Name: modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization
Uploaded: 2017-07-10T10:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization at JoVE.com

Yazarlar kısmen Pittsburgh Kanser Enstitüsü Biyobehavioral Onkoloji paylaşılan tesisin P30CA047904 ödülünün desteğiyle desteklenmesini onaylıyorlar.

1. Genomik DNA Ekstraksiyonu <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre, ticari bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak analiz edilecek hücrelerden (burada, hücre çizgisi BJ-hTERT) genomik bir DNA özütleme yapın. </li><li> Bir spektrofotometre ile DNA konsantrasyonunu ölçün. DNA konsantrasyonu 100 μg / mL&#39;den az ise, DNA&#39;yı etanol ile çökeltin ve bir DNA konsantrasyonunu sağlamak için, bir hacimde TE tampon (10 mM Tris-Cl; 0.1 mM EDTA (Etilen diaminetetraasetik Asit); pH 8.0) içinde tekrar süsp...

<ol>
	<li>Herbert, B. S., Shay, J. W., Wright, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+telomeres+and+telomerase.">Analysis of telomeres and telomerase.</a> Curr Protoc Cell Biol. , 16 (2003).</li><li>Mender, I., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+Restriction+Fragment+(TRF)+Analysis.">Telomere Restriction Fragment (TRF) Analysis.</a> Bio Protoc. 5 (22), (2015).</li><li>Blackburn, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+and+Telomerase:+The+Means+to+the+End+(Nobel+lecture).">Telomeres and Telomerase: The Means to the End (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7405-7421 (2010).</li><li>Greider, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+Discovery:+The+Excitement+of+Putting+Together+Pieces+of+the+Puzzle+(Nobel+lecture).">Telomerase Discovery: The Excitement of Putting Together Pieces of the Puzzle (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7422-7439 (2010).</li><li>Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+Ends:+Just+the+Beginning+(Nobel+lecture).">DNA Ends: Just the Beginning (Nobel lecture).</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49 (41), 7386-7404 (2010).</li><li>Watson, J. M., Riha, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres,+Aging,+and+Plants:+From+Weeds+to+Methuselah+-+A+Mini-Review.">Telomeres, Aging, and Plants: From Weeds to Methuselah - A Mini-Review.</a> Gerontology. 57 (2), 129-136 (2011).</li><li>Lu, W., Zhang, Y., Liu, D., Songyang, Z., Wan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres-Structure,+Function,+and+Regulation.">Telomeres-Structure, Function, and Regulation.</a> Exp Cell Res. 319 (2), 133-141 (2013).</li><li>MacNeil, D. E., Bensoussan, H. J., Autexier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomerase+Regulation+from+Beginning+to+the+End.">Telomerase Regulation from Beginning to the End.</a> Genes (Basel). 7 (9), 64 (2016).</li><li>Fouquerel, E., Opresko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Convergence+of+The+Nobel+Fields+of+Telomere+Biology+and+DNA+Repair.">Convergence of The Nobel Fields of Telomere Biology and DNA Repair.</a> Photochem Photobiol. , (2016).</li><li>Bernadotte, A., Mikhelson, V. M., Spivak, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+of+Cellular+Senescence.+Telomere+Shortening+as+a+Marker+of+Cellular+Senescence.">Markers of Cellular Senescence. Telomere Shortening as a Marker of Cellular Senescence.</a> Aging (Albany NY). 8 (1), 3-11 (2016).</li><li>Opresko, P. L., Shay, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere-Associated+Aging+Disorders.">Telomere-Associated Aging Disorders.