Name: modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization
Uploaded: 2017-07-10T10:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization at JoVE.com

Авторы признают поддержку Университета Питтсбургского института рака по биобезопасной онкологии, которая частично поддерживается наградой P30CA047904.

1. Извлечение геномной ДНК <ol><li> Выполните экстракцию геномной ДНК из клеток (здесь, клеточная линия BJ-hTERT) для анализа с использованием коммерческого набора для экстракции ДНК в соответствии с инструкциями производителя. </li><li> Измерьте концентрацию ДНК спектрофотометром. Если концент...

<ol>
	<li>Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+telomeres+and+telomerase.">Analysis of telomeres and telomerase.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2003).</li><li>Mender, I., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+Restriction+Fragment+(TRF)+Analysis.">Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis.</a> Bio Protoc. 5 (22), (2015).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+and+Telomerase:+The+Means+to+the+End+(Nobel+lecture).">Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).</li><li>Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+Discovery:+The+Excitement+of+Putting+Together+Pieces+of+the+Puzzle+(Nobel+lecture).">Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).</li><li>Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Ends:+Just+the+Beginning+(Nobel+lecture).">DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).</li><li>Watson, J. M., Riha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres,+Aging,+and+Plants:+From+Weeds+to+Methuselah+-+A+Mini-Review.">Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review.</a> Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).</li><li>Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres-Structure,+Function,+and+Regulation.">Telomeres-Structure, Function, and Regulation.</a> Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).</li><li>MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+Regulation+from+Beginning+to+the+End.">Telomerase Regulation from Beginning to the End.</a> Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).</li><li>Fouquerel, E., Opresko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+The+Nobel+Fields+of+Telomere+Biology+and+DNA+Repair.">Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair.</a> Photochem Photobiol. , (2016).</li><li>Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+Cellular+Senescence.+Telomere+Shortening+as+a+Marker+of+Cellular+Senescence.">Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence.</a> Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).</li><li>Opresko, P. L., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere-Associated+Aging+Disorders.">Telomere-Associated Aging Disorders.</a> Ageing Res Rev. , 1568-1637 (2016).</li><li>Chiodi, I., Mondello, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+and+Telomerase+Stability+in+Human+Diseases+and+Cancer.">Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).</li><li>Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Telomere+Biology:+A+Contributory+and+Interactive+Factor+in+Aging,+Disease+Risks,+and+Protection.">Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection.</a> Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).</li><li>Lindqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychiatric+Disorders+and+Leukocyte+Telomere+Length:+Underlying+Mechanisms+Linking+Mental+Illness+with+Cellular+Aging.">Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging.</a> Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).</li><li>Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+in+Molecular+Epidemiology+Studies.">Telomeres in Molecular Epidemiology Studies.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).</li><li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+telomere+length+by+the+Southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths.">Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li><li>Haussmann, M. F., Mauck, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TECHNICAL+ADVANCES:+New+strategies+for+telomere-based+age+estimation.">TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation.</a> Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).</li><li>Nussey, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+telomere+length+and+telomere+dynamics+in+evolutionary+biology+and+ecology.">Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology.</a> Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).</li><li>Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+telomere+sequences+in+birds:+evidence+for+arrays+of+extreme+length+and+for+in+vivo+shortening.">Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening.</a> Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).</li><li>Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+and+FISH+to+measure+the+average+length+of+telomeres+(flow+FISH).">Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH).</a> Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).</li><li>Sanders, J. L., Newman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+in+epidemiology:+a+biomarker+of+aging,+age-related+disease,+both,+or+neither.">Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither.</a> Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).</li><li>Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+are+partly+shielded+from+ultraviolet-induced+damage+and+proficient+for+nucleotide+excision+repair+of+photoproducts.">Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts.</a> Nat Commun. 6, 8214 (2015).</li></ol>

После электрофореза геномный ДНК-мазок выше 800 пар оснований. Это может произойти, если рестрикционные ферменты являются дефектными или необходимы дополнительные ферменты (как описано выше). Второе возможное объяснение состоит в том, что белок все еще прикреплен к ДНК. При определении ...

