Name: advanced confocal microscopy techniques to study protein-protein interactions and kinetics at dna lesions
Uploaded: 2017-11-12T13:00:00
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이 작품의 체코 공화국, 프로젝트 P302-12-G157 부여 기관에 의해 지원 되었다. 실험 또한 체코 노르웨이어 연구 프로그램 CZ09, 노르웨이 자금, 그리고 교육, 청소년 및 스포츠의 체코 공화국에 의해 감독에 의해 지원 되었다 (허가 번호: 7F14369).

1. 재배의 셀 라인 <ol><li>헬러 파생 셀 라인 참고: 사용 헬러 자 궁 경부 암 세포: 히스톤 H2B 안정적으로 표현 하거나 HeLa 세포 GFP 또는 헬러 Fucci 셀 RFP Cdt1 표현 태그 g 1와 이른 S 단계 및 GFP geminin S/g 2-M 단계 ( 그림 1)에서
	<ol><li>모든 헬러 파생 셀 라인의 경작, 사용 Dulbecco &#39; s 수정이 글 &#39; s 매체 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 5% CO 2를 포함 하는 ...

<ol>
	<li>Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoinduced+damage+to+cellular+DNA:+direct+and+photosensitized+reactions.">Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions.</a> Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).</li><li>Cooke, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunochemical+detection+of+UV-induced+DNA+damage+and+repair.">Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair.</a> J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).</li><li>Lahtz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gamma+irradiation+does+not+induce+detectable+changes+in+DNA+methylation+directly+following+exposure+of+human+cells.">Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells.</a> PLoS One. 7 (9), e44858 (2012).</li><li>Cremer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+chromosome+aberrations+in+the+human+interphase+nucleus+by+visualization+of+specific+target+DNAs+with+radioactive+and+non-radioactive+in+situ+hybridization+techniques:+diagnosis+of+trisomy+18+with+probe+L1.84.">Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84.</a> Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).</li><li>Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+UV+microirradiation+of+interphase+nuclei+and+post-treatment+with+caffeine.+A+new+approach+to+establish+the+arrangement+of+interphase+chromosomes.">Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes.</a> Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).</li><li>Bartova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+Oct4+protein+to+UV-damaged+chromatin+in+embryonic+stem+cells.">Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (12), e27281 (2011).</li><li>Stixova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HP1beta-dependent+recruitment+of+UBF1+to+irradiated+chromatin+occurs+simultaneously+with+CPDs.">HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs.</a> Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39 (2014).</li><li>Stixova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+microscopy+techniques+used+for+comparison+of+UVA-+and+gamma-irradiation-induced+DNA+damage+in+the+cell+nucleus+and+nucleolus.">Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus.</a> Folia Biol (Praha). 60, 76-84 (2014).</li><li>Luijsterburg, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+protein+1+is+recruited+to+various+types+of+DNA+damage.">Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage.</a> J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).</li><li>Bartova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coilin+is+rapidly+recruited+to+UVA-induced+DNA+lesions+and+gamma-radiation+affects+localized+movement+of+Cajal+bodies.">Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies.</a> Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).</li><li>Franek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+Image+Acquisition+and+Analytical+Techniques+for+Studies+of+Living+Cells+and+Tissue+Sections.">Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections.</a> Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).</li><li>Lemmer, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+conventional+fluorescent+markers+for+far-field+fluorescence+localization+nanoscopy+allows+resolution+in+the+10-nm+range.">Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range.</a> J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).</li><li>Reits, E. A., Neefjes, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fixed+to+FRAP:+measuring+protein+mobility+and+activity+in+living+cells.">From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells.</a> Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).</li><li>Lakowitz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).</li><li>Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+and+polarization-resolved+imaging+in+cell+biology.">Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology.</a> Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).