Name: reprogramming primary amniotic fluid and membrane cells to pluripotency in xeno-free conditions
Uploaded: 2017-11-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions at JoVE.com

هذا العمل كان يدعمها في فوندز Medizinische Forschung في جامعة زيوريخ، فورشونجسكريديت من جامعة زيوريخ، وديكينستون NMSCh تحت 10.216 الزمالات و 12.176، المجتمع السويسري للقلب، "العلم الوطني السويسري" مؤسسة في إطار المنحة [320030-122273] و [310030-143992]، البرنامج الإطاري السابع، صمام الحياة، اللجنة الأوروبية في إطار منحة [242008]، ومؤسسة مايينفيش أولغا، مؤسسة امدو، بدء المنحة 2012 من مستشفى جامعة زيورخ، و التمويل الداخلي لمعهد السرطان ميتشل.

البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية للجنة الأخلاقيات البحثية البشرية. تم الحصول على موافقة خطية من المريض لاستخدام السائل السلوى للبحوث.
هذا البروتوكول يتبع سياسات رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة لجامعة جنوب ألاباما.
1-العزلة والثقافة من الخل...

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Somatic+Cells.">Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Trounson, A., DeWitt, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+progressing+to+the+clinic.">Pluripotent stem cells progressing to the clinic.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (3), 194-200 (2016).</li><li>Schmidt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatally+fabricated+autologous+human+living+heart+valves+based+on+amniotic+fluid+derived+progenitor+cells+as+single+cell+source.">Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source.</a> Circulation. 116 (11 Suppl), I64-I70 (2007).</li><li>Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatally+harvested+cells+for+cardiovascular+tissue+engineering:+Fabrication+of+autologous+implants+prior+to+birth.">Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth.</a> Placenta. 32, S316-S319 (2011).</li><li>Weber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatally+engineered+autologous+amniotic+fluid+stem+cell-based+heart+valves+in+the+fetal+circulation.">Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation.</a> Biomaterials. 33 (16), 4031-4043 (2012).</li><li>Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+living+cardiac+and+venous+valve+replacements:+current+status+and+future+prospects.">Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects.</a> Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).</li><li>Slamecka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-integrating+episomal+plasmid-based+reprogramming+of+human+amniotic+fluid+stem+cells+into+induced+pluripotent+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).</li><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Transgene-Free+Amniotic-Fluid-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Autologous+Cell+Therapy.">Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy.</a> Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).</li><li>Pipino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trisomy+21+mid-trimester+amniotic+fluid+induced+pluripotent+stem+cells+maintain+genetic+signatures+during+reprogramming:+implications+for+disease+modeling+and+cryobanking.">Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking.</a> Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+umbilical+cord+matrix+and+amniotic+membrane+mesenchymal+cells.">Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells.</a> J Biol. Chem. 285 (15), 11227-11234 (2010).</li><li>Ge, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Amniotic+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+May+Generate+a+Universal+Source+of+Cardiac+Cells.">Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells.</a> Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).</li><li>Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+iPSCs+from+cells+of+fibroblastic+and+epithelial+origin+by+means+of+the+oriP/EBNA-1+episomal+reprogramming+system.">Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system.</a> Stem Cell Res. Ther. 6 (1), (2015).</li><li>Kang, N. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+antitumor+therapeutic+strategies+of+human+amniotic+membrane+and+amniotic+fluid-derived+stem+cells.">Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells.</a> Cancer Gene Ther. 19 (8), 517-522 (2012).</li><li>Moschidou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valproic+Acid+Confers+Functional+Pluripotency+to+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cells+in+a+Transgene-free+Approach.">Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach.</a> Mol. Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Vector+and+Transgene+Sequences.">Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences.</a> Science. 324 (5928), 797-801 (2009).</li><li>Mart&#237;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pluripotent+stem+cells.">Characterization of pluripotent stem cells.</a> Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).</li><li>Chan, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+distinguishes+bona+fide+human+iPS+cells+from+partially+reprogrammed+cells.">Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells.</a> Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).</li><li>Adewumi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative.">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nat. Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).</li><li>M&#252;ller, F. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioinformatic+assay+for+pluripotency+in+human+cells.">A bioinformatic assay for pluripotency in human cells.</a> Nature Methods. 8 (4), 315-317 (2011).</li><li>Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellNet:+Network+Biology+Applied+to+Stem+Cell+Engineering.">CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering.</a> Cell. 158 (4), 903-915 (2014).</li><li>Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TRA-1-60+and+TRA-1-81+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Markers+Are+Expressed+on+Podocalyxin+in+Embryonal+Carcinoma.">The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma.</a> STEM CELLS. 25 (3), 723-730 (2007).</li><li>Ohnishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+Termination+of+Reprogramming+In+Vivo+Leads+to+Cancer+Development+through+Altered+Epigenetic+Regulation.">Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation.</a> Cell. 156 (4), 663-677 (2014).</li><li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods.">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).</li><li>M&#252;ller, F. -. J., Goldmann, J., L&#246;ser, P., Loring, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+to+standardize+teratoma+assays+used+to+define+human+pluripotent+cell+lines.">A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines.</a> Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).</li><li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions.">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).</li></ol>

