Name: advanced confocal microscopy techniques to study protein-protein interactions and kinetics at dna lesions
Uploaded: 2017-11-12T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions at JoVE.com

Diese Arbeit wurde von der Grant-Agentur der Tschechischen Republik, Projekt P302-12-G157 unterstützt. Experimente wurden auch von der Tschechisch-Norwegisch Forschung Programm CZ09, die von norwegischen Fonds und durch das Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik betreut wird unterstützt (gewähren Nummer: 7F14369).

1. Anbau von Zell-Linien <ol><li>HeLa-abgeleitete Zellinien Hinweis: Verwendung HeLa zervikalen Karzinomzellen: entweder stabil auszudrücken Histon H2B HeLa-Zellen mit dem Stichwort GLP oder HeLa-Fucci Zellen mit dem Ausdruck RFP-Cdt1 in der G1 und frühen S-Phase und GLP-Geminin in den S/G2-M-Phasen ( Abbildung 1).
	<ol><li>Für den Anbau alle HeLa-abgeleitete Zellinien verwenden Dulbecco &#39; s geändert Eagle &#39; s Medium (DMEM) mit 10 % fötalen Rinderserum ...

<ol>
	<li>Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+damage+to+cellular+DNA:+direct+and+photosensitized+reactions.">Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions.</a> Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).</li><li>Cooke, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+detection+of+UV-induced+DNA+damage+and+repair.">Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair.</a> J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).</li><li>Lahtz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma+irradiation+does+not+induce+detectable+changes+in+DNA+methylation+directly+following+exposure+of+human+cells.">Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells.</a> PLoS One. 7 (9), e44858 (2012).</li><li>Cremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+chromosome+aberrations+in+the+human+interphase+nucleus+by+visualization+of+specific+target+DNAs+with+radioactive+and+non-radioactive+in+situ+hybridization+techniques:+diagnosis+of+trisomy+18+with+probe+L1.84.">Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84.</a> Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).</li><li>Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+UV+microirradiation+of+interphase+nuclei+and+post-treatment+with+caffeine.+A+new+approach+to+establish+the+arrangement+of+interphase+chromosomes.">Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes.</a> Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).</li><li>Bartova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Oct4+protein+to+UV-damaged+chromatin+in+embryonic+stem+cells.">Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (12), e27281 (2011).</li><li>Stixova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1beta-dependent+recruitment+of+UBF1+to+irradiated+chromatin+occurs+simultaneously+with+CPDs.">HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs.</a> Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39 (2014).</li><li>Stixova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+microscopy+techniques+used+for+comparison+of+UVA-+and+gamma-irradiation-induced+DNA+damage+in+the+cell+nucleus+and+nucleolus.">Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus.</a> Folia Biol (Praha). 60, 76-84 (2014).</li><li>Luijsterburg, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+protein+1+is+recruited+to+various+types+of+DNA+damage.">Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage.</a> J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).</li><li>Bartova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coilin+is+rapidly+recruited+to+UVA-induced+DNA+lesions+and+gamma-radiation+affects+localized+movement+of+Cajal+bodies.">Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies.</a> Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).</li><li>Franek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+Image+Acquisition+and+Analytical+Techniques+for+Studies+of+Living+Cells+and+Tissue+Sections.">Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections.</a> Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).</li><li>Lemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+conventional+fluorescent+markers+for+far-field+fluorescence+localization+nanoscopy+allows+resolution+in+the+10-nm+range.">Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range.</a> J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).</li><li>Reits, E. A., Neefjes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fixed+to+FRAP:+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells.">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).</li><li>Lakowitz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).</li><li>Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+and+polarization-resolved+imaging+in+cell+biology.">Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology.</a> Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+properties+of+aequorin,+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan,+Aequorea.">Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).</li><li>Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+cellular+proteins+that+bind+to+wild-type+but+not+mutant+p53.">Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Binding+protein+53BP1+is+required+for+DNA+damage+responses+and+tumor+suppression+in+mice.">p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice.</a> Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).</li><li>Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+order+in+HeLa+cells+changes+during+mitosis+and+early+G1,+but+is+stably+maintained+during+subsequent+interphase+stages.">Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages.</a> J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+silhouette+of+individual+cells+in+S/G2/M+phases+with+fluorescence.">Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence.</a> Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).</li><li>Sorokin, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+movement+and+morphology+of+UBF1-positive+nucleolar+regions+are+changed+by+gamma-irradiation+in+G2+phase+of+the+cell+cycle.">Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle.</a> Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).</li><li>Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+heterogeneity+and+dark+acceptor+states+on+FRET:+implications+for+using+fluorescent+protein+donors+and+acceptors.">The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors.</a> PLoS One. 7 (11), e49593 (2012).</li><li>Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+detectors+improved+time-lapse+confocal+microscopy+of+PML+and+53BP1+nuclear+body+colocalization+in+DNA+lesions.">Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions.</a> Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).</li><li>Suchankova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+kinetics+of+DNA+repair+protein+accumulation+at+DNA+lesions+and+cell+cycle-dependent+formation+of+gammaH2AX-+and+NBS1-positive+repair+foci.">Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci.</a> Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).</li><li>B&#225;rtov&#225;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCNA+is+recruited+to+irradiated+chromatin+in+late+S+phase+and+is+most+pronounced+in+G2+phase+of+the+cell+cycle.">PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle.</a> Protoplasma. , (2017).</li><li>Krejci, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Translational+Modifications+of+Histones+in+Human+Sperm.">Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm.</a> J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).</li><li>Chou, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromatin+localization+screen+reveals+poly+(ADP+ribose)-regulated+recruitment+of+the+repressive+polycomb+and+NuRD+complexes+to+sites+of+DNA+damage.">A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).</li><li>Sustackova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation-dependent+nuclear+arrangement+and+recruitment+of+BMI1+protein+to+UV-damaged+chromatin.">Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin.</a> J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).</li><li>Smirnov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+replication+and+transcription+domains+in+nucleoli.">Separation of replication and transcription domains in nucleoli.</a> J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).</li><li>Bastiaens, P. I., Squire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+spatial+resolution+of+biochemical+processes+in+the+cell.">Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell.</a> Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).</li><li>Day, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+interactions+using+Forster+resonance+energy+transfer+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy.">Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Methods. 66 (2), 200-207 (2014).</li><li>Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+multiphoton+cryomicroscopy.">High-resolution multiphoton cryomicroscopy.</a> Methods. 66 (2), 230-236 (2014).</li></ol>