</li><li>Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extraction,+purification+and+properties+of+aequorin,+a+bioluminescent+protein+from+the+luminous+hydromedusan,+Aequorea.">Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea.</a> J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).</li><li>Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+cellular+proteins+that+bind+to+wild-type+but+not+mutant+p53.">Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+Binding+protein+53BP1+is+required+for+DNA+damage+responses+and+tumor+suppression+in+mice.">p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice.</a> Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histone-GFP+fusion+protein+enables+sensitive+analysis+of+chromosome+dynamics+in+living+mammalian+cells.">Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells.</a> Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).</li><li>Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosome+order+in+HeLa+cells+changes+during+mitosis+and+early+G1,+but+is+stably+maintained+during+subsequent+interphase+stages.">Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages.</a> J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).</li><li>Sakaue-Sawano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracing+the+silhouette+of+individual+cells+in+S/G2/M+phases+with+fluorescence.">Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence.</a> Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).</li><li>Sorokin, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+movement+and+morphology+of+UBF1-positive+nucleolar+regions+are+changed+by+gamma-irradiation+in+G2+phase+of+the+cell+cycle.">Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle.</a> Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).</li><li>Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+heterogeneity+and+dark+acceptor+states+on+FRET:+implications+for+using+fluorescent+protein+donors+and+acceptors.">The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors.</a> PLoS One. 7 (11), e49593 (2012).</li><li>Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+detectors+improved+time-lapse+confocal+microscopy+of+PML+and+53BP1+nuclear+body+colocalization+in+DNA+lesions.">Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions.</a> Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).</li><li>Suchankova, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+kinetics+of+DNA+repair+protein+accumulation+at+DNA+lesions+and+cell+cycle-dependent+formation+of+gammaH2AX-+and+NBS1-positive+repair+foci.">Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci.</a> Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).</li><li>B&#225;rtov&#225;, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCNA+is+recruited+to+irradiated+chromatin+in+late+S+phase+and+is+most+pronounced+in+G2+phase+of+the+cell+cycle.">PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle.</a> Protoplasma. , (2017).</li><li>Krejci, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-Translational+Modifications+of+Histones+in+Human+Sperm.">Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm.</a> J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).</li><li>Chou, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromatin+localization+screen+reveals+poly+(ADP+ribose)-regulated+recruitment+of+the+repressive+polycomb+and+NuRD+complexes+to+sites+of+DNA+damage.">A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).</li><li>Sustackova, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylation-dependent+nuclear+arrangement+and+recruitment+of+BMI1+protein+to+UV-damaged+chromatin.">Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin.</a> J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).</li><li>Smirnov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Separation+of+replication+and+transcription+domains+in+nucleoli.">Separation of replication and transcription domains in nucleoli.</a> J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).</li><li>Bastiaens, P. I., Squire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+spatial+resolution+of+biochemical+processes+in+the+cell.">Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell.</a> Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).</li><li>Day, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+interactions+using+Forster+resonance+energy+transfer+and+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy.">Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Methods. 66 (2), 200-207 (2014).</li><li>Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+multiphoton+cryomicroscopy.">High-resolution multiphoton cryomicroscopy.</a> Methods. 66 (2), 230-236 (2014).</li></ol>