المرحلة الأولى من إنشاء اللجنة التوجيهية من الخلايا الجذعية الجنينية ينطوي على استخراج الخلايا المصدر من الأنسجة الجنينية، والثقافة، والتوسع، وإدخال والبلازميدات إعادة برمجة ابيسومال. هذه المرحلة هو متبوعاً بنقطة ثقافة حوالي 14-18 يوما قبل أن يمكن توسيع المستعمرات الأولى أعيدت برمجتها ت...

تكنولوجيا الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (اللجنة التوجيهية) يرتفع عن المخدرات والمرض والنمذجة التنموية، وعلاجات استبدال خلية المحتملة فحص السمية1،،من23. العلاج البديلة نظرياً يمكن أن يتحقق عن طريق حقن الخلايا، في المختبر متباينة زرع الأنسجة (مثل بقع القلب)، أو تسترشد التجديد عن طريق هندسة الأنسجة. السائل السلوى (أفسك) وغشاء الخلايا الجذعية (أمسك) مصدر ممتاز لخلايا لهذه التدخلات أما مباشرة4،5،،من67 أو كمحتوى خلية بداية لإعادة برمجة في بلوريبوتينسي8،،من910،،من1112.
استخدام نهج أوائل نظم الاستزراع غير معرف أو إعادة برمجة الأساليب التي تتطلب إدماج يستتبع الجينوم بنيات9،10،،من1112. دراسة حديثة تستخدم وسيلة خالية من كرة، حتى ولو تم استخدام مصفوفة مرفق غشاء أقل محددة (بم)، لإنشاء اللجنة التوجيهية من الخلايا الظهارية السائل السلوى. ومع ذلك، لم تدرج المقايسة تشكيل تيراتوما في الدراسة جنبا إلى جنب مع ثروة من البيانات الجزيئية وفي المختبر. تم العثور على الخلايا الظهارية السائل السلوى يكون من كفاءة إعادة برمجة أعلى 8-fold تقريبا بالمقارنة مع الخلايا الليفية الولدان13. في دراسة أخرى، وجد أيضا الخلايا الجذعية الوسيطة من السائل السلوى أن تعاد برمجتها في اللجنة التوجيهية بكثير أعلى كفاءة12.
يمكن أن تكون متباينة في أنسجة ممثل كل الطبقات الجرثومية 3 الخلايا الجذعية Pluripotent وهكذا تنطوي على إمكانات أوسع. طب الأطفال المرضى يمكن أن تستفيد من حصاد وإعادة برمجة، وهندسة الأنسجة بالخلايا الجذعية السائل السلوى ذاتي بريناتالي والخلايا الجذعية غشاء السلي الولادة. وعلاوة على ذلك، يمكن نظرياً المعونة المستوى المنخفض نسبيا للتفريق بين الخلايا الجذعية الجنينية (أقل من الخلايا الجذعية البالغة14،15) في التصدي لاستبقاء لوحظ تحيز جينية من الخلايا المصدر في اللجنة التوجيهية16.
نقدم هنا بروتوكولا لإعادة برمجة السائل السلوى وغشاء الخلايا الجذعية إلى بلوريبوتينسي في تعريف كيميائيا خالية من كرة متوسطة E8 في المؤتلف فيترونيكتين17 (VTN) باستخدام البلازميدات ابيسومال18. والميزة الرئيسية لخلايا السائل والغشاء السلي كمصدر للخلايا لإعادة برمجة يكمن في توافرها قبل والولادة وبالتالي هذا النهج سيفيد أساسا للبحث في هندسة الأنسجة طب الأطفال.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Tumor Dissociation Kit, human</td>
			<td >Miltenyi Biotec</td>
			<td >130-095-929</td>
			<td >tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gentleMACS Dissociator</td>
			<td >Miltenyi Biotec</td>
			<td >130-093-235</td>
			<td >tissue dissociation system, dissociator</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Scientific&#8482; Shandon&#8482; Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm)</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >3120032</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#181;m cell strainers</td>
			<td >Corning</td>
			<td >10054-456</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 medium</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >32404014&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rocking platform</td>
			<td >VWR</td>
			<td >40000-300</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml centrifuge tubes</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >339652</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 ml centrifuge tubes</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >339650</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EBM-2 basal medium</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >CC-3156</td>
			<td >basal medium for AFMC medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated)</td>
			<td >Prospec Bio</td>
			<td >CYT-218</td>
			<td >bFGF, supplement for AFMC medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGF Human, Pichia</td>
			<td >Prospec Bio</td>
			<td >CYT-332&#160;</td>
			<td >EGF, supplement for AFMC medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant</td>
			<td >Prospec Bio</td>
			<td >CYT-022</td>
			<td >IGF, supplement for AFMC medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >10439024</td>
			<td >FBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >15240062&#160;</td>
			<td >for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells!</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accutase cell detachment solution</td>
			<td >StemCell Technologies</td>
			<td >07920</td>
			<td >cell detachment enzyme</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CryoStor&#8482; CS10</td>
			<td >StemCell Technologies</td>
			<td >07930</td>
			<td >complete freezing medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS, pH 7.4</td>
			<td >Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td >10010023&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >12362</td>
			<td >for plasmid isolation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pEP4 E02S EN2K</td>
			<td >Addgene</td>
			<td >20925</td>
			<td >EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pEP4 E02S ET2K</td>
			<td >Addgene</td>
			<td >20927</td>
			<td >ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pCEP4-M2L</td>
			<td >Addgene</td>
			<td >20926</td>
			<td >M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >ND-2000C</td>
			<td >spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neon&#174; Transfection System</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >MPK5000</td>
			<td >transfection system, components: 
			Neon pipette - transfection pipette 
			Neon device - transfection device</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neon&#174; Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >MPK1025</td>
			<td >consumables kit for the Neon Transfection System, it contains: 
			Neon tip - transfection tip 
			Neon tube - transfection tube 
			buffer R - resuspension buffer 
			buffer E - electrolytic buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stemolecule&#8482; Sodium Butyrate</td>
			<td >StemGent</td>
			<td >04-0005</td>
			<td >small molecule enhancer of reprogramming</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TeSR-E8</td>
			<td >StemCell Technologies</td>
			<td >05940</td>
			<td >E8 medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vitronectin XF&#8482;</td>
			<td >StemCell Technologies</td>
			<td >07180</td>
			<td >VTN, stock concentration 250 &#181;g/ml, used for coating at 1 &#181;g/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CellAdhere&#8482; Dilution Buffer</td>
			<td >StemCell Technologies</td>
			<td >07183</td>
			<td >vitronectin dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UltraPure&#8482; 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >15575020</td>
			<td >dilute with PBS to 0.5 mM before use</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EVOS&#174; FL Imaging System</td>
			<td >Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td >AMF4300</td>
			<td >LCD imaging microscope system</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CKX53 Inverted Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td ></td>
			<td >phase contrast cell culture microscope</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pierce&#8482; 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >28908</td>