Mikroskopiertechniken stellen grundlegende Werkzeuge in den Forschungslabors. Hier eine kurze Beschreibung der Methoden für die Untersuchung von Protein-Einstellung verwendet und Kinetik bei DNA-Läsionen wird vorgestellt. Wir vor allem unsere experimentelle Erfahrung auf dem Gebiet der lokalen Microirradiation lebender Zellen zur Kenntnis genommen, und wir besprechen die Untersuchung von Protein-Kinetik von FRAP und Protein-Protein Interaktion auf DNA-Läsionen mit Akzeptor-bleichen Bund28 und s...

DNA-Schädigung führt zum Auftreten von bestehend aus Cyclobutan Pyrimidine Dimere (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine und Einzel-Strang DNA-Läsionen oder Doppel-Strang bricht1,2. Γ-Strahlen sind die Form von ionisierender Strahlung mit der höchsten Energie und hohe Penetranz, damit diese Quelle der Strahlung ist weit verbreitet in Strahlentherapie3. Auf der anderen Seite induziert experimentell DNA-Schäden durch UV-Laser imitiert natürliche Belichtung mit UV-Licht. UVA-Microirradiation darstellt als eine mikroskopische Methode, ein experimentelles Werkzeug zur Untersuchung von DNA-Schäden in einzelne lebende Zellen. Microirradiation wurde erstmals vor 40 Jahren verwendet, um die Organisation von Chromosom Regionen4,5zu offenbaren. Diese Technik ist stark abhängig von entweder die funktionellen Eigenschaften der konfokalen Mikroskopen oder die technischen Grenzen des modernen Nanoskopie. DNA-Läsionen zu induzieren, können Zellen durch 5' Bromodeoxyuridine (BrdU) oder Hoechst 33342 vor UV-Bestrahlung presensitized. Bártová Et al. 6 zuvor beschrieben die presensitization Schritt, und vor kurzem haben wir diese Microirradiation-Technik zur Vermeidung von Zelltod oder Apoptose optimiert. Beispielsweise führt der Einsatz von 405nm UV Laser (ohne Hoechst 33342 Presensitization) zur Induktion von 53BP1-positiven Doppel-Strangbrüchen (DSB) auf Kosten von Cyclobutan Pyrimidine Dimere (CPDs). Auf der anderen Seite presensitization Schritte in Kombination mit UV-Microirradiation verursachen sehr hohe CPDs und DSB gleichzeitig7,8. Diese Methodik ist schwierig, auf die Studie eines einzelnen DNA-Reparatur-Signalwegs anzuwenden.
Mit Microirradiation ist es möglich, Protein-Rekrutierung, Kinetik und Interaktion auf DNA-Läsionen in lebenden Zellen zu analysieren. Ein Beispiel für diese Methode wurde von Luijsterburg Et Al. veröffentlicht. 9 für Heterochromatin Protein 1β, und wir zeigten vor kurzem zum ersten Mal, das der Pluripotenz Faktor Oct4 und ein Protein assoziiert mit Cajal Körpern, coilin, UV-induzierten DNA-Läsionen6,10eingestellt werden. Protein-Kinetik bei dieser DNA-Läsionen können auch untersucht werden, mit Hilfe der FRAP (Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz)11,12,13 oder FRET (Fluoreszenz Resonanz Energietransfer) Techniken14 ,15. Diese Methoden haben das Potenzial, einfache Diffusion von Proteinen an DNA-Läsionen oder Protein-Protein-Wechselwirkungen zu offenbaren. Ein nützliches Werkzeug für zusätzliche Charakterisierung von Proteinen ist FLIM (Fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy) oder die Kombination mit Bund Technologie (Bund-FLIM)16. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung von Prozessen in lebenden Zellen, die stabil sind oder vorübergehend mit dem Ausdruck des Proteins des Interesses von ein fluoreszierendes Molekül17getaggt. Hier ist ein Beispiel für exponentielle Abfallzeit (τ) für GLP-Tags p53 Protein und seine Interaktionspartner, mCherry Verschlagwortet mit 53BP1, spielen eine wichtige Rolle im DNA-Schaden Antwort18,19 . Der Parameter τ ist die Lebensdauer der Fluorochrom von FLIM Berechnungen zur Verfügung gestellt spezifisch für einen bestimmten Fluoreszenz-Farbstoff, seine Bindung-Fähigkeiten und seiner zellulären Umgebung. Daher kann diese Methode uns Unterscheidungen zwischen Protein Subpopulationen, ihre Bindung Fähigkeiten und ihre funktionellen Eigenschaften nach, z. B. DNA-Schäden zeigen.