현미경 검사 법 기술 연구 실험실에서 기본 도구를 나타냅니다. 여기, 단백질 모집의 연구에 대 한 사용 하는 방법에 대 한 간략 한 설명을 하 고 속도 론 DNA 병 변에서 선물 된다. 우리는 특히 살아있는 세포의 지역 microirradiation의 분야에서 우리의 실험 경험을 언급 하 고 우리가 FRAP 및 단백질-단백질 상호 작용 수락자 표백 무서 워28 에 의해 DNA 병 변 및 그것의 첨단에 의해 단백?...

구성 된 cyclobutane pyrimidine 이합체 (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine, 및 단일 가닥 DNA 변의 모양을 이끌어 DNA 손상 또는 더블-스트랜드 나누기1,2. Γ 광선은 높은 에너지와 높은 penetrance 이온화 방사선의 형태, 따라서 방사선의이 소스는 방사선 치료3에서 널리 이용 된다. 다른 한편으로, 실험적으로 UV 레이저 모방 자연 UV 빛에 노출으로 인 한 DNA 손상을 유도 한다. 현미경 방법으로 UVA microirradiation은 개별 살아있는 세포에서 DNA 손상 연구 실험 도구를 나타냅니다. Microirradiation은 염색체 지구4,5의 조직 공개 40 년 전에 처음으로 사용 되었다. 이 기술은 매우 중 confocal 현미경의 기능 특성 또는 현대 nanoscopy의 기술적인 한계에 종속 됩니다. DNA 병 변을 유도 하 세포 5' bromodeoxyuridine (BrdU) 또는 Hoechst 33342 UV 조사 전에 presensitized 수 있습니다. Bártová 외. 6 이전 presensitization 단계를 설명 하 고 최근 우리 세포 죽음, 또는 apoptosis를 피하기 위하여이 microirradiation 기술에 최적화 된. 예를 들어 (Hoechst 33342 presensitization) 없이 405 nm 자외선 레이저를 사용 하 여 53BP1-긍정적인 이중 가닥 틈 (DSBs)의 유도 cyclobutane pyrimidine 이합체 (CPDs)의 비용으로 리드. 다른 한편으로, UV microirradiation와 함께 presensitization 단계 유도 CPDs과 DSBs의 매우 높은 수준을 동시에7,8. 이 방법은 단일 DNA 수 선 통로의 연구에 적용 하기가 어렵습니다.
Microirradiation, 단백질 모집, 활동, 및 살아있는 세포 병 변 DNA에서 상호 작용 분석 가능 하다. 이 방법의 예로 Luijsterburg 그 외 여러분 에 의해 출판 되었음 9 섬으로 단백질 1β, 그리고 우리에 대 한 최근 pluripotency 요소 Oct4 Cajal 몸, coilin와 관련 된 단백질 DNA UV 유도 된 병 변6,10모집은 처음으로 나타났다. 단백질이 DNA 병 변에서 활동 또한 FRAP (복구 후 Photobleaching 형광)11,,1213 를 사용 하 여 공부 될 수 있다 또는 (형광 공명 에너지 전송) 기술14 무서 워 ,15. 이러한 방법은 병 변 DNA 또는 단백질 단백질 상호 작용 단백질의 간단한 확산을 가능성이 있다. 단백질의 추가 특성에 대 한 유용한 도구가입니다 FLIM (형광 일생 화상 현미경) 또는 그것의 함께 무서 워 기술 (무서 워-FLIM)16. 이 메서드는 셀을 안정적으로 생활 또는 형광 분자17에 의해 표를 붙인 관심사의 단백질을 뚜렷이 표현 프로세스의 연구를 사용. 여기, GFP 태그 p53 단백질 및 그것의 상호 작용 협동자, mCherry 태그 53BP1, DNA 손상 응답18,19 에 있는 중요 한 역할에 대 한 지 수 감퇴 시간 (τ)의 예가 표시 됩니다. 매개 변수 τ FLIM 계산에서 제공 하는 형광 색소의 일생은 주어진된 형광 염료, 그것의 바인딩 능력 및 그것의 세포질 환경에 대 한 특정 이다. 따라서,이 방법은 표시할 수 있습니다 우리 단백질 부분 모집단, 그들의 바인딩 능력, 및 그들의 기능 속성 사이의 구분 후, 예를 들어 DNA 손상.
여기, 우리의 실험실에 시간 특정 단백질 모집, 속도 론, 확산, 및 microirradiated chromatin의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 공부 하는 데 사용 되는 고급 현미경 기술의 방법론 접근의 개요 제공 됩니다. 살아있는 세포에서 로컬 DNA 변의 유도 및 UV 레이저에 의해 발생 하는 로컬 유발된 DNA 병 변에서 DNA 손상 관련 이벤트의 연구에 대 한 유용한 방법론의 설명에 대 한 단계별 방법을 제공 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Cell cultivation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES-D3 [D3]</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-11632TM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa -Fucci cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>PAN-Biotech</td>
			<td>P03-0710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6429-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30180.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES Cell FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16141-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-Essential Amino Acids (NEAA)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>ESG1107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTG (1-Thioglycerol)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6145-25ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>XC-A4122/100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin - EDTA</td>
			<td>Biosera</td>
			<td>XC-T1717/100</td>
			<td>dilute with 1 &#215; PBS in ratio 1:6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon cell culture dishes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7866</td>
			<td>cultivation of mESCs D3 cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Dish 35m+A15:I35m Grid-500</td>
			<td>Ibidi GmbH</td>
			<td>81166</td>
			<td>microscopic dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2% Gelatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1890-100G</td>
			<td>dilute in destille water and autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell transfection</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GFP-p53 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>12091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-PCNA plasmid</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universit&#228;t Darmstadt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mCherry-53BP1 plasmid</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>19835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metafecetene</td>
			<td>Biontex Laboratories GmbH</td>
			<td>T020&#8211;2.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &#215; PBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM9625</td>
			<td>for transfection use 1 &#215; PBS diluted in nuclease-free water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-bromo-2&#8217;-deoxy-uridine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11296736001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscopy</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Leica TCS SP5</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope Leica TCS SP8</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>White-light laser</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>355-nm laser</td>
			<td>Coherent Inc.</td>
			<td></td>
			<td>laser power 80 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405-nm laser</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td>laser power 50 mW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunofluorescence staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslip</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>631-1580</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% paraformaldehyde</td>
			<td>Affymetrix</td>
			<td>19943 1 LT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2194854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin from quillaja bark</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>53BP1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab21083</td>
			<td>primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AlexaFluore 647</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A27040</td>
			<td>secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>Vector Laboratories Ltd</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced confocal microscopy techniques to study protein-protein interactions and kinetics at dna lesions