			<td >dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 &#176;C for 1 week</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Perm Buffer III</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >558050</td>
			<td >permeabilization buffer, chill to -20 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse IgG1, &#954; Isotype Control, Alexa Fluor&#174; 488</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >557782</td>
			<td >isotype control for Oct3/4A, Nanog</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse IgG1, &#954; Isotype Control, Alexa Fluor&#174; 647</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >557783</td>
			<td >isotype control for Sox2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor&#174; 488</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >561628</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor&#174; 488</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >560791</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor&#174; 647</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >562139</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse IgGM, &#954; Isotype Control, Alexa Fluor&#174; 488</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >401617</td>
			<td >isotype control for TRA-1-60</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse IgGM, &#954; Isotype Control, Alexa Fluor&#174; 647</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >401618</td>
			<td >isotype control for TRA-1-81</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor&#174; 488</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >330613</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor&#174; 647</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >330705</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse IgG1, &#954; Isotype Control, Alexa Fluor&#174; 488</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >400129</td>
			<td >isotype control for SSEA-1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse IgG3, &#954; Isotype Control, Alexa Fluor&#174; 647</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >401321</td>
			<td >isotype control for SSEA-4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor&#174; 488</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >323010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor&#174; 647</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >330407</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Affinipure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor&#174; 488</td>
			<td >Jackson Immunoresearch</td>
			<td >115-606-068</td>
			<td >use at a dilution of 1:600 or further optimize</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Affinipure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor&#174; 647</td>
			<td >Jackson Immunoresearch</td>
			<td >115-546-068</td>
			<td >use at a dilution of 1:600 or further optimize</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td >D21490</td>
			<td >stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning&#174; Matrigel&#174; Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free</td>
			<td >Corning</td>
			<td >356231</td>
			<td >basement membrane matrix (BMM)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >scid-beige mice, female</td>
			<td >Taconic</td>
			<td >CBSCBG-F</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNeasy Plus Mini Kit (50)</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >74134</td>
			<td >RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T-25 flasks, tissue culture-treated</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >156367</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T-75 flasks, tissue culture-treated</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >156499</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunc&#8482; tissue-culture dish</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >12-567-650&#160;</td>
			<td >10 cm tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plates, tissue-culture treated</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >140675</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neubauer counting chamber (hemacytometer)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >15170-173</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mr. Frosty&#8482; Freezing Container</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >5100-0001&#160;</td>
			<td >freezing container</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml</td>
			<td >Corning</td>
			<td >352058</td>
			<td >5 ml polystyrene tubes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf tubes, 1.5 ml</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >05-402-96</td>
			<td >1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR tubes, 200 &#181;l</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >14-222-262</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pipette tips, 100 to 1250 &#181;l</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >02-707-407</td>
			<td >narrow-bore 1 mL tips</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pipette tips, 5 to 300 &#181;l</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >02-707-410</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pipette tips, 0.1 to 10 &#181;l</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >02-707-437</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >wide-bore pipette tips, 1000 &#181;l</td>
			<td >VWR</td>
			<td >89049-166</td>
			<td >wide-bore 1 mL tips</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass Pasteur pipettes</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >13-678-20A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ethanol, 200 proof</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >04-355-451</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >vortex mixer</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10153-842</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >155409</td>
			<td >glass-bottom confocal-grade cultureware</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >22G needles</td>
			<td >VWR</td>
			<td >82002-366</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >insulin syringes</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >22-253-260</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >HT501128-4L</td>
			<td >fixation of explanted teratomas</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip</td>
			<td >Illumina</td>
			<td >BD-103-0204</td>
			<td >expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PrimeView Human Genome U219 Array Plate</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >901605</td>
			<td >expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneChip&#8482; Human Genome U133 Plus 2.0 Array</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >902482</td>
			<td >expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PluriTest&#174;</td>
			<td >Coriell Institute</td>
			<td ></td>
			<td >www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data - *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CellNet</td>
			<td >Johns Hopkins University</td>
			<td ></td>
			<td >cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data - *.cel files, soon to support RNA sequencing data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reprogramming primary amniotic fluid and membrane cells to pluripotency in xeno-free conditions