Hier ein Überblick über die methodischen Ansätze der moderne Mikroskopiertechniken, die in unserem Labor verwendet wird, um Zeit-spezifischen Protein Rekrutierung, Kinetik, Diffusion und Protein-Protein-Interaktionen auf dem Gelände von Microirradiated Chromatin zu studieren wird vorgestellt. Die Schritt für Schritt Methode für die Induktion von lokalen DNA-Läsionen in lebenden Zellen und eine Beschreibung der Methoden, die nützlich für die Studien von DNA-Schäden im Zusammenhang mit Veranstaltungen im lokal induzierte DNA-Läsionen verursacht durch UV-Laser sind vorgegeben.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell cultivation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES-D3 [D3]</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11632TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa -Fucci cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>PAN-Biotech</td>
			<td>P03-0710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30180.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES Cell FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16141-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTG (1-Thioglycerol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>XC-A4122/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - EDTA</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>XC-T1717/100</td>
			<td>dilute with 1 &#215; PBS in ratio 1:6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon cell culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7866</td>
			<td>cultivation of mESCs D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Dish 35m+A15:I35m Grid-500</td>
			<td>Ibidi GmbH</td>
			<td>81166</td>
			<td>microscopic dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2% Gelatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-100G</td>
			<td>dilute in destille water and autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-p53 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-PCNA plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universit&#228;t Darmstadt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-53BP1 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>19835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metafecetene</td>
			<td>Biontex Laboratories GmbH</td>
			<td>T020&#8211;2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#215; PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>for transfection use 1 &#215; PBS diluted in nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#8217;-deoxy-uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11296736001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White-light laser</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>355-nm laser</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td>laser power 80 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405-nm laser</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>laser power 50 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunofluorescence staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>631-1580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943 1 LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2194854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin from quillaja bark</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>53BP1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21083</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluore 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27040</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories Ltd</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced confocal microscopy techniques to study protein-protein interactions and kinetics at dna lesions

