Name: modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization
Uploaded: 2017-07-10T10:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization at JoVE.com

Gli autori riconoscono il sostegno dell&#39;Università di Pittsburgh Cancer Institute Biobehavioral oncologia condivisa in funzione che è sostenuta in parte dal premio P30CA047904.

1. Estrazione del DNA genomico <ol><li> Eseguire un&#39;estrazione genomica del DNA dalle cellule (qui, linea cellulare BJ-hTERT) da analizzare usando un kit di estrazione del DNA commerciale, secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Misurare la concentrazione del DNA con uno spettrofotometro. Se la concentrazione di DNA è inferiore a 100 μg / ml, precipitare il DNA con etanolo e risospendere in un volume di tampone TE (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA (Acido etilendiammetracecticico), pH 8,0). 100-600 μg / mL). <...

<ol>
	<li>Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+telomeres+and+telomerase.">Analysis of telomeres and telomerase.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2003).</li><li>Mender, I., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+Restriction+Fragment+(TRF)+Analysis.">Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis.</a> Bio Protoc. 5 (22), (2015).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+and+Telomerase:+The+Means+to+the+End+(Nobel+lecture).">Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).</li><li>Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+Discovery:+The+Excitement+of+Putting+Together+Pieces+of+the+Puzzle+(Nobel+lecture).">Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).</li><li>Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Ends:+Just+the+Beginning+(Nobel+lecture).">DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).</li><li>Watson, J. M., Riha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres,+Aging,+and+Plants:+From+Weeds+to+Methuselah+-+A+Mini-Review.">Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review.</a> Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).</li><li>Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres-Structure,+Function,+and+Regulation.">Telomeres-Structure, Function, and Regulation.</a> Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).</li><li>MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+Regulation+from+Beginning+to+the+End.">Telomerase Regulation from Beginning to the End.</a> Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).</li><li>Fouquerel, E., Opresko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+The+Nobel+Fields+of+Telomere+Biology+and+DNA+Repair.">Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair.</a> Photochem Photobiol. , (2016).</li><li>Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+Cellular+Senescence.+Telomere+Shortening+as+a+Marker+of+Cellular+Senescence.">Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence.</a> Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).</li><li>Opresko, P. L., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere-Associated+Aging+Disorders.">Telomere-Associated Aging Disorders.</a> Ageing Res Rev. , 1568-1637 (2016).</li><li>Chiodi, I., Mondello, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+and+Telomerase+Stability+in+Human+Diseases+and+Cancer.">Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).</li><li>Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Telomere+Biology:+A+Contributory+and+Interactive+Factor+in+Aging,+Disease+Risks,+and+Protection.">Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection.</a> Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).</li><li>Lindqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychiatric+Disorders+and+Leukocyte+Telomere+Length:+Underlying+Mechanisms+Linking+Mental+Illness+with+Cellular+Aging.">Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging.</a> Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).</li><li>Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+in+Molecular+Epidemiology+Studies.">Telomeres in Molecular Epidemiology Studies.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).</li><li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+telomere+length+by+the+Southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths.">Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li><li>Haussmann, M. F., Mauck, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TECHNICAL+ADVANCES:+New+strategies+for+telomere-based+age+estimation.">TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation.</a> Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).</li><li>Nussey, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+telomere+length+and+telomere+dynamics+in+evolutionary+biology+and+ecology.">Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology.</a> Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).</li><li>Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+telomere+sequences+in+birds:+evidence+for+arrays+of+extreme+length+and+for+in+vivo+shortening.">Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening.</a> Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).</li><li>Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+and+FISH+to+measure+the+average+length+of+telomeres+(flow+FISH).">Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH).</a> Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).</li><li>Sanders, J. L., Newman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+in+epidemiology:+a+biomarker+of+aging,+age-related+disease,+both,+or+neither.">Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither.</a> Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).</li><li>Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+are+partly+shielded+from+ultraviolet-induced+damage+and+proficient+for+nucleotide+excision+repair+of+photoproducts.">Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts.</a> Nat Commun. 6, 8214 (2015).</li></ol>

Dopo l&#39;elettroforesi, la macchia genomica del DNA è superiore a 800 bp. Ciò può verificarsi se gli enzimi di restrizione sono difettosi o se sono necessari ulteriori enzimi (come sopra descritto). Una seconda possibile spiegazione è che la proteina è ancora attaccata al DNA. Nel determinare la concentrazione del DNA mediante spettrofotometro, il rapporto 260/280 dovrebbe essere di circa 1,8. Se questo rapporto è &lt;1,5, vi è contaminazione di proteine ​​che può interferire con la digestione dell&#39;enz...