حصلت العلاج ذاتي يستند إلى الخلية على خطوة أقرب إلى الواقع مع الأخذ بالخلايا الجذعية المستحثة pluripotent. الخلايا الجذعية الجنينية، مثل السائل السلوى وغشاء الخلايا الجذعية الوسيطة، تمثل نوعا فريداً من خلايا غير متمايزة بالوعد في هندسة الأنسجة وإعادة برمجة في اللجنة التوجيهية للتدخلات المستقبلية في طب الأطفال والخلايا الجذعية المصرفية. يصف البروتوكول المعروضة هنا إجراء أمثل لاستخراج واستزراع الابتدائي السلي السائل وغشاء الخلايا الجذعية الوسيطة وتوليد ابيسومال الناجمين عن الخلايا الجذعية pluripotent من هذه الخلايا في ثقافة محددة بالكامل كيميائيا شروط استخدام فيترونيكتين الماشوب البشري والمتوسطة E8. ويرد أيضا وصف خطوط جديدة بتطبيق أساليب صارمة – التدفق الخلوي والتصوير [كنفوكل]، وتشكيل تيراتوما والتنميط النسخي –. الأسطر التي تم إنشاؤها حديثا تعبر عن علامات للخلايا الجذعية الجنينية – Oct3/4A، نانج، Sox2، وهيئة تنظيم الاتصالات-1-60، وهيئة تنظيم الاتصالات-1-81، سا-4 – بينما يجري سلبية بالنسبة لعلامة سا-1. خطوط الخلايا الجذعية تشكل تيراتوماس في الفئران بيج مشمولان في 6-8 أسابيع وتيراتوماس تحتوي على أنسجة تمثيلية من جميع الطبقات الجرثومية الثلاث. التنميط النسخي للخطوط بتقديم البيانات ميكرواري التعبير العالمي إلى خوارزمية تقييم بلوريبوتينسي بيوينفورماتيك تعتبر جميع خطوط pluripotent وذلك، أن هذا النهج بديل جذاب للتجارب الحيوانية. يمكن بسهولة استخدام الخطوط التوجيهية الجديدة في المصب التجارب التي تنطوي على الاستفادة المثلى من التمايز وهندسة الأنسجة.

