırlıklı olarak korelasyon veya protein görüntünün Golgi işaret bilinen Yerelleştirme15,16resimle örtüşen tarafından sayılabilir, 17. Elde edilen korelasyon veya örtüşen katsayısı ne kadar yakın test Golgi işaretçisi için dağınık şekilde proteindir yansıtır. Bu yaklaşım için en az üç uyarılar vardır. İlk olarak, korelasyon...

Golgi kompleksi memeli hücreleri1,2,3' te proteinler ve yağlar (bundan sonra yükler) salgı/endositik kaçakçılığı önemli rol oynar. Golgi yükler sadece için çeşitli alt hücresel kompartmanlarda sıralanmış ama aynı zamanda glikozilasyon çeşitli türlerine göre değişiklik. Memeli Golgi kompleksi çok sayıda yanal bağlı Golgi yığınlar, ki genellikle 4-11 sıkı bitişik ve düz zar kesesi cisternae denilen oluşur oluşur. Seri olarak yığılmış Golgi cisternae daha fazla, diğer bir ucundan CIS, medial ve transkategorize edilir-cisternae. Trans-yan Golgi yığın, trans- transolarak adlandırılan borulu ve retikulum membran ağın çoğu membran sac geliştirir-Golgi ağ (TGN)4. Salgı yol endoplazmik retikulum (ER) türetilmiş yükler, CIS, Golgi yığın girin-yan ve daha sonra sırayla medial ve transyoluyla geçmek-cisternae. Gönderileri sonunda Golgi trans, çıkmak-Golgi veya TGN plazma zarı, endosomes veya salgı granül destining.
Nasıl yükler Golgi yığın transit ve Golgi cisternal kuruluşu nasıl saklandığına ilişkin moleküler ve hücresel mekanizmaları gizemli kalır ve hala bir hararetli tartışmalara1altında şu anda. Bu alandaki zorluklardan biri Golgi cisternae bir optik mikroskobu çözünürlük beri sadece elektron mikroskobu (EM) altında çözülebilir (~ 200 nm) bireysel Golgi cisternae (< 100 nm her iki cisternal kalınlıkta gidermek için yeterli değil ve mesafe) Bu nedenle, alt-Golgi yerelleştirme ikamet proteinlerin ve transit gönderileri geleneksel belirlenir tarafından IMMUNO-altın EM. Ancak, IMMUNO-altın EM çok teknik olarak talep ediyor ve çoğu hücre biyolojisi laboratuvarları yeteneği. EM çözünürlük-ebilmek var olmak alt nanometre, IMMUNO-altın EM tarafından tanınan çözünürlüğü büyük ölçüde karmaşık antikor (birincil ve ikincil antikor) boyutunu ve altın parçacık tarafından engel oluyor ve 20 kötü olabilir rağmen nm. Ayrıca, EM görüntüleri 2D ince-bölümler yerine bağlı olarak göreceli konumunu ve yönünü 2D bölüm5hatalı sonuçlara yol açabilir Golgi 3D bir genel görünümünü elde edilir. Örneğin, bir EM tek bölüm okuyan ondan beri her ikisi de aynı yuvarlak membran profiller görüntüleyebilirsiniz güvenilir bir tübül ortogonal görünümünden bir vezikül ayırt değiştiremiyor. Emisyon tükenmesi (STED), photoactivated yerelleştirme mikroskobu (PALM) ve Stokastik optik imar mikroskobu (3D yapılı aydınlatma mikroskobu (3D-SIM), gibi süper çözümleme mikroskobu teknikleri son gelişiyle uyarılmış Fırtına), alt-Golgi yapıları ışık mikroskoplar6altında çözmek sağlar. Ancak, önemli ölçüde kullanımları hücre biyolojik çalışmada, Golgi sınırlayabilirsiniz en az dört dezavantajları vardır. 1) geçerli süper çözümleme teknikleri çoğu hücre biyolojisi laboratuvarları olan pahalı ve özel donanım yapılandırması gerektirir. 2) bazı süper çözümleme teknikleri için özel Floresans etiketleme iletişim kurallarına gerek. 3) rağmen en iyi koşul altında bu tekniklerin 20-110 nm mekansal çözünürlükte iddia, gerçek örneklerinde elde pratik çözünürlük çok daha kötü olabilir. 4) içinde karşılaştırma için geleneksel mikroskobu, bu süper çözümleme teknikleri hala yürütülmesi konusunda zorluklar çok renkli, 3D veya hücre Imaging, tek başına veya birlikte yaşamak. Muhtemelen en önemlisi IMMUNO-altın EM ve süper çözümleme mikroskobu teknikleri nitel nicel yerelleştirme veri yerine verim.
Kısmen yukarıda belirtilen sorunları çözmek çalışırken, biz son zamanlarda Golgi protein yerelleştirme merkezleri kütlenin (ışık), sistematik ve kantitatif bir Golgi yerelleştirmek için Imaging tarafından adlı bir konvansiyonel ışık mikroskobu dayalı yöntem geliştirdik IMMUNO-altın EM7eşdeğer bir çözünürlükte protein. Bu yöntemde, kültürlü memeli hücrelerinde Golgi Golgi mini-yığınlar nocodazole, bir Mikrotubul depolymerizing ilaç tedavisi tarafından dağınık olduğunu. Nocodazole kaynaklı Golgi mini yığınlarının (bundan sonra Golgi mini-yığınlar) yakından organizasyon ve hücresel işlevler8,9,10yerli Golgi yığınlarda benzer kapsamlı çalışmalar göstermiştir, 11. Bir test protein yerelleştirme sayının (LQ) ışık elde edilebilir ve nicel alt-Golgi yerelleştirme gösterir. LQs sayısal değerler karşılaştırılabilir ve 25'ten fazla Golgi işaretlerinin LQ veritabanı mevcut olmuştur.
IŞIK içinde endojen veya exogenously ifade GM130, GalT-mCherry ve test protein (x) tarafından üç kez etiketli Golgi mini-yığınlar. GM130 ve GalT-mCherry, CIS- ve trans-Golgi işaretleri sırasıyla12,13, referans noktaları sağlamak. Üçlü Floresan, kırmızı (R), yeşil (G) ve far-red (B), yapay olarak kırmızı, yeşil ve mavi sırasıyla görüntülenir. Merkezi Floresans kitle (bundan sonra Merkezi) alt piksel çözünürlük elde etmek için kabul edilir. Golgi eksen GalT-mCherry olan için GM130 merkezi üzerinden vektör olarak tanımlanır. Golgi Mini yığın Golgi ekseni etrafında sonsuz dönme simetri ile silindirik yapısı olarak modellenmiştir. Bu nedenle, Golgi Mini yığını daha fazla Golgi eksen boyunca tek boyutlu bir yapı olarak modellenebilir. LQ testi protein x dx/d1dx olduğu x merkezine uzaklik bu GM130, d1 GM130 olan için merkezi GalT-mCherry dan mesafe olsa, olarak tanımlanır. X Merkezi Eksen dışı projeksiyon Aksiyel uzaklığı hesaplama için kullanılır. Golgi eksen, Aksiyel açı, dx, d1, açı α ve β açısı, ışık için de dahil olmak üzere değişkenler, şematik Resim 1' de gösterilmiştir. LQ Golgi Aksiyel açısı bağımsız olsa da Golgi mini-yığınlar rastgele bir hücreye yönlendirmek.