Теломеры, расположенные на концах хромосом, представляют собой нуклеотидные повторы последовательности TTAGGG (на человеческих хромосомах), которые играют критическую роль в защите клеточной генетической информации 3 , 4 , 5 . Теломеры составляют несколько тысяч пар оснований в длину и служат для защиты целостности остальной части хромосомы во время репликации ДНК. Репликация хромосом не идеальна, в результате чего концы хромосомы не полностью копируются. Эта неэффективность в репликации называется «проблемой конечной репликации» и приводит к потере некоторых повторов теломер в течение каждого раунда репликации 6 , 7 . Длина теломера может быть восстановлена ​​после деления клеток теломеразой, ферментом, который заменяет потерянные последовательности теломер 8 , 9 . Теломераза, однако, неАктивируется в большинстве соматических клеток человека, и в результате со временем теломеры сокращаются, что в конечном итоге приводит к клеточному старению 10 . Из-за сокращения теломер теломеры рассматриваются как биомаркер старения и риск развития возрастных заболеваний 11 , 12 . Кроме того, на длину теломер могут влиять генетические, экологические и факторы образа жизни и другие стимулы, такие как окислительный стресс, что указывает на то, что длина теломер может играть роль биомаркера в токсикологических, эпидемиологических и поведенческих исследованиях 13 , 14 , 15 . В этой статье демонстрируется методика измерения длины теломер с использованием модифицированного анализа терминального рестрикционного фрагмента (TRF), адаптированного из Mender и Shay 2 и Kimura et al. 16 , и аналогично Герберту, Шей и РигуHt 1 и Haussmann and Mauck 17 . Традиционно анализ TRF включает процедуру Саузерн-блоттинга. Саузерн-блоты считаются «золотым стандартом» для изучения длины теломер и активно используются для изучения длины теломер лейкоцитов в эпидемиологических исследованиях 18 . Этот анализ TRF использует переваренную геномную ДНК, остающуюся после повторов теломер. Затем фрагменты ДНК отделяют гель-электрофорезом, денатурируют и переносят на нитроцеллюлозную мембрану. Последовательности теломер гибридизуются с олигонуклеотидным зондом теломер. Вместо переноса отделенных теломер на мембрану другие методы TRF используют методы гибридизации в геле с денатурацией ДНК и без нее. Включение денатурации важно при рассмотрении обнаружения междоузельных теломер, о чем сообщалось у некоторых видов 19 . Процедуры, в которых отсутствуют денатурирующие шаги,Одноцепочечные выемки ДНК в концевых теломерах и не будут связываться с интерстициальными последовательностями теломер 18 . Помимо анализа TRF, существует несколько других методов измерения длины теломер, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. Метод Flow-FISH может измерять среднюю длину теломер отдельных клеток отдельного типа клеток с использованием проточной цитометрии 16 , 20 . Хотя он может точно маркировать теломеры с помощью высокоспецифических зондов и уменьшать человеческую ошибку с помощью автоматизации, Flow-FISH является дорогостоящим, менее эффективным и требует свежих образцов и высококвалифицированного техника, ограничивая его возможности для эпидемиологических исследований 16 . Кроме того, этот метод не учитывает потенциальные изменения количества хромосом в популяции клеток. Другая методика, qPCR, широко используется в качестве средства измерения длины теломер для эпидемиологических исследований <suP class = &quot;xref&quot;&gt; 16 из-за его высокой пропускной способности, низкой стоимости и потребности в небольших количествах ДНК по сравнению с другими методами. Однако qPCR может измерять только среднее содержание теломерной ДНК по отношению к одному копирующему гену и, таким образом, является косвенной оценкой средней длины теломер. Это также приводит к большому коэффициенту дисперсии в сравнительных исследованиях по сравнению с южными блотами, что приводит к сомнительной точности 21 . Процедура TRF имеет свои недостатки, которые ограничивают ее использование для некоторых исследований. Методы TRF требуют большого количества ДНК по сравнению с другими методами (от 2 до 3 мкг на образец). Это ограничивает применение техники для изучения длины теломер клинических образцов, для которых может быть собрана достаточная геномная ДНК и не может быть использована на деградированных образцах ДНК. Кроме того, анализ TRF является дорогостоящим и трудоемким, что требует 4-5 дней для получения результатов. Однако TRF дает низкий коэффициент дисперсииПредоставляя его воспроизводимость. Хотя этот протокол отличается от традиционного Саузерн-блоттинга (с использованием гибридизации на месте in situ), эти два метода принципиально одинаковы. Представленная здесь методика представляет собой комбинацию Саузерн-блоттинга и in-gel-гибридизации; Связывая стадию денатурации ДНК с Саузерн-блоттингом с гибридизацией in-gel. Эта комбинация обладает дополнительным преимуществом улучшенной мощности зондирующего сигнала по сравнению с Саузерн-блоттингом и последовательно дает количественные результаты в нашей лаборатории. Кроме того, использование радиоактивных зондов, а не хемилюминесцентных зондов, дает более высокую интенсивность сигнала и позволяет визуализировать и количественно с помощью фосфоримагера, делая анализ TRF удобным для пользователя.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="618">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biologics</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Rsa1, restriction enzyme</td>
			<td style="width:116px;">New England Biolabs, Inc</td>
			<td style="width:119px;">R0167S</td>
			<td style="width:167px;">10,000 U/mL, DNA digestion.&#160; Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Hinf1, restriction enzyme</td>
			<td style="width:116px;">New England Biolabs, Inc</td>
			<td style="width:119px;">R0155S</td>
			<td style="width:167px;">10,000 U/mL, DNA digestion.&#160; Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Seakem GTG Agarose</td>
			<td style="width:116px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50071</td>
			<td style="width:167px;">electrophoresis grade agarose</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Optikinase&#160;</td>
			<td style="width:116px;">affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">78334X 500 UN</td>
			<td style="width:167px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SYBR Green Nucleic Acid Stain I</td>
			<td style="width:116px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S7567</td>
			<td style="width:167px;">Syber Green</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">exactGene DNA Ladder 24- kB</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2580100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">C-Strand Probe (3&#39;-(G3AT2)4-&#39;5)</td>
			<td style="width:116px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Custom ordered DNA oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gamma-ATP-P32</td>
			<td style="width:116px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU502Z</td>
			<td style="width:167px;">Radioisotope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit</td>
			<td style="width:116px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13323</td>
			<td style="width:167px;">DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GE Illustra Microspin G-25 column</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">27-5325-01</td>
			<td style="width:167px;">For purification of readioactive oligo probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">non-ionic synthetic polymer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment/Software</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm)</td>
			<td style="width:116px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A5</td>
			<td style="width:167px;">Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm)</td>
			<td style="width:116px;">Corel Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11068020</td>
			<td style="width:167px;">Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nylon mesh, 50, 12&#34; x 12&#34;</td>
			<td style="width:116px;">Ted Pellam, Inc</td>
			<td style="width:119px;">41-12105</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GE Storage Phosphor Screens</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">28-9564-75</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphor Screen Exposure Cassette</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">63-0035-44</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isotemp Hybridzation Incubator</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-247-20Q</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cylindrical hybridization tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-247-300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">The Belly Dancer orbital shaker</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z768499-1EA</td>
			<td style="width:167px;">Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Typhoon 9400</td>
			<td style="width:116px;">ABI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">For imaging of gels and phosphor screens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GraphPad Prism 6</td>
			<td style="width:116px;">GraphPad</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.05</td>
			<td style="width:167px;">Graphing Program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:116px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">Office 365</td>
			<td style="width:167px;">Spreadsheet program</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:116px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanodrp 2000</td>
			<td style="width:167px;">Spectrophotometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization

Существует несколько различных методов измерения длины теломер, каждый из которых имеет свои преимущества и недостатки. В традиционном подходе, анализах фрагментации теломер (TRF) используется технология гибридизации ДНК, в которой образцы геномной ДНК расщепляются рестрикционными ферментами, оставляя повторные повторы ДНК теломер и некоторые суб-теломерные ДНК. Их разделяют электрофорезом в агарозном геле, переносят на фильтровальную мембрану и гибридизовывают с олигонуклеотидными зондами, меченными либо хемилюминесценцией, либо радиоактивностью, чтобы визуализировать фрагменты рестрикции теломер. Такой подход, требующий большего количества ДНК, чем другие методы, такие как ПЦР, может измерять распределение длины теломер популяции клеток и позволяет измерять, выраженные в абсолютных килобазах. Эта рукопись демонстрирует модифицированную процедуру гибридизации ДНК для определения длины теломер. Геномную ДНК сначала расщепляют рестрикционными ферментами (которые не режутТеломеры) и разделяют электрофорезом в агарозном геле. Затем гель сушат и ДНК денатурируют и гибридизуют in situ с радиоактивно меченным олигонуклеотидным зондом. Эта гибридизация in situ позволяет избежать потери ДНК теломер и улучшает интенсивность сигнала. После гибридизации гели визуализируются с использованием экранов люминофора, а длина теломера определяется количественно с помощью графической программы. Эта процедура была разработана лабораториями Drs. Вудринг Райт и Джерри Шей в Университете Техаса Юго-Западный 1 , 2 . Здесь мы приводим подробное описание этой процедуры с некоторыми изменениями.

