Name: modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization
Uploaded: 2017-07-10T10:30:00
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Les auteurs reconnaissent le soutien de l&#39;installation partagée de l&#39;Université de Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral Oncology, soutenue en partie par le prix P30CA047904.

1. Extraction d&#39;ADN génomique <ol><li> Effectuer une extraction d&#39;ADN génomique à partir des cellules (ici, ligne cellulaire BJ-HTERT) à analyser à l&#39;aide d&#39;un kit commercial d&#39;extraction d&#39;ADN, conformément aux instructions du fabricant. </li><li> Mesurer la concentration d&#39;ADN avec un spectrophotomètre. Si la concentration d&#39;ADN est inférieure à 100 μg / mL, précipiter l&#39;ADN avec de l&#39;éthanol et ré-endiguer dans un volume de tampon TE (Tris-Cl 10 mM, EDTA 0,1 mM (...

<ol>
	<li>Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+telomeres+and+telomerase.">Analysis of telomeres and telomerase.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2003).</li><li>Mender, I., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+Restriction+Fragment+(TRF)+Analysis.">Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis.</a> Bio Protoc. 5 (22), (2015).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+and+Telomerase:+The+Means+to+the+End+(Nobel+lecture).">Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).</li><li>Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+Discovery:+The+Excitement+of+Putting+Together+Pieces+of+the+Puzzle+(Nobel+lecture).">Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).</li><li>Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Ends:+Just+the+Beginning+(Nobel+lecture).">DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).</li><li>Watson, J. M., Riha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres,+Aging,+and+Plants:+From+Weeds+to+Methuselah+-+A+Mini-Review.">Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review.</a> Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).</li><li>Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres-Structure,+Function,+and+Regulation.">Telomeres-Structure, Function, and Regulation.</a> Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).</li><li>MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+Regulation+from+Beginning+to+the+End.">Telomerase Regulation from Beginning to the End.</a> Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).</li><li>Fouquerel, E., Opresko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+The+Nobel+Fields+of+Telomere+Biology+and+DNA+Repair.">Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair.</a> Photochem Photobiol. , (2016).</li><li>Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+Cellular+Senescence.+Telomere+Shortening+as+a+Marker+of+Cellular+Senescence.">Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence.</a> Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).</li><li>Opresko, P. L., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere-Associated+Aging+Disorders.">Telomere-Associated Aging Disorders.</a> Ageing Res Rev. , 1568-1637 (2016).</li><li>Chiodi, I., Mondello, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+and+Telomerase+Stability+in+Human+Diseases+and+Cancer.">Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).</li><li>Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Telomere+Biology:+A+Contributory+and+Interactive+Factor+in+Aging,+Disease+Risks,+and+Protection.">Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection.</a> Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).</li><li>Lindqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychiatric+Disorders+and+Leukocyte+Telomere+Length:+Underlying+Mechanisms+Linking+Mental+Illness+with+Cellular+Aging.">Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging.</a> Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).</li><li>Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+in+Molecular+Epidemiology+Studies.">Telomeres in Molecular Epidemiology Studies.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).</li><li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+telomere+length+by+the+Southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths.">Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li><li>Haussmann, M. F., Mauck, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TECHNICAL+ADVANCES:+New+strategies+for+telomere-based+age+estimation.">TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation.</a> Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).</li><li>Nussey, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+telomere+length+and+telomere+dynamics+in+evolutionary+biology+and+ecology.">Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology.</a> Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).</li><li>Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+telomere+sequences+in+birds:+evidence+for+arrays+of+extreme+length+and+for+in+vivo+shortening.">Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening.</a> Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).</li><li>Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+and+FISH+to+measure+the+average+length+of+telomeres+(flow+FISH).">Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH).</a> Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).</li><li>Sanders, J. L., Newman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+in+epidemiology:+a+biomarker+of+aging,+age-related+disease,+both,+or+neither.">Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither.</a> Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).</li><li>Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+are+partly+shielded+from+ultraviolet-induced+damage+and+proficient+for+nucleotide+excision+repair+of+photoproducts.">Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts.</a> Nat Commun. 6, 8214 (2015).</li></ol>

Après électrophorèse, le frottis d&#39;ADN génomique est supérieur à 800 pb. Cela peut se produire si les enzymes de restriction sont défectueuses ou si des enzymes supplémentaires (comme décrit ci-dessus) sont nécessaires. Une deuxième explication possible est que la protéine est toujours attachée à l&#39;ADN. Lors de la détermination de la concentration d&#39;ADN par spectrophotomètre, le ratio 260/280 devrait être d&#39;environ 1,8. Si ce rapport est &lt;1,5, il existe une contamination des protéine...