Golgi mini-yığınlar Albümdeki inhomogeneous görünür. Analyzable Golgi mini-yığınlar ışık için seçmek için üç ölçüt geliştirdik. 1) sinyal-gürültü oranı kriteri, hangi ≥ 30 her kanaldaki arka plan standart sapma (SD) Golgi Mini yığıta toplam yoğunluğunu oranıdır. Bu ölçüt Merkezi kütlenin, Golgi mini-yığınlar sinyal noise oranları üzerinde bağlıdır konumlandırma doğruluğunu sağlamaktır. 2) d1≥ 70 gerektirir Aksiyel açı ya da mesafe kriteri, nm. d1 Golgi Aksiyel açısı artış ile azalır. Ne zaman Aksiyel açı 90 ° yaklaşıyor ya da dikey, Mini yığını d1 sigara çözülebilir olur 0 yaklaşıyor. d1≥ 70 nm etkili bir şekilde dikey Golgi mini-yığınlar hariç. 3) co-doğrusallık ölçütü, hangi da | tan α | veya | tan β | ≤ 0,3 olduğunu. Bu ölçüt mini bir yığın üç Merkezi yeterince co-doğrusal Golgi Mini yığını için bizim tek boyutlu model olmasını sağlar. Tüm ışık mikroskoplar renk sapması olan kırmızı, yeşil ve far-red floresan merkezleri göreli konumları ciddi deforme edebilirsiniz acı. Renk sapmaları mikroskop sistemlerinin deneysel olarak kırmızı, yeşil ve far-red floresan tarafından üç kez etiketli 110 nm boncuk Imaging tarafından kalibre edilmiş. Her boncuk görüntüsünün kırmızı merkezi boncuk gerçek konumunu tanımlanır ve Kromatik vardiya-yeşil ve far-red merkezleri tarafından birinci dereceden polinom fonksiyonların donatılmıştır. Golgi mini-yığınlar merkezlerinden Kromatik yeşil ve far-red Kanallar olarak kaydırır düzeltmek için polinom fonksiyonların tabi.
IŞIK ile a kararlılık-in elde edebilirsiniz ~ 30 nm standart koşullar altında Golgi eksen boyunca. Önemlisi, kantitatif Golgi protein var eşlemek için uyguladıkları bir yöntem sağlar. IŞIK geleneksel mikroskoplar, geniş alanlı gibi veya confocal mikroskoplar, ortak Floresans etiketleme iletişim kuralları kullanılarak gerçekleştirilebilir. Görüntüleme ve veri işleme gibi bir saat gibi kısa sürebilir. IŞIK, biz doğrudan salgı kargo aşamalı geçiş CIS- transiçin göstermiştir-Golgi7yan.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td class="xl67">fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads</td>
			<td class="xl67">Invitrogen</td>
			<td class="xl75">T7279</td>
			<td class="xl67">As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">Glass coverslip &#934; 12 mm (No. 1.5)</td>
			<td class="xl67">Menzel</td>
			<td class="xl75">CB00120RAC</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">Glass coverslip &#934; 25 mm (No. 1.5)</td>
			<td class="xl67">Menzel</td>
			<td class="xl75"></td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">DMEM</td>
			<td class="xl67">Capricon</td>
			<td class="xl75">DMEM-HPA-P50</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">Trypsin-EDTA</td>
			<td class="xl67"></td>
			<td class="xl75"></td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">FBS</td>
			<td class="xl67">GE Hyclone</td>
			<td class="xl75">SV30160.03</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">Nocodazole</td>
			<td class="xl67">Merck</td>
			<td class="xl75">487928</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000</td>
			<td class="xl67">Invitrogen</td>
			<td class="xl75">11668-019</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">transfection medium. Commercial name: OptiMEM</td>
			<td class="xl67">Invitrogen</td>
			<td class="xl75">31985070</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">TPST1-EGFP</td>
			<td class="xl67">Addgene</td>
			<td class="xl75">66617</td>
			<td class="xl67">A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">GalT-mCherry</td>
			<td class="xl67"></td>
			<td class="xl75"></td>
			<td class="xl67">Made in our lab.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">paraformaldehyde</td>
			<td class="xl67">Merck</td>
			<td class="xl75">1.04005.1000</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">saponin</td>
			<td class="xl67">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl75">47036</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488</td>
			<td class="xl67">CALBIOCHEM</td>
			<td class="xl75">475904</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">BSA</td>
			<td class="xl67">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl75">A9647</td>
			<td class="xl67"></td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">Mouse anti-GM130</td>
			<td class="xl67">BD Biosciences</td>
			<td class="xl75">610823</td>
			<td class="xl67">Primary antibody for human GM130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td class="xl67">far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG</td>
			<td class="xl67">Invitrogen</td>
			<td class="xl75">A-21235</td>
			<td class="xl67">Far red fluorescence conjugated secondary antibody</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative localization of a golgi protein by imaging its center of fluorescence mass