</a> Ageing Res Rev. , 1568-1637 (2016).</li><li>Chiodi, I., Mondello, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+and+Telomerase+Stability+in+Human+Diseases+and+Cancer.">Telomere and Telomerase Stability in Human Diseases and Cancer.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 1 (21), 203-224 (2016).</li><li>Blackburn, E. H., Epel, E. S., Lin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Telomere+Biology:+A+Contributory+and+Interactive+Factor+in+Aging,+Disease+Risks,+and+Protection.">Human Telomere Biology: A Contributory and Interactive Factor in Aging, Disease Risks, and Protection.</a> Science. 350 (6265), 1193-1198 (2015).</li><li>Lindqvist, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psychiatric+Disorders+and+Leukocyte+Telomere+Length:+Underlying+Mechanisms+Linking+Mental+Illness+with+Cellular+Aging.">Psychiatric Disorders and Leukocyte Telomere Length: Underlying Mechanisms Linking Mental Illness with Cellular Aging.</a> Neurosci Biobehav Rev. 55, 333-364 (2015).</li><li>Bodelon, C., Savage, S. A., Gadalla, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+in+Molecular+Epidemiology+Studies.">Telomeres in Molecular Epidemiology Studies.</a> Prog Mol Biol Transl Sci. 125 (113), (2014).</li><li>Kimura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+telomere+length+by+the+Southern+blot+analysis+of+terminal+restriction+fragment+lengths.">Measurement of telomere length by the Southern blot analysis of terminal restriction fragment lengths.</a> Nat Protoc. 5 (9), 1596-1607 (2010).</li><li>Haussmann, M. F., Mauck, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TECHNICAL+ADVANCES:+New+strategies+for+telomere-based+age+estimation.">TECHNICAL ADVANCES: New strategies for telomere-based age estimation.</a> Mol Ecol Resour. 8 (2), 264-274 (2008).</li><li>Nussey, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+telomere+length+and+telomere+dynamics+in+evolutionary+biology+and+ecology.">Measuring telomere length and telomere dynamics in evolutionary biology and ecology.</a> Methods Ecol Evol. 5 (4), 299-310 (2014).</li><li>Delany, M. E., Krupkin, A. B., Miller, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+telomere+sequences+in+birds:+evidence+for+arrays+of+extreme+length+and+for+in+vivo+shortening.">Organization of telomere sequences in birds: evidence for arrays of extreme length and for in vivo shortening.</a> Cytogenet Cell Genet. 90 (1-2), 139-145 (2000).</li><li>Baerlocher, G. M., Vulto, I., de Jong, G., Lansdorp, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+and+FISH+to+measure+the+average+length+of+telomeres+(flow+FISH).">Flow cytometry and FISH to measure the average length of telomeres (flow FISH).</a> Nat Protoc. 1 (5), 2365-2376 (2006).</li><li>Sanders, J. L., Newman, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomere+length+in+epidemiology:+a+biomarker+of+aging,+age-related+disease,+both,+or+neither.">Telomere length in epidemiology: a biomarker of aging, age-related disease, both, or neither.</a> Epidemiol Rev. 35, 112-131 (2013).</li><li>Parikh, D., Fouquerel, E., Murphy, C. T., Wang, H., Opresko, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Telomeres+are+partly+shielded+from+ultraviolet-induced+damage+and+proficient+for+nucleotide+excision+repair+of+photoproducts.">Telomeres are partly shielded from ultraviolet-induced damage and proficient for nucleotide excision repair of photoproducts.</a> Nat Commun. 6, 8214 (2015).</li></ol>

