Name: reprogramming primary amniotic fluid and membrane cells to pluripotency in xeno-free conditions
Uploaded: 2017-11-27T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי Medizinische Forschung Fonds באוניברסיטת ציריך, Forschungskredit של אוניברסיטת ציריך, NMS SCIEX שלCh תחת מלגות 10.216 ו- 12.176, שוויצרי החברה לקרדיולוגיה, את המדע הלאומית השוויצרית קרן תחת גרנט [320030-122273] ו- [310030-143992], לתכנית המסגרת השביעית, שסתום החיים, הנציבות האירופית תחת גרנט [242008], קרן Mayenfisch אולגה, קרן EMDO, המענק סטארט-אפ 2012 של בית החולים האוניברסיטאי בציריך, ו מימון פנימי של מכון הסרטן מיטשל.

הפרוטוקול מנחים המוסדי של ועדת האתיקה למחקר אנושי. הסכמה בכתב של המטופל הושג באמצעות השפיר למחקר.
פרוטוקול זה מלווה את מדיניות ראש הוועדה אכפת לי חיה מוסדיים שימוש של אוניברסיטת דרום אלבמה.
1. בידוד והתרבות של ראשי מי השפיר בתאי גזע Mesenchymal
<ol><li>
ציפוי של ת?...

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126 (4), 663-676 (2006).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Lines+Derived+from+Human+Somatic+Cells.">Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells.</a> Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).</li><li>Trounson, A., DeWitt, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+progressing+to+the+clinic.">Pluripotent stem cells progressing to the clinic.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17 (3), 194-200 (2016).</li><li>Schmidt, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatally+fabricated+autologous+human+living+heart+valves+based+on+amniotic+fluid+derived+progenitor+cells+as+single+cell+source.">Prenatally fabricated autologous human living heart valves based on amniotic fluid derived progenitor cells as single cell source.</a> Circulation. 116 (11 Suppl), I64-I70 (2007).</li><li>Weber, B., Zeisberger, S. M., Hoerstrup, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatally+harvested+cells+for+cardiovascular+tissue+engineering:+Fabrication+of+autologous+implants+prior+to+birth.">Prenatally harvested cells for cardiovascular tissue engineering: Fabrication of autologous implants prior to birth.</a> Placenta. 32, S316-S319 (2011).</li><li>Weber, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prenatally+engineered+autologous+amniotic+fluid+stem+cell-based+heart+valves+in+the+fetal+circulation.">Prenatally engineered autologous amniotic fluid stem cell-based heart valves in the fetal circulation.</a> Biomaterials. 33 (16), 4031-4043 (2012).</li><li>Kehl, D., Weber, B., Hoerstrup, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+living+cardiac+and+venous+valve+replacements:+current+status+and+future+prospects.">Bioengineered living cardiac and venous valve replacements: current status and future prospects.</a> Cardiovasc. Pathol. 25 (4), 300-305 (2016).</li><li>Slamecka, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-integrating+episomal+plasmid-based+reprogramming+of+human+amniotic+fluid+stem+cells+into+induced+pluripotent+stem+cells+in+chemically+defined+conditions.">Non-integrating episomal plasmid-based reprogramming of human amniotic fluid stem cells into induced pluripotent stem cells in chemically defined conditions.</a> Cell Cycle. 15 (2), 234-249 (2016).</li><li>Jiang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Transgene-Free+Amniotic-Fluid-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+for+Autologous+Cell+Therapy.">Human Transgene-Free Amniotic-Fluid-Derived Induced Pluripotent Stem Cells for Autologous Cell Therapy.</a> Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).</li><li>Pipino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trisomy+21+mid-trimester+amniotic+fluid+induced+pluripotent+stem+cells+maintain+genetic+signatures+during+reprogramming:+implications+for+disease+modeling+and+cryobanking.">Trisomy 21 mid-trimester amniotic fluid induced pluripotent stem cells maintain genetic signatures during reprogramming: implications for disease modeling and cryobanking.</a> Cell. Reprogram. 16 (5), 331-344 (2014).</li><li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+from+umbilical+cord+matrix+and+amniotic+membrane+mesenchymal+cells.">Generation of human induced pluripotent stem cells from umbilical cord matrix and amniotic membrane mesenchymal cells.</a> J Biol. Chem. 285 (15), 11227-11234 (2010).</li><li>Ge, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Amniotic+Mesenchymal+Stem+Cell-Derived+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+May+Generate+a+Universal+Source+of+Cardiac+Cells.">Human Amniotic Mesenchymal Stem Cell-Derived Induced Pluripotent Stem Cells May Generate a Universal Source of Cardiac Cells.