I telomeri, situati alle estremità dei cromosomi, sono ripetuti nucleotidi della sequenza TTAGGG (sui cromosomi umani) che svolgono un ruolo fondamentale nella protezione delle informazioni genetiche cellulari 3 , 4 , 5 . Telomeres sono diverse migliaia di coppie di base in lunghezza e servono a proteggere l&#39;integrità del resto del cromosoma durante la replicazione del DNA. La replicazione dei cromosomi non è perfetta, con conseguente che le estremità del cromosoma non vengono completamente copiate. Questa inefficienza nella replica viene definita &quot;il problema di replicazione finale&quot; e provoca la perdita di alcune ripetizioni telomere durante ogni ciclo di replica 6 , 7 . La lunghezza del telomere può essere ripristinata dopo la divisione cellulare mediante telomerasi, un enzima che sostituisce le sequenze telomere perse 8 , 9 . La telomerasi, tuttavia, non lo èAttivato nella maggior parte delle cellule somatiche umane e, di conseguenza, nel tempo, i telomeresi accorceranno, determinando una senescenza cellulare 10 . A causa dell&#39;allungamento dei telomeri, i telomeri sono considerati biomarker dell&#39;invecchiamento e rischio di malattie legate all&#39;età 11 , 12 . Inoltre, la lunghezza del telomere può essere influenzata da fattori genetici, ambientali e di stile di vita e altri stimoli come lo stress ossidativo, che indica che la lunghezza del telomero può svolgere un ruolo di biomarker negli studi tossicologici, epidemiologici e comportamentali 13 , 14 , 15 . Questo articolo dimostra una tecnica per misurare la lunghezza del telomere utilizzando un&#39;analisi modificata del frammento di restrizione terminale (TRF) modificata da Mender e Shay 2 e Kimura et al. 16 , e simili a Herbert, Shay e WrigHt 1 e Haussmann e Mauck 17 . Tradizionalmente, l&#39;analisi TRF comporta una procedura di blot Southern. Le macchie meridionali sono considerate &quot;standard gold&quot; per studiare la lunghezza del telomere e sono attivamente utilizzate per esaminare la lunghezza del telomere di leucociti negli studi epidemiologici 18 . Questa analisi TRF utilizza il DNA genomico digerito lasciando dietro le ripetizioni dei telomeri. I frammenti di DNA vengono quindi separati mediante elettroforesi a gel, denaturati e trasferiti a una membrana di nitrocellulosa. Le sequenze telomere sono ibridizzate ad una sonda di telomere oligonucleotide. Piuttosto che trasferire i telomeresi separati in una membrana, altre tecniche TRF utilizzano tecniche di ibridazione in-gel con e senza denaturazione del DNA. L&#39;inclusione della denaturazione è importante quando si considera la rilevazione di telomeri interstiziali, che sono stati riportati in alcune specie 19 . Le procedure che non hanno la denaturazione fanno solo rilevareI DNA a singolo filamento presentano sovrapposizioni nei telomeresi terminali e non si legano alle sequenze telomeriche interstiziali 18 . Oltre all&#39;analisi TRF, ci sono diverse altre tecniche per misurare la lunghezza del telomere che ognuno ha i propri vantaggi e svantaggi. La tecnica Flow-FISH può misurare la lunghezza media del telomero di singole cellule di un tipo cellulare distinto utilizzando la citometria a flusso 16 , 20 . Mentre può accuratamente tagliare telomeri con sonde altamente specifiche e ridurre l&#39;errore umano attraverso l&#39;automazione, Flow-FISH è costoso, meno efficiente e richiede campioni freschi e un tecnico altamente qualificato, limitando la sua capacità di studi epidemiologici 16 . Inoltre, questo metodo non tiene conto delle potenziali variazioni del numero di cromosomi nella popolazione cellulare. Un&#39;altra tecnica, qPCR, è ampiamente accettata come mezzo per misurare la lunghezza del telomere per studi epidemiologici <suP class = &quot;xref&quot;&gt; 16 a causa della sua elevata produttività, basso costo e requisito per piccole quantità di DNA rispetto ad altri metodi. Tuttavia, qPCR può misurare solo il contenuto medio del DNA telomerico rispetto a un singolo gene della copia ed è quindi una stima indiretta della lunghezza media del telomero. Fornisce anche un elevato coefficiente di varianza negli studi di confronto, rispetto alle macchie meridionali, portando ad una precisione discutibile 21 . La procedura TRF ha delle proprie carenze che limitano l&#39;uso di alcuni studi. Le tecniche TRF richiedono una grande quantità di DNA rispetto ad altri metodi (tra 2 e 3 μg per campione). Ciò limita le applicazioni della tecnica per esaminare la lunghezza del telomero di campioni clinici per i quali può essere raccolto un sufficiente DNA genomico e non può essere utilizzato su campioni di DNA degradati. Inoltre, l&#39;analisi TRF è costosa e intensa e richiede 4-5 giorni per produrre risultati. Tuttavia, il TRF produce un basso coefficiente di varianzaConcedendo la sua riproducibilità. Mentre questo protocollo è diverso dalla macchia tradizionale Southern (utilizzando l&#39;ibridazione gel in situ ), le due tecniche sono fondamentalmente le stesse. La tecnica presentata qui è una combinazione di una blotta Southern e l&#39;ibridazione in gel; Associando il processo di denaturazione del DNA da macchie di Southern con l&#39;ibridazione in gel. Questa combinazione ha il vantaggio aggiunto di una migliore resistenza del segnale della sonda rispetto alla macchia Southern e ha costantemente reso quantificabili risultati all&#39;interno del nostro laboratorio. Inoltre, l&#39;uso di sonde radioattive piuttosto che le sonde chemiluminescenti produce un&#39;intensità del segnale più elevata e consente la visualizzazione e la quantificazione con un fosforimagno, rendendo le analisi del TRF facile da usare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="618">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biologics</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Rsa1, restriction enzyme</td>
			<td style="width:116px;">New England Biolabs, Inc</td>
			<td style="width:119px;">R0167S</td>
			<td style="width:167px;">10,000 U/mL, DNA digestion.&#160; Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Hinf1, restriction enzyme</td>
			<td style="width:116px;">New England Biolabs, Inc</td>
			<td style="width:119px;">R0155S</td>
			<td style="width:167px;">10,000 U/mL, DNA digestion.&#160; Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Seakem GTG Agarose</td>
			<td style="width:116px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50071</td>
			<td style="width:167px;">electrophoresis grade agarose</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Optikinase&#160;</td>
			<td style="width:116px;">affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">78334X 500 UN</td>
			<td style="width:167px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SYBR Green Nucleic Acid Stain I</td>
			<td style="width:116px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S7567</td>
			<td style="width:167px;">Syber Green</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">exactGene DNA Ladder 24- kB</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2580100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">C-Strand Probe (3&#39;-(G3AT2)4-&#39;5)</td>
			<td style="width:116px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Custom ordered DNA oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gamma-ATP-P32</td>
			<td style="width:116px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU502Z</td>
			<td style="width:167px;">Radioisotope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit</td>
			<td style="width:116px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13323</td>
			<td style="width:167px;">DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GE Illustra Microspin G-25 column</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">27-5325-01</td>
			<td style="width:167px;">For purification of readioactive oligo probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">non-ionic synthetic polymer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment/Software</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm)</td>
			<td style="width:116px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A5</td>
			<td style="width:167px;">Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm)</td>
			<td style="width:116px;">Corel Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11068020</td>
			<td style="width:167px;">Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nylon mesh, 50, 12&#34; x 12&#34;</td>
			<td style="width:116px;">Ted Pellam, Inc</td>
			<td style="width:119px;">41-12105</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GE Storage Phosphor Screens</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">28-9564-75</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphor Screen Exposure Cassette</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">63-0035-44</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isotemp Hybridzation Incubator</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-247-20Q</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cylindrical hybridization tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-247-300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">The Belly Dancer orbital shaker</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z768499-1EA</td>
			<td style="width:167px;">Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Typhoon 9400</td>
			<td style="width:116px;">ABI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">For imaging of gels and phosphor screens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GraphPad Prism 6</td>
			<td style="width:116px;">GraphPad</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.05</td>
			<td style="width:167px;">Graphing Program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:116px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">Office 365</td>
			<td style="width:167px;">Spreadsheet program</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:116px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanodrp 2000</td>
			<td style="width:167px;">Spectrophotometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization

Ci sono diverse tecniche per misurare la lunghezza del telomere, ciascuno con i propri vantaggi e svantaggi. L&#39;approccio tradizionale, l&#39;analisi del frammento di restrizione di Telomere (TRF), utilizza una tecnica di ibridazione del DNA in cui i campioni di DNA genomici vengono digeriti con enzimi di restrizione, lasciando dietro le ripetizioni dei telomeri e qualche DNA sub-telomerico. Questi sono separati dall&#39;elettroforesi del gel agarosio, trasferiti su una membrana filtrante e ibridati a sonde di oligonucleotide tagliate con chemiluminescenza o radioattività per visualizzare i frammenti di restrizione telomere. Questo approccio, pur richiedendo una maggiore quantità di DNA rispetto ad altre tecniche come la PCR, può misurare la distribuzione della lunghezza del telomere di una popolazione di cellule e consente la misurazione espresso in kilobasi assoluti. Questo manoscritto dimostra una procedura di ibridazione del DNA modificata per determinare la lunghezza del telomero. Il DNA genomico viene prima digerito con enzimi di restrizione (che non taglianoTelomeri) e separati da elettroforesi con agarosio gel. Il gel viene quindi asciugato e il DNA viene denaturato e ibridato in situ ad una sonda oligonucleotidica radiolabeled. Questa ibridazione in situ evita la perdita del DNA del telomere e migliora l&#39;intensità del segnale. Dopo l&#39;ibridazione, i gel vengono immagazzinati utilizzando schermi di fosforo e la lunghezza del telomero viene quantificata utilizzando un programma di grafica. Questa procedura è stata sviluppata dai laboratori del Dott. Woodring Wright e Jerry Shay presso l&#39;Università del Texas Southwestern 1 , 2 . Qui presentiamo una descrizione dettagliata di questa procedura, con alcune modifiche.