تم الحصول على موافقة خطية مستنيرة من المرضى قبل الحصاد السائل السلوى لأغراض الاختبار وتكريس قاسمة صغيرة من السائل للبحوث الوراثية. مطلوب لا موافقة لاستخدام الغشاء السلوى في البحوث كما المشيمة تمثل النفايات الطبية. الخلايا الجذعية السائل والغشاء السلي عرض خصائص الوسيطة...

Watch this Scientific Journal Video about Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions at JoVE.com

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

ويصف هذا البروتوكول إعادة برمجة الابتدائي السلي السائل وغشاء الخلايا الجذعية الوسيطة في الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent استخدام نهج ابيسومال غير دمج في ظروف محددة بالكامل كيميائيا. وترد تفاصيل إجراءات استخراج والثقافة، وإعادة برمجة، وتوصيف الخلايا الجذعية المستحثة pluripotent الناتجة بطرق صارمة.

إعادة برمجة الابتدائي السائل السلوى وغشاء الخلايا بلوريبوتينسي في ظروف خالية من كرة

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

مستقر وكفاءة التحوير الوراثي للخلايا في الكبار ماوس V-SVZ لتحليل العصبية الخلايا الجذعية الذاتية الحكم والآثار لغير المتمتعة بالحكم الذاتي

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

إنتاج الخلايا الجذعية المحفزة من الفأر الأمنيوسي الخلايا السوائل عن طريق نظام ينقول

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

الإنتاج والإدارة العلاجية الجذعية الوسيطة / اللحمية الخليوي (MSC) الأجسام الشبه الكروية معبى في الثقافات 3-D تحت ظروف كره خالية

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

إعادة برمجة خلايا المشروطة للأطفال الإنسان المريء طلائي للاستخدام في هندسة الأنسجة وأمراض التحقيق

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

التحليل الحسابي ل Germline ايليجانس كاينورهابديتيس دراسة توزيع الأنوية، والبروتينات، وسيتوسكيليتون

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

التعريف والتحقق من الصحة للشيخوخة الخلوية في الخلايا البشرية الأولية

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

خالية كرة محددة وشروط الثقافة خالية من علبة التغذية بالورق "نماذج الخلية الشبكية" المستمدة من اللجنة التوجيهية جيل من البشر

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

عن طريق الحقن الوريدي وداخل السلي في الرحم زرع في نموذج مورين

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

تحريض غشائي التمايز في خلايا القلب السلف تحت ظروف المصل منخفضة

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

توجيه نسب إعادة برمجة الماوس الكبار تنتجها الخلايا الليفية لموروث محمر

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...