</a> Stem Cells Dev. 21 (15), 2798-2808 (2012).</li><li>Drozd, A. M., Walczak, M. P., Piaskowski, S., Stoczynska-Fidelus, E., Rieske, P., Grzela, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+iPSCs+from+cells+of+fibroblastic+and+epithelial+origin+by+means+of+the+oriP/EBNA-1+episomal+reprogramming+system.">Generation of human iPSCs from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system.</a> Stem Cell Res. Ther. 6 (1), (2015).</li><li>Kang, N. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+antitumor+therapeutic+strategies+of+human+amniotic+membrane+and+amniotic+fluid-derived+stem+cells.">Potential antitumor therapeutic strategies of human amniotic membrane and amniotic fluid-derived stem cells.</a> Cancer Gene Ther. 19 (8), 517-522 (2012).</li><li>Moschidou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Valproic+Acid+Confers+Functional+Pluripotency+to+Human+Amniotic+Fluid+Stem+Cells+in+a+Transgene-free+Approach.">Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach.</a> Mol. Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).</li><li>Kim, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+memory+in+induced+pluripotent+stem+cells.">Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).</li><li>Chen, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture.">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).</li><li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cells+Free+of+Vector+and+Transgene+Sequences.">Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences.</a> Science. 324 (5928), 797-801 (2009).</li><li>Mart&#237;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+pluripotent+stem+cells.">Characterization of pluripotent stem cells.</a> Nat. Protoc. 8 (2), 223-253 (2013).</li><li>Chan, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+cell+imaging+distinguishes+bona+fide+human+iPS+cells+from+partially+reprogrammed+cells.">Live cell imaging distinguishes bona fide human iPS cells from partially reprogrammed cells.</a> Nat. Biotechnol. 27 (11), 1033-1037 (2009).</li><li>Adewumi, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+human+embryonic+stem+cell+lines+by+the+International+Stem+Cell+Initiative.">Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative.</a> Nat. Biotechnol. 25 (7), 803-816 (2007).</li><li>M&#252;ller, F. -. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bioinformatic+assay+for+pluripotency+in+human+cells.">A bioinformatic assay for pluripotency in human cells.</a> Nature Methods. 8 (4), 315-317 (2011).</li><li>Cahan, P., Li, H., Morris, S. A., Lummertz da Rocha, E., Daley, G. Q., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellNet:+Network+Biology+Applied+to+Stem+Cell+Engineering.">CellNet: Network Biology Applied to Stem Cell Engineering.</a> Cell. 158 (4), 903-915 (2014).</li><li>Schopperle, W. M., DeWolf, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+TRA-1-60+and+TRA-1-81+Human+Pluripotent+Stem+Cell+Markers+Are+Expressed+on+Podocalyxin+in+Embryonal+Carcinoma.">The TRA-1-60 and TRA-1-81 Human Pluripotent Stem Cell Markers Are Expressed on Podocalyxin in Embryonal Carcinoma.</a> STEM CELLS. 25 (3), 723-730 (2007).</li><li>Ohnishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+Termination+of+Reprogramming+In+Vivo+Leads+to+Cancer+Development+through+Altered+Epigenetic+Regulation.">Premature Termination of Reprogramming In Vivo Leads to Cancer Development through Altered Epigenetic Regulation.</a> Cell. 156 (4), 663-677 (2014).</li><li>Schlaeger, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+non-integrating+reprogramming+methods.">A comparison of non-integrating reprogramming methods.</a> Nature Biotechnology. 33 (1), 58-63 (2014).</li><li>M&#252;ller, F. -. J., Goldmann, J., L&#246;ser, P., Loring, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+call+to+standardize+teratoma+assays+used+to+define+human+pluripotent+cell+lines.">A call to standardize teratoma assays used to define human pluripotent cell lines.</a> Cell Stem Cell. 6 (5), 412-414 (2010).</li><li>Beers, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passaging+and+colony+expansion+of+human+pluripotent+stem+cells+by+enzyme-free+dissociation+in+chemically+defined+culture+conditions.">Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 2029-2040 (2012).</li></ol>

השלב הראשוני של דור iPSC של תאי גזע עובריים מצריכה הפקת תאי המקור של רקמות העובר שלהם, הרחבה, ותרבות הקדמה של פלסמידים התיכנות episomal. שלב זה ואחריו תקופת תרבות בסביבות 14-18 ימים לפני ניתן להרחיב את המושבות מלא reprogrammed הראשון. השלב האחרון הוא התבגרותם של שיבוטים iPSC. החילוץ הראשוני של תאי גזע קרום ?...