Elektroforezden sonra genomik DNA smear 800 bp&#39;den daha yüksektir. Bu, kısıtlama enzimleri hatalıysa veya (yukarıda tarif edildiği gibi) ilave enzimlere ihtiyaç duyulması halinde oluşabilir. İkinci olası açıklama, proteinin DNA&#39;ya halen bağlı olmasıdır. DNA konsantrasyonunu spektrofotometre ile belirlerken, 260/280 oranı 1.8 civarında olmalıdır. Bu oran &lt;1.5 ise, kısıtlama enzim sindirimine müdahale edebilen protein kontaminasyonu oluşur. Ya DNA örneğinin yeniden izole edilmesi gere...

Kromozomların uçlarında yer alan telomerler, hücresel genetik bilginin korunmasında kritik bir rol oynayan TTAGGG sekansının (insan kromozomları üzerinde) nükleotid tekrarlarıdır 3 , 4 , 5 . Telomerlerin uzunluğu birkaç bin baz çifttir ve DNA replikasyonu sırasında kromozomun geri kalanının bütünlüğünü korumaya yarar. Kromozomların replikasyonu kromozomun uçlarının tamamen kopyalanmamasına neden olarak mükemmel değildir. Çoğaltmada bu yetersizlik &quot;son çoğaltma problemi&quot; olarak adlandırılır ve her bir kopyalama yinelemesi sırasında telomer tekrarlarının bir kısmının kaybedilmesi ile sonuçlanır 6 , 7 . Telomerere uzunluğu, telomeraz 8 , 9&#39;un yerini alan bir enzim olan hücre bölünmesinden sonra restore edilebilir. Telomeraz ise, ancakInsan somatik hücrelerinin çoğunda aktive olur ve sonuç olarak, zamanla telomer kısalır ve sonunda hücresel yaşlanmaya neden olur 10 . Telomer kısaltılmasına bağlı olarak, telomeres yaşlanmanın ve yaşla ilişkili hastalık riski taşıyan bir biyolojik belirteç olarak değerlendirilir 11,12. Ayrıca, telomer uzunluğu genetik, çevresel ve yaşam tarzı faktörleri ve oksidatif stres gibi diğer uyaranlardan etkilenebilir ve bu da telomer uzunluğunun toksikolojik, epidemiyolojik ve davranışsal araştırmalarda biyolojik belirteç olarak rol oynayabileceğini gösterir 13,14,15. Bu makale, Mender ve Shay 2 ve Kimura ve diğerleri tarafından uyarlanmış bir modifiye terminal kısıtlama fragmanı (TRF) analizi kullanılarak telomer uzunluğunu ölçmek için bir teknik göstermektedir . 16 ve Herbert, Shay ve Wrig&#39;e benzerHt 1 ve Haussmann ve Mauck 17 . Geleneksel olarak, TRF analizi bir Southern blot prosedürünü içerir. Güney lekeleri, telomer uzunluğunun incelenmesi için &quot;altın standart&quot; olarak kabul edilir ve epidemiyoloji çalışmalarında lökosit telomer uzunluğunu incelemek için aktif olarak kullanılırlar 18 . Bu TRF analizi telomer tekrarlarının arkasında bırakılmış sindirilmiş genomik DNA kullanır. DNA parçaları daha sonra jel elektroforezi ile ayrılır, denatüre edilir ve bir nitroselüloz zara aktarılır. Telomer dizileri bir telomer oligonükleotid probu ile hibridize edilmiştir. Ayrı telomerleri bir membrana aktarmak yerine, diğer TRF teknikleri, DNA&#39;nın denatürasyonuna tabi tutulan ve içermeyen jel hibridizasyon teknikleri kullanmaktadır. Bazı türlerde bildirilen interstisyel telomerlerin saptanması için denatürasyonun dahil edilmesi önemlidir 19 . Denatüre edici aşamalardan yoksun prosedürler sadeceTek telli DNA terminal telomerlerde çıkıntı yapar ve interstisyel telomer dizilerine bağlanmaz 18 . TRF analizinin yanı sıra telomer uzunluğunu ölçmek için kendi avantajları ve dezavantajları olan başka teknikler de vardır. Flow-FISH tekniği, akış sitometrisi 16 , 20 kullanarak ayrı bir hücre türünün tek tek hücrelerinin ortalama telomer uzunluğunu ölçebilir. Telomerleri son derece spesifik sondalarla doğru şekilde etiketleyebilir ve insan hatalarını otomasyon yoluyla azaltabilirken, Flow-FISH pahalı, daha az verimli ve yeni numuneler ve epidemiyoloji çalışmaları için yeteneğini kısıtlayan çok yetenekli bir teknisyen gerektirir 16 . Buna ek olarak, bu yöntem hücre popülasyonundaki kromozom sayısındaki potansiyel değişiklikleri hesaba katmaz. Bir başka teknik olan qPCR, epidemiyoloji çalışmaları için telomer uzunluğunu ölçme aracı olarak yaygın olarak kabul edilmektedir <suP class = &quot;xref&quot;&gt; 16 yüksek yöntemli, düşük maliyetli ve diğer yöntemlere kıyasla az miktarda DNA gereksinimi nedeniyle. Bununla birlikte, qPCR yalnızca tek bir kopyalama genine göre ortalama telomerik DNA içeriğini ölçebilir ve dolayısıyla ortalama telomer uzunluğunun dolaylı bir tahmini olur. Karşılaştırma çalışmalarında güney lekeleri ile karşılaştırıldığında yüksek bir varyans katsayısı getirir ve bu da şüpheli doğrulukla sonuçlanır 21 . TRF prosedürünün bazı çalışmalar için kullanımını sınırlayan kendi eksiklikleri bulunmaktadır. TRF teknikleri diğer yöntemlere kıyasla (örnek başına 2 ila 3 μg arasında) büyük miktarda DNA gerektirir. Bu, tekniğin, yeterli genomik DNA&#39;nın toplanabileceği ve bozulmuş DNA numunelerinde kullanılamadığı klinik örneklerin telomer uzunluğunu incelemesine sınırlar. Ek olarak, TRF analizi maliyetli ve emek gerektirir, sonuç alınması için 4-5 gün gereklidir. Bununla birlikte, TRF düşük bir değişken katsayısı üretmektedirTekrarlanabilirliğine izin vererek. Bu protokol, geleneksel Southern blottan ( yerinde jel hibridizasyonunu kullanan ) farklı olsa da, iki teknik temelde aynıdır. Burada sunulan teknik Southern blot ve jel içinde hibridizasyonun bir kombinasyonudur; Southern blot&#39;taki DNA denatürasyon adımını in-jel hibridizasyonu ile ilişkilendirmek. Bu kombinasyon, Southern lekesine kıyasla geliştirilmiş prob sinyal gücü avantajına sahiptir ve laboratuvarımızda sürekli olarak nicelenebilir sonuçlar vermiştir. Ayrıca, kemilüminesan problar yerine radyoaktif sondaların kullanılması sinyal yoğunluğunu artırır ve TRF&#39;nin analizlerini kullanıcı dostu hale getiren bir fosfor bulucu ile görselleştirme ve niceleme sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="618">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Biologics</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Rsa1, restriction enzyme</td>