Les télomères, situés aux extrémités des chromosomes, sont des répétitions nucléotidiques de la séquence TTAGGG (sur les chromosomes humains) qui jouent un rôle essentiel dans la protection de l&#39;information génétique cellulaire 3 , 4 , 5 . Les télomères ont plusieurs milliers de paires de bases et servent à protéger l&#39;intégrité du reste du chromosome pendant la réplication de l&#39;ADN. La réplication des chromosomes n&#39;est pas parfaite, de sorte que les extrémités du chromosome ne sont pas complètement copiées. Cette inefficacité dans la réplication est appelée «problème de réplication de fin» et entraîne la perte de certaines des répétitions de télomères au cours de chaque cycle de réplication 6 , 7 . La longueur de la télomère peut être restaurée après la division cellulaire par la télomérase, une enzyme qui remplace les séquences des télomères perdus 8 , 9 . La télomérase, cependant, n&#39;est pasActivé dans la plupart des cellules somatiques humaines et, par conséquent, au fil du temps, les télomères se raccourciront, entraînant éventuellement une sénescence cellulaire 10 . En raison du raccourcissement des télomères, les télomères sont considérés comme un biomarqueur du vieillissement et le risque de maladies liées à l&#39;âge 11 , 12 . En outre, la longueur des télomères peut être affectée par des facteurs génétiques, environnementaux et de style de vie et d&#39;autres stimuli tels que le stress oxydatif, ce qui indique que la longueur des télomères peut jouer un rôle de biomarqueur dans les études toxicologiques, épidémiologiques et comportementales 13 , 14 , 15 . Cet article démontre une technique de mesure de la longueur des télomères en utilisant une analyse de fragment de restriction terminale modifiée (TRF) adaptée de Mender et Shay 2 et Kimura et al. 16 , et similaire à Herbert, Shay et WrigHt 1 et Haussmann et Mauck 17 . Traditionnellement, l&#39;analyse des TRF implique une procédure Southern Blot. Les transferts de Southern sont considérés comme «l&#39;étalon de l&#39;or» pour étudier la longueur des télomères et sont activement utilisés pour examiner la longueur des télomères leucocytaires dans les études épidémiologiques 18 . Cette analyse TRF utilise l&#39;ADN génomique digéré en laissant les répétitions des télomères. Les fragments d&#39;ADN sont ensuite séparés par électrophorèse sur gel, dénaturés et transférés sur une membrane de nitrocellulose. Les séquences de télomères sont hybridées avec une sonde d&#39;oligonucléotide télomère. Plutôt que de transférer les télomères séparés sur une membrane, d&#39;autres techniques de TRF utilisent des techniques d&#39;hybridation en gel avec et sans dénaturation de l&#39;ADN. L&#39;inclusion de la dénaturation est importante lorsque l&#39;on considère la détection des télomères interstitiels, qui ont été signalés dans certaines espèces 19 . Les procédures qui ne comportent pas les étapes de dénaturationLes rayons d&#39;ADN monocaténaires sur les télomères terminaux et ne se lient pas aux séquences interstitielles des télomères 18 . Outre l&#39;analyse TRF, il existe plusieurs autres techniques de mesure de la longueur des télomères qui ont chacun leurs propres avantages et inconvénients. La technique Flow-FISH peut mesurer la longueur moyenne des télomères de cellules individuelles d&#39;un type cellulaire distinct en utilisant la cytométrie en flux 16 , 20 . Bien qu&#39;il puisse étiqueter avec précision des télomères avec des sondes hautement spécifiques et réduire les erreurs humaines par l&#39;automatisation, Flow-FISH est coûteux, moins efficace et nécessite des échantillons frais et un technicien hautement qualifié, ce qui limite sa capacité à des études épidémiologiques 16 . En outre, cette méthode ne tient pas compte des changements potentiels dans le nombre de chromosomes dans la population cellulaire. Une autre technique, qPCR, est largement acceptée comme moyen de mesure de la longueur des télomères pour les études épidémiologiques <suP class = &quot;xref&quot;&gt; 16 en raison de son débit élevé, son coût réduit et son exigence pour de petites quantités d&#39;ADN par rapport à d&#39;autres méthodes. Cependant, qPCR ne peut mesurer que le contenu d&#39;ADN telomérique moyen par rapport à un gène de copie unique et est donc une estimation indirecte de la longueur moyenne des télomères. Il fournit également un coefficient de variance élevé dans les études de comparaison, par rapport aux transferts du sud, ce qui entraîne une précision douteuse 21 . La procédure TRF a ses propres lacunes qui limitent son utilisation pour certaines études. Les techniques TRF nécessitent une grande quantité d&#39;ADN par rapport à d&#39;autres méthodes (entre 2 et 3 μg par échantillon). Cela limite les applications de la technique à l&#39;examen de la longueur des échantillons cliniques des télomères pour lesquels un ADN génomique suffisant peut être collecté et ne peut être utilisé sur des échantillons d&#39;ADN dégradés. De plus, l&#39;analyse des TRF est coûteuse et nécessite beaucoup de main-d&#39;œuvre, nécessitant 4 à 5 jours pour produire des résultats. Cependant, le TRF donne un faible coefficient de varianceEn accordant sa reproductibilité. Alors que ce protocole est différent de l&#39;échappement Southern traditionnel (utilisant une hybridation sur gel in situ), les deux techniques sont fondamentalement les mêmes. La technique présentée ici est une combinaison d&#39;un transfert de Southern et d&#39;une hybridation en gel; Associant l&#39;étape de dénaturation d&#39;ADN des transferts de Southern avec l&#39;hybridation en gel. Cette combinaison a le bénéfice supplémentaire de la puissance du signal de sonde améliorée par rapport au transfert de Southern et a consisté à produire des résultats quantifiables dans notre laboratoire. En outre, l&#39;utilisation de sondes radioactives plutôt que de sondes chimioluminescentes donne une intensité de signal plus élevée et permet la visualisation et la quantification avec un agent de phosphorimagerie, ce qui rend les analyses du TRF faciles à utiliser.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="618">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biologics</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Rsa1, restriction enzyme</td>
			<td style="width:116px;">New England Biolabs, Inc</td>
			<td style="width:119px;">R0167S</td>
			<td style="width:167px;">10,000 U/mL, DNA digestion.&#160; Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Hinf1, restriction enzyme</td>
			<td style="width:116px;">New England Biolabs, Inc</td>
			<td style="width:119px;">R0155S</td>
			<td style="width:167px;">10,000 U/mL, DNA digestion.&#160; Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Seakem GTG Agarose</td>
			<td style="width:116px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50071</td>
			<td style="width:167px;">electrophoresis grade agarose</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Optikinase&#160;</td>
			<td style="width:116px;">affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">78334X 500 UN</td>
			<td style="width:167px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SYBR Green Nucleic Acid Stain I</td>
			<td style="width:116px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S7567</td>
			<td style="width:167px;">Syber Green</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">exactGene DNA Ladder 24- kB</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2580100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">C-Strand Probe (3&#39;-(G3AT2)4-&#39;5)</td>
			<td style="width:116px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Custom ordered DNA oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gamma-ATP-P32</td>
			<td style="width:116px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU502Z</td>
			<td style="width:167px;">Radioisotope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit</td>
			<td style="width:116px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13323</td>
			<td style="width:167px;">DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GE Illustra Microspin G-25 column</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">27-5325-01</td>
			<td style="width:167px;">For purification of readioactive oligo probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">non-ionic synthetic polymer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment/Software</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm)</td>
			<td style="width:116px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A5</td>
			<td style="width:167px;">Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm)</td>
			<td style="width:116px;">Corel Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11068020</td>
			<td style="width:167px;">Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nylon mesh, 50, 12&#34; x 12&#34;</td>
			<td style="width:116px;">Ted Pellam, Inc</td>
			<td style="width:119px;">41-12105</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GE Storage Phosphor Screens</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">28-9564-75</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphor Screen Exposure Cassette</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">63-0035-44</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isotemp Hybridzation Incubator</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-247-20Q</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cylindrical hybridization tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-247-300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">The Belly Dancer orbital shaker</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z768499-1EA</td>
			<td style="width:167px;">Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Typhoon 9400</td>
			<td style="width:116px;">ABI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">For imaging of gels and phosphor screens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GraphPad Prism 6</td>
			<td style="width:116px;">GraphPad</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.05</td>
			<td style="width:167px;">Graphing Program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:116px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">Office 365</td>
			<td style="width:167px;">Spreadsheet program</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:116px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanodrp 2000</td>
			<td style="width:167px;">Spectrophotometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization

Il existe plusieurs techniques différentes pour mesurer la longueur des télomères, chacune avec leurs propres avantages et inconvénients. L&#39;approche traditionnelle, l&#39;analyse du fragment de restriction Telomere (TRF), utilise une technique d&#39;hybridation d&#39;ADN dans laquelle les échantillons d&#39;ADN génomique sont digérés avec des enzymes de restriction, laissant derrière eux des répétitions d&#39;ADN de télomères et un certain ADN sous-télomérique. Ceux-ci sont séparés par une électrophorèse sur gel d&#39;agarose, transférés dans une membrane filtrante et hybridés à des sondes oligonucléotidiques marquées avec chimioluminescence ou radioactivité pour visualiser des fragments de restriction telomère. Cette approche, tout en nécessitant une plus grande quantité d&#39;ADN que d&#39;autres techniques telles que la PCR, peut mesurer la répartition de la longueur des télomères d&#39;une population de cellules et permet une mesure exprimée en kilobases absolues. Ce manuscrit démontre une procédure d&#39;hybridation d&#39;ADN modifiée pour déterminer la longueur des télomères. L&#39;ADN génomique est d&#39;abord digéré avec des enzymes de restriction (qui ne coupent pasTélomères) et séparés par électrophorèse sur gel d&#39;agarose. Le gel est ensuite séché et l&#39;ADN est dénaturé et hybride in situ à une sonde oligonucléotidique radiomarquée. Cette hybridation in situ évite la perte d&#39;ADN des télomères et améliore l&#39;intensité du signal. Après l&#39;hybridation, les gels sont imagés à l&#39;aide d&#39;écrans phosphores et la longueur des télomères est quantifiée à l&#39;aide d&#39;un programme graphique. Cette procédure a été développée par les laboratoires des Drs. Woodring Wright et Jerry Shay à l&#39;Université du Texas Southwestern 1 , 2 . Ici, nous présentons une description détaillée de cette procédure, avec quelques modifications.