הטכנולוגיה של תאי גזע pluripotent מושרה (iPSC) מביא על פוטנציאל התא החלפת טיפולים, מחלות, מודלים התפתחותיים, ואת סמים ההקרנה רעילות1,2,3. החלפת טיפולים מושגית יכולה להיות מושגת על ידי הזרקת תא, הפריה הבדיל השרשה רקמות (כגון תיקוני הלב), או מודרכת התחדשות של הנדסת רקמות. מי שפיר (AFSC), קרום תאי גזע (AMSC) הם מקור מצוין של תאים עבור התערבויות אלה גם ישירות4,5,6,7 או כאוכלוסייה התא ההתחלתי עבור התכנות לתוך pluripotency8,9,10,11,12.
גישות מוקדם בשימוש מערכות התרבות לא מוגדר או התכנות בפעולות שירות הדורשות אינטגרציה הגנומי קשור בתזמון של בונה9,10,11,12. מחקר עדכני יותר מועסקים מדיום קסנו-חופשית, אף-על-פי מטריצה מצורף קרום המרתף פחות מוגדר (BMM) שימש, כדי ליצור iPSC מתאי אפיתל נוזל מי השפיר. עם זאת, וזמינותו היווצרות טרטומה שאינו נכלל את המחקר יחד עם שפע של הפריה הנתונים המולקולריים. נמצאו תאים אפיתל נוזל מי השפיר יש בערך 8-fold יעילות גבוהה יותר התיכנות בהשוואה neonatal fibroblasts13. במחקר אחר, גזע mesenchymal של נוזל מי השפיר נמצאו גם כדי לתכנת לתוך iPSC עם הרבה יותר יעילות12.
גזע pluripotent יכול להיות מובחן רקמות נציגם של כל שכבות הנבט 3, ולכן יש את הפוטנציאל הרחב ביותר. ילדים יכולים להרוויח מן קציר, התכנות, הנדסת רקמות של שלהם תאי גזע של נוזל מי השפיר עצמיים prenatally, קרום מי השפיר גזע תאים perinatally. יתר על כן, הנמוכות יחסית של ההתמיינות של תאי גזע עובריים (נמוך יותר מאשר14,תאי גזע בוגרים15) יכול לסייע באופן תיאורטי בהתייחסות השמירה שנצפו של epigenetic הטיה מתאי המקור iPSC16.