Sono state analizzate tre concentrazioni di DNA (1, 2 e 3 μg) isolate dalla linea cellulare BJ-hTERT (telomerasi immortalizzate di fibroblasti umane prepuntite) 22 e cellule mononucleate periferiche umane umane (PBMCs) per lunghezza telomere. La tabella 1 mostra le assegnazioni della corsia per ciascun campione di DNA. La figura 1 mostra una macchia fluorescente dell&#39;acido nucleico del gel. Gli standard di peso m...

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Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

In questo articolo viene descritto un protocollo dettagliato per quantificare la lunghezza del telomere utilizzando un&#39;analisi del frammento di restrizione terminale modificata che fornisce una misurazione diretta veloce ed efficiente della lunghezza del telomere. Questa tecnica può essere applicata a una varietà di fonti cellulari di DNA per quantificare la lunghezza del telomere.

Analisi di frammento di restrizione terminale modificata per quantificare la lunghezza di telomere utilizzando l&#39;ibridazione in gel

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Laparoscopic Pancreatoduodenectomy With Modified Blumgart Pancreaticojejunostomy

Pancreatoduodenectomy laparoscopica con modificate Blumgart Pancreaticojejunostomy

Minimally invasive pancreatic resections are technically demanding but rapidly increasing in popularity. In contrast to laparoscopic distal ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Metodo semplice e veloce per ottenere alta qualità tumore del DNA da campioni clinico-patologiche utilizzando Touch Imprint citologia

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): adattamento del protocollo di amplificazione di ripetizione telomere a droplet reazione a catena della polimerasi digitale

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Test delle terapie mirate nel cancro utilizzando l'analisi dell'alterazione strutturale del DNA e gli Xenogrini derivati dal paziente

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Valutazione della morte cellulare utilizzando un surnatante privo di cellule di probiotici in colture sferoidali tridimensionali di cellule tumorali del colon-retto

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Mappatura delle relazioni struttura-funzione dei fattori di trascrizione oncogenica disordinati utilizzando l'analisi trascrittomica

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Coniugazione chimica di un anticorpo purificato dec-205 diretto con proteina a lunghezza intera per il targeting di cellule dendritiche di topo in vitro e in vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Metodo di espansione cellulare Natural Killer (NK) e CAR-NK utilizzando la linea cellulare B modificata Membrane Bound-IL-21-Modified

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...

CAM-Delam Assay to Score Metastatic Properties by Quantifying Delamination and Invasion Capacity of Cancer Cells

Test CAM-Delam per valutare le proprietà metastatiche quantificando la capacità di delaminazione e invasione delle cellule tumorali

The major cause of cancer-related deaths is metastasis formation (i.e., when cancer cells spread from the primary tumor to distant organs and form ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Screening multiparametrico di farmaci organoidi tumorali mediante imaging a cellule vive a campo ampio per analisi di massa e organoidi singoli

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...