Были проанализированы три концентрации ДНК (1, 2 и 3 мкг), выделенные из клеточной линии BJ-hTERT (теломераза, иммортализованные фибробласты крайней плоти человека) 22 и мононуклеарные клетки периферической крови человека (РВМС) для длины теломер. В таблице 1...

Watch this Scientific Journal Video about Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization at JoVE.com

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

В этой статье обсуждается подробный протокол для количественной оценки длины теломер с использованием модифицированного терминального рестрикционного фрагмента, который обеспечивает быстрое и эффективное прямое измерение длины теломер. Этот метод может быть применен к различным клеточным источникам ДНК для количественной оценки длины теломер.

Модифицированный анализ фрагментарных фрагментов для количественного определения длины теломера с использованием гибридизации в геле

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Laparoscopic Pancreatoduodenectomy With Modified Blumgart Pancreaticojejunostomy

Лапароскопическая Pancreatoduodenectomy с модифицированных Blumgart Pancreaticojejunostomy

Minimally invasive pancreatic resections are technically demanding but rapidly increasing in popularity. In contrast to laparoscopic distal ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Простой и быстрый метод для получения высокого качества опухоли ДНК от клинических патологических образцов с помощью касания отпечаток цитологии

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Капли цифровая ловушка (ddTRAP): адаптация протокола усиления теломер повторить к капли цифровая полимеразной цепной реакции

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Тестирование целевых методов лечения рака с использованием структурных анализа изменения ДНК и пациентов, полученных Xenografts

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Оценка гибели клеток с использованием бесклеточного супернатанта пробиотиков в трехмерных сфероидных культурах колоректальных раковых клеток

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Отображение структурно-функциональных отношений неупорядоченных онкогенных факторов транскрипции с использованием транскриптомного анализа

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Химическая конъюгация очищенного антитела, направленного на DEC-205, с полноразмерным белком для нацеливания на дендритные клетки мышей in vitro и in vivo

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Естественный киллер (NK) и метод расширения клеток CAR-NK с использованием мембранно-связанной IL-21-модифицированной В-клеточной линии

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...

CAM-Delam Assay to Score Metastatic Properties by Quantifying Delamination and Invasion Capacity of Cancer Cells

Анализ CAM-Delam для оценки метастатических свойств путем количественной оценки расслоения и инвазионной способности раковых клеток

The major cause of cancer-related deaths is metastasis formation (i.e., when cancer cells spread from the primary tumor to distant organs and form ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Многопараметрический скрининг опухолевых органоидных препаратов с использованием широкоугольной визуализации живых клеток для объемного и одноорганоидного анализа

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...