כאן אנו מציגים פרוטוקול עבור התכנות השפיר, קרום תאי גזע כדי pluripotency ב מוגדרים כימי בינוני E8 קסנו-חופשית vitronectin רקומביננטי17 . עולמיים בנויים (. לצרכיך המדויקים) בעזרת פלסמידים episomal18. היתרון העיקרי של נוזל מי השפיר ותאי ממברנה כמקור של תאים עבור התכנות טמון זמינותם מראש, perinatally ובכך גישה זו בעיקר ירוויחו מחקר לתוך הנדסת רקמות לילדים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	
	<tbody>
		<tr >
			<td >Tumor Dissociation Kit, human</td>
			<td >Miltenyi Biotec</td>
			<td >130-095-929</td>
			<td >tissue dissociation system, reagent kit, includes tissue dissociation tubes and tissue dissociation enzymes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >gentleMACS Dissociator</td>
			<td >Miltenyi Biotec</td>
			<td >130-093-235</td>
			<td >tissue dissociation system, dissociator</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Thermo Scientific&#8482; Shandon&#8482; Disposable Scalpel No. 10, Sterile, Individually Wrapped, 5.75 (14.6cm)</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >3120032</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >70 &#181;m cell strainers</td>
			<td >Corning</td>
			<td >10054-456</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 medium</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >32404014&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >rocking platform</td>
			<td >VWR</td>
			<td >40000-300</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50 ml centrifuge tubes</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >339652</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >15 ml centrifuge tubes</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >339650</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EBM-2 basal medium</td>
			<td >Lonza</td>
			<td >CC-3156</td>
			<td >basal medium for AFMC medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FGF 2 Human (expressed in E. coli, non-glycosylated)</td>
			<td >Prospec Bio</td>
			<td >CYT-218</td>
			<td >bFGF, supplement for AFMC medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EGF Human, Pichia</td>
			<td >Prospec Bio</td>
			<td >CYT-332&#160;</td>
			<td >EGF, supplement for AFMC medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >LR3 Insulin Like Growth Factor-1 Human Recombinant</td>
			<td >Prospec Bio</td>
			<td >CYT-022</td>
			<td >IGF, supplement for AFMC medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Fetal Bovine Serum, embryonic stem cell-qualified</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >10439024</td>
			<td >FBS</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >15240062&#160;</td>
			<td >for primary AFSC/AMSC, for routine AFSC/AMSC it should not be necessary, do not use in medium for transfected cells!</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Accutase cell detachment solution</td>
			<td >StemCell Technologies</td>
			<td >07920</td>
			<td >cell detachment enzyme</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CryoStor&#8482; CS10</td>
			<td >StemCell Technologies</td>
			<td >07930</td>
			<td >complete freezing medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PBS, pH 7.4</td>
			<td >Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td >10010023&#160;</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EndoFree Plasmid Maxi Kit (10)</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >12362</td>
			<td >for plasmid isolation</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pEP4 E02S EN2K</td>
			<td >Addgene</td>
			<td >20925</td>
			<td >EN2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, Nanog+Klf4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pEP4 E02S ET2K</td>
			<td >Addgene</td>
			<td >20927</td>
			<td >ET2K, reprogramming factors Oct4+Sox2, SV40LT+Klf4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pCEP4-M2L</td>
			<td >Addgene</td>
			<td >20926</td>
			<td >M2L, reprogramming factors c-Myc+LIN28</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >NanoDrop 2000c UV-Vis Spectrophotometer</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >ND-2000C</td>
			<td >spectrophotometer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neon&#174; Transfection System</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >MPK5000</td>
			<td >transfection system, components: 
			Neon pipette - transfection pipette 
			Neon device - transfection device</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neon&#174; Transfection System 10 &#181;L Kit</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >MPK1025</td>
			<td >consumables kit for the Neon Transfection System, it contains: 
			Neon tip - transfection tip 
			Neon tube - transfection tube 
			buffer R - resuspension buffer 
			buffer E - electrolytic buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stemolecule&#8482; Sodium Butyrate</td>
			<td >StemGent</td>
			<td >04-0005</td>
			<td >small molecule enhancer of reprogramming</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TeSR-E8</td>
			<td >StemCell Technologies</td>
			<td >05940</td>
			<td >E8 medium</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vitronectin XF&#8482;</td>
			<td >StemCell Technologies</td>
			<td >07180</td>
			<td >VTN, stock concentration 250 &#181;g/ml, used for coating at 1 &#181;g/cm2 in vitronectin dilution (CellAdhere) buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CellAdhere&#8482; Dilution Buffer</td>
			<td >StemCell Technologies</td>
			<td >07183</td>
			<td >vitronectin dilution buffer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >UltraPure&#8482; 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >15575020</td>