Trois concentrations d&#39;ADN (1, 2 et 3 μg) isolées à partir de la lignée cellulaire BJ-HTERT (fibroblastes de prépuce humain immortalisé par la télomérase) 22 et des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) ont été analysées pour la longueur des télomères. Le tableau 1 montre les affectations de voies pour chaque échantillon d&#39;ADN. La figure 1 montre une tache fluorescente d&#...

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Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Dans cet article, un protocole détaillé pour quantifier la longueur des télomères en utilisant une analyse de fragment de restriction terminale modifiée est discuté qui fournit une mesure directe rapide et efficace de la longueur des télomères. Cette technique peut être appliquée à une variété de sources cellulaires d&#39;ADN pour quantifier la longueur des télomères.

Analyse modifiée des fragments de restriction des terminaux pour quantifier la longueur de télomère à l&#39;aide de l&#39;hybridation en gel

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Laparoscopic Pancreatoduodenectomy With Modified Blumgart Pancreaticojejunostomy

Pancreatoduodenectomy laparoscopique avec mis à jour le Blumgart Pancreaticojejunostomy

Minimally invasive pancreatic resections are technically demanding but rapidly increasing in popularity. In contrast to laparoscopic distal ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Méthode simple et rapide d’obtenir qualité tumeur ADN provenant d’échantillons cliniques pathologiques à l’aide de la cytologie mentions légales contact

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

PIÈGE numérique de gouttelettes (ddTRAP): adaptation du protocole de répétition d’amplification de télomère à la réaction en chaîne de la polymérase numérique des gouttelettes

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Test de thérapies ciblées dans le cancer à l’aide de l’analyse structurale de l’altération de l’ADN et des Xénogreffes dérivées du patient

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Évaluation de la mort cellulaire à l’aide d’un surnageant sans cellules de probiotiques dans des cultures sphéroïdes tridimensionnelles de cellules cancéreuses colorectales

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Cartographie des relations structure-fonction des facteurs de transcription oncogènes désordonnés à l’aide de l’analyse transcriptomique

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Conjugaison chimique d’un anticorps purifié dirigé vers DEC-205 avec une protéine pleine longueur pour cibler les cellules dendritiques de souris in vitro et in vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

TUEUR NATUREL (NK) ET PROCÉDÉ D’EXPANSION CELLULAIRE CAR-NK UTILISANT UNE LIGNÉE CELLULAIRE B MODIFIÉE PAR UNE LIGNÉE CELLULAIRE B LIÉE À LA MEMBRANE

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...

CAM-Delam Assay to Score Metastatic Properties by Quantifying Delamination and Invasion Capacity of Cancer Cells

Test CAM-Delam pour évaluer les propriétés métastatiques en quantifiant la capacité de délamination et d’invasion des cellules cancéreuses

The major cause of cancer-related deaths is metastasis formation (i.e., when cancer cells spread from the primary tumor to distant organs and form ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Criblage multiparamétrique de médicaments organoïdes tumoraux à l’aide de l’imagerie de cellules vivantes à grand champ pour l’analyse en vrac et mono-organoïde

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...