CISdahil olmak üzere alt-Golgi bölgelere daha fazla sınıflandırılabilir seri olarak yığılmış membran cisternae Golgi kompleksi oluşur-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi ve trans-Golgi ağ. Golgi hücresel işlevlerini kendi ikamet proteinler karakteristik dağıtım tarafından belirlenir. Konvansiyonel ışık mikroskobu Uzaysal çözünürlük alt-Golgi yapısı veya cisternae gidermek için çok düşüktür. Böylece, IMMUNO-altın elektron mikroskopi sub-Golgi düzeyinde bir protein yerelleştirmek için seçim yöntemidir. Ancak, teknik ve araç çoğu hücre biyolojisi laboratuvarları yeteneği vardır. Biz burada Golgi protein yerelleştirme merkezleri kütlenin (ışık) sistematik ve kantitatif Golgi protein yerelleştirmek için Imaging tarafından denilen bizim son zamanlarda geliştirilen süper çözümleme yöntemi açıklanmaktadır. IŞIK standart floresan etiketleme iletişim kuralları ve geleneksel geniş-alan veya confocal mikroskoplar üzerinde temel alır. Shift renk sapmaları mikroskobik sistem, resim alma ve sonrası edinme analiz kalibrasyonu içerir. Bir test protein alt-Golgi lokalizasyonu kantitatif yerelleştirme bölüm ifade edilir. IŞIK dört ana avantajı vardır; hızlı, geleneksel yöntemler ve araçlar dayalı, yerelleştirme sonucudur nicel ve bu tanıyor ~ 30 nm pratik çözünürlük Golgi eksen boyunca. Burada bir test Golgi protein yerelleştirmek için ışık detaylı Protokolü açıklar.