			<td style="width:116px;">New England Biolabs, Inc</td>
			<td style="width:119px;">R0167S</td>
			<td style="width:167px;">10,000 U/mL, DNA digestion.&#160; Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Hinf1, restriction enzyme</td>
			<td style="width:116px;">New England Biolabs, Inc</td>
			<td style="width:119px;">R0155S</td>
			<td style="width:167px;">10,000 U/mL, DNA digestion.&#160; Comes with Cutsmart Buffer (digestion buffer)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Seakem GTG Agarose</td>
			<td style="width:116px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">50071</td>
			<td style="width:167px;">electrophoresis grade agarose</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Optikinase&#160;</td>
			<td style="width:116px;">affymetrix</td>
			<td style="width:119px;">78334X 500 UN</td>
			<td style="width:167px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">SYBR Green Nucleic Acid Stain I</td>
			<td style="width:116px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S7567</td>
			<td style="width:167px;">Syber Green</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">exactGene DNA Ladder 24- kB</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP2580100</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">C-Strand Probe (3&#39;-(G3AT2)4-&#39;5)</td>
			<td style="width:116px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Custom ordered DNA oligonucleotide</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Gamma-ATP-P32</td>
			<td style="width:116px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;">BLU502Z</td>
			<td style="width:167px;">Radioisotope</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit</td>
			<td style="width:116px;">Qiagen</td>
			<td align="right" style="width:119px;">13323</td>
			<td style="width:167px;">DNA extraction kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GE Illustra Microspin G-25 column</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">27-5325-01</td>
			<td style="width:167px;">For purification of readioactive oligo probe</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ficoll 400</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">non-ionic synthetic polymer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Equipment/Software</td>
			<td style="width:116px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Owl A5 Gel electrophoresis system (20 cm x 25 cm)</td>
			<td style="width:116px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">A5</td>
			<td style="width:167px;">Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horizon 11.4 Gel electrophoresis system (11 cm x 14 cm)</td>
			<td style="width:116px;">Corel Life Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11068020</td>
			<td style="width:167px;">Gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nylon mesh, 50, 12&#34; x 12&#34;</td>
			<td style="width:116px;">Ted Pellam, Inc</td>
			<td style="width:119px;">41-12105</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">GE Storage Phosphor Screens</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">28-9564-75</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphor Screen Exposure Cassette</td>
			<td style="width:116px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">63-0035-44</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isotemp Hybridzation Incubator</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-247-20Q</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Cylindrical hybridization tubes</td>
			<td style="width:116px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">13-247-300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">The Belly Dancer orbital shaker</td>
			<td style="width:116px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">Z768499-1EA</td>
			<td style="width:167px;">Orbital shaker</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Typhoon 9400</td>
			<td style="width:116px;">ABI</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">For imaging of gels and phosphor screens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GraphPad Prism 6</td>
			<td style="width:116px;">GraphPad</td>
			<td style="width:119px;">Version 6.05</td>
			<td style="width:167px;">Graphing Program</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Microsoft Excel</td>
			<td style="width:116px;">Microsoft</td>
			<td style="width:119px;">Office 365</td>
			<td style="width:167px;">Spreadsheet program</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Nanodrop</td>
			<td style="width:116px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanodrp 2000</td>
			<td style="width:167px;">Spectrophotometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modified terminal restriction fragment analysis for quantifying telomere length using in-gel hybridization