Lokale Microirradiation mit Lasern stellt ein nützliches Werkzeug für Studien zur DNA-Reparatur-bezogenen Prozesse in lebenden Zellen. Hier beschreiben wir einen methodischen Ansatz zur Analyse von Protein-Kinetik bei DNA-Läsionen über Zeit oder Proteinprotein Interaktionen auf lokal Microirradiated Chromatin. Wir zeigen auch, wie zu erkennen, einzelne Phasen des Zellzyklus mit dem Fucci zellulären System Zelle-Zyklus-abhängige Protein Kinetik bei DNA-Läsionen zu studieren. Eine methodische Beschreibung des Einsatzes von zwei UV-Lasern (355 nm und 405 nm), verschiedene Arten von DNA-Schäden zu induzieren auch vorgestellt. Nur die Zellen Microirradiated von 405 nm Diodenlaser führte normalerweise durch Mitose und waren frei von Cyclobutan Pyrimidine Dimere (CPDs). Wir zeigen auch, wie Microirradiated Zellen zu einem gegebenen Zeitpunkt auszuführende Immunodetection der körpereigene Proteine des Interesses behoben werden können. Für die DNA-Reparatur-Studien, beschreiben wir zusätzlich die Verwendung von biophysikalischen Methoden einschließlich FRAP (Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz) und FLIM (Fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy) in Zellen mit spontan auftretender DNA Beschädigung Brennpunkte. Wir zeigen auch eine Anwendung der FLIM-FRET (Fluoreszenz Resonanz Energietransfer) in experimentellen Studien von Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Verwenden erweiterte konfokalen Mikroskopie, beobachteten wir eine Ansammlung von mCherry-Tags 53BP1 und mCherry-PCNA Proteine bei der DNA-Läsionen. Analysen wurden von lokalen Microirradiation von lebenden Zellen durchgeführt. Der nuklearen Verteilungsmuster der DNA-Reparatur-Proteine in einzelne Zellzyklus Phasen zu erkennen, wir nutzten die Fucci zelluläre System, mit dem es möglich festzustellen, die G1, frühen S, ist und G2-Phasen der Zelle Zyklus (Abbildung...

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Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Laser Microirradiation ist ein nützliches Werkzeug für Studien zur DNA-Reparatur in lebenden Zellen. Ein methodischer Ansatz für die Nutzung der UVA Laser induzieren verschiedene DNA-Läsionen wird angezeigt. Wir haben eine Methode zur lokalen Microirradiation optimiert, die den normalen Zellzyklus unterhält; so fahren Sie bestrahlte Zellen durch Mitose.

Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-Protein-Wechselwirkungen In vivo</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

Forschung

Biologie

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluoreszenz-basierte Messung von Calcium-Shop-Eintrag in lebenden Zellen: aus kultivierten Krebszelle zu Skelettmuskelfaser

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Die MultiBac Protein Complex Produktion Platform am EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Durchflusszytometrieanalyse bimolekularer Fluorescence Komplementierung: A High Throughput Quantitative Methode zur Protein-Protein Interaction Study

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Analyse Craniofacial Morphogenese in Zebrafisch Mit 4D konfokale Mikroskopie

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen Mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

Die Kombination von Einzelmolekül-Imaging und Manipulation für das Studium der Protein-DNA-Wechselwirkungen

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

Probing hoher Dichte Funktionale Protein-Microarrays, um Protein-Protein Wechselwirkungen erkennen

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in der Autophagie-Forschung

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

FLIM-FRET Messungen von Protein-Protein-Wechselwirkungen in lebenden Bakterien.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...