레이저와 로컬 microirradiation 라이브 세포에서 DNA 복구 관련 프로세스의 연구에 대 한 유용한 도구를 나타냅니다. 여기, 우리가 로컬로 microirradiated chromatin에서 시간 또는 단백질 단백질 상호 작용을 통해 단백질 DNA 병 변에서 활동을 분석 하는 방법론 접근 방식을 설명 합니다. 우리 또한 세포 주기 세포 주기 의존적인 단백질 DNA 병 변에서 속도 론을 공부 Fucci 셀룰러 시스템을 사용 하 여 개별 단계를 인식 하는 방법을 보여 줍니다. 2 자외선 레이저를 사용 하 여의 방법론 설명 (355 nm, 405 nm) 다른 유형의 DNA 손상 유도 하는 것 또한 제공 됩니다. 만 405 nm 다이오드 레이저 셀 microirradiated 유사 분열을 통해 정상적으로 진행 하 고 cyclobutane pyrimidine 이합체 (CPDs) 없는 했다. 우리는 또한 어떻게 microirradiated 셀 관심의 내 생 단백질의 immunodetection를 수행 하기 위해 주어진된 시간에 고쳐질 수 있다 보여줍니다. 또한 생물 방법 FRAP (복구 후 Photobleaching 형광) 및 FLIM (형광 일생 화상 현미경 검사 법)를 포함 하 여 자연 발생 된 셀에서의 사용 설명 DNA 수 선 연구, DNA 손상 포커스. 우리는 또한 단백질 단백질 상호 작용의 실험 연구에 FLIM-무서 워 (형광 공명 에너지 전송)의 응용 프로그램을 보여줍니다.

고급 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여, DNA 병 변에서 mCherry 태그의 53BP1 및 mCherry PCNA 단백질의 축적을 관찰 합니다. 분석은 살아있는 세포의 지역 microirradiation에 의해 수행 되었습니다. 우리는 초기 S, g 1을 확인 하는 Fucci 셀룰러 시스템을 사용 하는 개별 세포 주기 단계에서 DNA 복구 관련 단백질의 핵 배포 패턴을 인식 하 고 셀의 G2 단계 주기 (그림 1</stron...

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Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

레이저 microirradiation는 살아있는 세포에서 DNA 수리의 연구에 대 한 유용한 도구입니다. 다양 한 DNA 병 변 유발 하 UVA 레이저의 사용에 대 한 방법론 접근 표시 됩니다. 우리 지역 microirradiation; 정상적인 세포 주기를 유지 하는 방법을 최적화합니다 따라서, 비친된 세포 유사 분열을 통해 진행합니다.

고급 단백질 단백질 상호 작용 및 DNA 병 변에서 속도 론 연구에 Confocal 현미경 검사 법 기술

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Research

JoVE Journal

Biology

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

Imaging Protein-protein Interactions in vivo

이미징 단백질 - 단백질 상호 작용 생체내에</em

Protein-protein interactions are a hallmark of all essential cellular processes. However, many of these interactions are transient, or energetically weak, ...

연구

생물학

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

EMBL에서 MultiBac 단백질 복잡한 생산 플랫폼

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

4D 공 초점 현미경을 사용하여 제브라 피쉬의 두개 안면 형태 형성 분석

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Investigating Protein-protein Interactions in Live Cells Using Bioluminescence Resonance Energy Transfer

생물 발광 공명 에너지 전달을 이용하여 살아있는 세포에서 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사

Assays based on Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) provide a sensitive and reliable means to monitor protein-protein interactions in live ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

단백질-DNA 상호 작용의 연구에 대한 단일 분자 조작 및 이미지를 결합

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

고밀도 기능성 단백질 마이크로 어레이를 프로빙하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 검출하기

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...

Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

단백질 단백질 상호 작용 Autophagy 연구에서의 연구

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FLIM-FRET Measurements of Protein-Protein Interactions in Live Bacteria.

살아있는 박테리아에서 단백질 단백질 상호 작용의 FLIM-FRET 측정.

Protein-protein interactions (PPIs) control various key processes in cells. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) combined with F&#246;rster ...