			<td >dilute with PBS to 0.5 mM before use</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >EVOS&#174; FL Imaging System</td>
			<td >Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td >AMF4300</td>
			<td >LCD imaging microscope system</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CKX53 Inverted Microscope</td>
			<td >Olympus</td>
			<td ></td>
			<td >phase contrast cell culture microscope</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pierce&#8482; 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >28908</td>
			<td >dilute to 4% with PBS before use, diluted can be stored at 2-8 &#176;C for 1 week</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Perm Buffer III</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >558050</td>
			<td >permeabilization buffer, chill to -20 &#176;C before use</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse IgG1, &#954; Isotype Control, Alexa Fluor&#174; 488</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >557782</td>
			<td >isotype control for Oct3/4A, Nanog</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse IgG1, &#954; Isotype Control, Alexa Fluor&#174; 647</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >557783</td>
			<td >isotype control for Sox2</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-human Oct3/4 (Human Isoform A), Alexa Fluor&#174; 488</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >561628</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-human Nanog, Alexa Fluor&#174; 488</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >560791</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-human Sox-2, Alexa Fluor&#174; 647</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >562139</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse IgGM, &#954; Isotype Control, Alexa Fluor&#174; 488</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >401617</td>
			<td >isotype control for TRA-1-60</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse IgGM, &#954; Isotype Control, Alexa Fluor&#174; 647</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >401618</td>
			<td >isotype control for TRA-1-81</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-human TRA-1-60, Alexa Fluor&#174; 488</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >330613</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-human TRA-1-81, Alexa Fluor&#174; 647</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >330705</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse IgG1, &#954; Isotype Control, Alexa Fluor&#174; 488</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >400129</td>
			<td >isotype control for SSEA-1</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse IgG3, &#954; Isotype Control, Alexa Fluor&#174; 647</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >401321</td>
			<td >isotype control for SSEA-4</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-human SSEA-1, Alexa Fluor&#174; 488</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >323010</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mouse anti-human SSEA-4, Alexa Fluor&#174; 647</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >330407</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Affinipure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor&#174; 488</td>
			<td >Jackson Immunoresearch</td>
			<td >115-606-068</td>
			<td >use at a dilution of 1:600 or further optimize</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Affinipure F(ab&#39;)2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM, Alexa Fluor&#174; 647</td>
			<td >Jackson Immunoresearch</td>
			<td >115-546-068</td>
			<td >use at a dilution of 1:600 or further optimize</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >DAPI</td>
			<td >Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td >D21490</td>
			<td >stock solution 10 mM, further dilute to 1:12.000 for a working solution</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Corning&#174; Matrigel&#174; Growth Factor Reduced, Phenol Red-Free</td>
			<td >Corning</td>
			<td >356231</td>
			<td >basement membrane matrix (BMM)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >scid-beige mice, female</td>
			<td >Taconic</td>
			<td >CBSCBG-F</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RNeasy Plus Mini Kit (50)</td>
			<td >Qiagen</td>
			<td >74134</td>
			<td >RNA isolation kit</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T-25 flasks, tissue culture-treated</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >156367</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >T-75 flasks, tissue culture-treated</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >156499</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nunc&#8482; tissue-culture dish</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >12-567-650&#160;</td>
			<td >10 cm tissue culture dish</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >6-well plates, tissue-culture treated</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >140675</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Neubauer counting chamber (hemacytometer)</td>
			<td >VWR</td>
			<td >15170-173</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Mr. Frosty&#8482; Freezing Container</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >5100-0001&#160;</td>
			<td >freezing container</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FACS tubes, Round Bottom Polystyrene Test Tube, 5ml</td>