Telomer uzunluğunu ölçmek için her biri kendi avantajları ve dezavantajları olan çeşitli teknikler vardır. Geleneksel yaklaşım olan Telomere Restriction Fragment (TRF) analizi, genomik DNA örneklerinin restriksiyon enzimleri ile sindirilerek telomer DNA tekrarlarının ve bazı alt telomerik DNA&#39;nın bırakıldığı bir DNA hibridizasyon tekniğini kullanmaktadır. Bunlar, agaroz jel elektroforezi ile ayrılır, bir filtre zarına aktarılır ve telomer kısıtlama fragmanlarını görselleştirmek için kimyasal parlaklık veya radyoaktivite ile etiketlenen oligonükleotit problarına melezleştirilir. Bu yaklaşım, PCR gibi diğer tekniklerden daha büyük miktarda DNA gerektirirken, bir hücre popülasyonunun telomer uzunluğu dağılımını ölçebilir ve mutlak kilobazda ifade edilen ölçüm sağlar. Bu el yazması, telomer uzunluğunu belirlemek için değiştirilmiş bir DNA hibridizasyon prosedürünü gösterir. Genomik DNA ilk önce sınır enzimleri ile sindirilir (kesilmezTelomerleri) ve agaroz jel elektroforezi ile ayrıldı. Jel daha sonra kurutulur ve DNA denatüre edilir ve yerinde bir radyo-etiketlenmiş oligonükleotid proba hibridize edilir . Bu yerinde hibridizasyon, telomer DNA&#39;sının kaybolmasını önler ve sinyal yoğunluğunu geliştirir. Hibritlemeyi takiben jeller fosforlu elekler kullanılarak görüntülendi ve telomer uzunluğu bir grafik programı kullanılarak nicelleştirildi. Bu prosedür Drs laboratuarları tarafından geliştirildi. Texas Üniversitesi&#39;nden Woodring Wright ve Jerry Shay, Güneybatı 1 , 2 . Burada, bazı değişiklikler yapılarak bu prosedürün ayrıntılı bir tarifi sunulmaktadır.