Bizim laboratuarda kullanılan gibi bir planı apochromatic objektifle donatılmış modern araştırma sınıf ışık mikroskobu çok az renk sapmaları (Şekil 2A) gösterir. Ancak, dikkatli bir muayene çok renkli floresan boncuk görüntünün üst karakter aynı boncuk (Şekil 2B) farklı renk görüntülerin ortaya çıkarabilir. Biz kırmızı kanalı renk sapmaları özgür ve bu nedenle...

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass at JoVE.com

Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass

Golgi sakinlerinin kesin yerelleştirme Golgi hücresel işlevlerini anlamak için önemlidir. Ancak, geleneksel optik mikroskobu alt-Golgi yapısı dönüştürememiş demektir. Burada iletişim kuralı için kantitatif bir protein alt-Golgi yerelleştirme belirlemek geleneksel mikroskobu dayalı süper çözümleme yöntemi açıklanmaktadır.

Floresans Merkezi kütlesi Imaging tarafından Golgi protein nicel yerelleştirme

The Golgi complex consists of serially stacked membrane cisternae which can be further categorized into sub-Golgi regions, including the cis-Golgi, ...

Research

JoVE Journal

Biology

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Nicel Değerlendirme Elektrosprey İyonizasyon Kütle Spektrometresi kullanarak Maya Lipidome

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Zaman atlamalı Görüntüleme siRNA Transfeksiyon sonra Mitoz

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Yapısal Kütle Spektrometresi büyük protein kompleksleri Analiz

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

A Protocol for the Identification of Protein-protein Interactions Based on 15N Metabolic Labeling, Immunoprecipitation, Quantitative Mass Spectrometry and Affinity Modulation

Dayanarak protein-protein etkileşimleri ve kimliği için bir protokol<sup&gt; 15</sup&gt; K Metabolik Etiketleme, immünopresipitasyon, Kantitatif Kütle Spektrometrisi ve Affinity Modülasyon

Protein-protein interactions are fundamental for many biological processes in the cell. Therefore, their characterization plays an important role in ...

Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy

Gelişmiş 3D Floresan Mikroskobu kullanılarak Otofaji Kantitatif Analiz

Prostate cancer is the leading form of malignancies among men in the U.S. While surgery carries a significant risk of impotence and incontinence, ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Bimoleküler Floresan tamamlama akışı Sitometrik Analizi: Protein-protein etkileşim Eğitim Bir Yüksek Verimli Kantitatif Yöntemi

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Hızlı Analiz ve Floresans Mikroskopi Görüntüler Exploration

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Characterization of G Protein-coupled Receptors by a Fluorescence-based Calcium Mobilization Assay

Bir floresan bazlı Kalsiyum Mobilizasyon Deneyi G proteini ile birleştirilmiş alıcıların karakterizasyonu

For more than 20 years, reverse pharmacology has been the preeminent strategy to discover the activating ligands of orphan G protein-coupled receptors ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...