BJ-hTERT hücre dizisinden (telomeraz ölümsüzleştirilmiş insan sünnet derisi fibroblastları) 22 ve insan periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC&#39;ler) izole edilen üç DNA konsantrasyonu (1, 2 ve 3 μg) telomer uzunluğu açısından analiz edildi. Tablo 1 , her DNA örneği için şerit atamalarını göstermektedir. Şekil 1 , jelin bir nükleik asit flüoresan lekesini göstermektedir. Moleküler...

Watch this Scientific Journal Video about Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization at JoVE.com

Modified Terminal Restriction Fragment Analysis for Quantifying Telomere Length Using In-gel Hybridization

Bu makalede, telomer uzunluğunun hızlı ve etkin bir şekilde doğrudan ölçülmesini sağlayan, modifiye edilmiş bir terminal kısıtlama fragmanı analizi kullanarak telomer uzunluğunun nicelleştirilmesi için ayrıntılı bir protokol tartışılmıştır. Bu teknik telomer uzunluğunu ölçmek için çeşitli DNA hücreleri kaynaklarına uygulanabilir.

Jel Hibridizasyonunu Kullanarak Telomer Uzunluğunu Nicellemek İçin Modifiye Terminal Restriction Fragment Analysis

There are several different techniques for measuring telomere length, each with their own advantages and disadvantages. The traditional approach, Telomere ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Laparoscopic Pancreatoduodenectomy With Modified Blumgart Pancreaticojejunostomy

Değiştirilmiş Blumgart Pancreaticojejunostomy ile laparoskopik Pancreatoduodenectomy

Minimally invasive pancreatic resections are technically demanding but rapidly increasing in popularity. In contrast to laparoscopic distal ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Droplet Digital TRAP ddTRAP: Adaptation of the Telomere Repeat Amplification Protocol to Droplet Digital Polymerase Chain Reaction

Damlacık dijital tuzak (ddTRAP): telomere tekrar amplifikasyon protokolünün droplet dijital polimeraz zincir reaksiyonuna adaptasyon

The telomere repeat amplification protocol (TRAP) is the most widely used assay to detect telomerase activity within a given a sample. The polymerase ...

Testing Targeted Therapies in Cancer using Structural DNA Alteration Analysis and Patient-Derived Xenografts

Yapısal DNA Alterasyon Analizi ve Hasta Kaynaklı Ksenogreftler Kullanılarak Kanserde Hedefli Tedavilerin Test Edilmesi

We present here an integrative approach for testing efficacy of targeted therapies that combines the next generation sequencing technolo-gies, therapeutic ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Kolorektal Kanser Hücrelerinin Üç Boyutlu Küresel Kültürlerinde Probiyotiklerin Hücresiz Süpernatantı Kullanılarak Hücre Ölümünün Değerlendirilmesi

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Mapping the Structure-Function Relationships of Disordered Oncogenic Transcription Factors Using Transcriptomic Analysis

Transcriptomik Analiz Kullanarak Düzensiz Onkojenik Transkripsiyon Faktörlerinin Yapı-fonksiyon İlişkilerinin Eşlenmesini

Many cancers are characterized by chromosomal translocations which result in the expression of oncogenic fusion transcription factors. Typically, these ...

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Chemical Conjugation of a Purified DEC-205-Directed Antibody with Full-Length Protein for Targeting Mouse Dendritic Cells In Vitro and In Vivo

Vitro ve In Vivo'da Fare Dendritik Hücrelerini Hedeflemek için Tam Uzunlukta Proteinli Saflaştırılmış DEC-205 Yönlendirilmiş Antikorun Kimyasal Konjugasyonu

Targeted antigen delivery to cross-presenting dendritic cells (DC) in vivo efficiently induces T effector cell responses and displays a valuable approach ...

Natural Killer (NK) and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Natural Killer NK and CAR-NK Cell Expansion Method using Membrane Bound-IL-21-Modified B Cell Line

Doğal Öldürücü (NK) ve Membran Bound-IL-21-Modifiye B Hücre Hattı Kullanarak CAR-NK Hücre Genleşme Yöntemi

Chimeric antigen receptor (CAR)-modified immune cell therapy has become an emerging treatment for cancers and infectious diseases. NK-based immunotherapy, ...

CAM-Delam Assay to Score Metastatic Properties by Quantifying Delamination and Invasion Capacity of Cancer Cells

Kanser Hücrelerinin Delaminasyon ve İnvazyon Kapasitesini Ölçerek Metastatik Özellikleri Puanlamak için CAM-Delam Testi

The major cause of cancer-related deaths is metastasis formation (i.e., when cancer cells spread from the primary tumor to distant organs and form ...

Multiparametric Tumor Organoid Drug Screening Using Widefield Live-Cell Imaging for Bulk and Single-Organoid Analysis

Toplu ve Tek-Organoid Analizi için Geniş Alan Canlı Hücre Görüntüleme Kullanılarak Multiparametrik Tümör Organoid İlaç Taraması

Patient-derived tumor organoids (PDTOs) hold great promise for preclinical and translational research and predicting the patient therapy response from ex ...