			<td >Corning</td>
			<td >352058</td>
			<td >5 ml polystyrene tubes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Eppendorf tubes, 1.5 ml</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >05-402-96</td>
			<td >1.5 ml microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PCR tubes, 200 &#181;l</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >14-222-262</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pipette tips, 100 to 1250 &#181;l</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >02-707-407</td>
			<td >narrow-bore 1 mL tips</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pipette tips, 5 to 300 &#181;l</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >02-707-410</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >pipette tips, 0.1 to 10 &#181;l</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >02-707-437</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >wide-bore pipette tips, 1000 &#181;l</td>
			<td >VWR</td>
			<td >89049-166</td>
			<td >wide-bore 1 mL tips</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >glass Pasteur pipettes</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >13-678-20A</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >ethanol, 200 proof</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >04-355-451</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >vortex mixer</td>
			<td >VWR</td>
			<td >10153-842</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >chambered coverglass, 8-well, 1.5mm borosilicate glass</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >155409</td>
			<td >glass-bottom confocal-grade cultureware</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >22G needles</td>
			<td >VWR</td>
			<td >82002-366</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >insulin syringes</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >22-253-260</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td >Sigma-Aldrich</td>
			<td >HT501128-4L</td>
			<td >fixation of explanted teratomas</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Illumina HT-12 v4 Expression BeachChip</td>
			<td >Illumina</td>
			<td >BD-103-0204</td>
			<td >expression microarray, supported by PluriTest, discontinued by manufacturer</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PrimeView Human Genome U219 Array Plate</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >901605</td>
			<td >expression microarray (formerly Affymetrix brand), soon to be supported by PluriTest</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >GeneChip&#8482; Human Genome U133 Plus 2.0 Array</td>
			<td >Thermo-Fisher</td>
			<td >902482</td>
			<td >expression microarray (formerly Affymetrix brand), supported by CellNet, soon to be supported by PluriTest</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PluriTest&#174;</td>
			<td >Coriell Institute</td>
			<td ></td>
			<td >www.pluritest.org, free service for bioinformatic assessment of pluripotency, accepts microarray data - *.idat files from HT-12 v4 platform, soon to support U133, U219 microarray and RNA sequencing data</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CellNet</td>
			<td >Johns Hopkins University</td>
			<td ></td>
			<td >cellnet.hms.harvard.edu, free service for bioinformatic identification of cell type, including plutipotent stem cells, based on U133 microarray data - *.cel files, soon to support RNA sequencing data</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reprogramming primary amniotic fluid and membrane cells to pluripotency in xeno-free conditions

טיפולים מבוססי תאים עצמיים יש צעד אחד קדימה למציאות עם כניסתה של גזע pluripotent המושרה. תאי גזע עובריים, כגון מי שפיר והממברנה בתאי גזע mesenchymal, מייצגים סוג ייחודי של תאים מובחן עם הבטחה הנדסת רקמות, עבור התכנות לתוך iPSC התערבויות רפואת העתיד, תאי גזע, בנקאות. פרוטוקול המובאת כאן מתאר הליך בלתי אופטימליים עבור חילוץ ו culturing ראשי מי השפיר נוזל לבין הממברנה בתאי גזע mesenchymal, הפקת episomal המושרה בתאי גזע pluripotent של תאים אלה בתרבות מוגדרים לחלוטין מבחינה כימית תנאים ניצול אנושי vitronectin רקומביננטי והמדיום E8. אפיון של הקווים החדשים על-ידי החלת שיטות מחמירים – cytometry זרימה, הדמיה קונאפוקלית, טרטומה היווצרות ו פרופיל תעתיק – גם מתואר. הקווים החדש שנוצר אקספרס סמנים של תאי גזע עובריים – Oct3/4A, Nanog, Sox2, טרה-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 – בעת היותו שלילי עבור דה מרקר SSEA-1. הקווים תאי גזע טופס teratomas בעכברים scid-בז ' ב- 6-8 שבועות ומכילים teratomas רקמות נציג של כל שלוש שכבות הנבט. פרופיל תעתיק של הקווים על ידי הגשת נתונים microarray ביטוי הכללית באלגוריתם הערכה pluripotency bioinformatic ייחשב כל קווי pluripotent, לכן, גישה זו היא חלופה אטרקטיבית לניסויים בבעלי חיים. הקווים iPSC החדש יכול לשמש בקלות בניסויים במורד הזרם מעורבים אופטימיזציה של בידול והנדסת רקמות.

הסכמה בכתב מושכלת הושג מחולים לפני הקציר השפיר למטרות בדיקה גנטית, מקדיש aliquot קטן של נוזל למחקר. אין הסכמה נדרש לשימוש של קרום מי השפיר במחקר כפי השליה מייצג פסולת רפואית. נוזל מי השפיר ותאי גזע ממברנה להציג מאפייני mesenchymal טיפוסי, מורפולוגית התאים שלהם הם בצורת כישור, שלב-ב...

Watch this Scientific Journal Video about Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions at JoVE.com

Reprogramming Primary Amniotic Fluid and Membrane Cells to Pluripotency in Xeno-free Conditions

פרוטוקול זה מתאר את התכנות של ראשי מי השפיר נוזל לבין הממברנה בתאי גזע mesenchymal לתוך תאי גזע pluripotent המושרה באמצעות גישה episomal-שילוב בתנאים מוגדרים לחלוטין מבחינה כימית. תהליכי מיצוי, תרבות, התכנות, ואפיון של תאי גזע pluripotent המושרה הנוצרת על ידי שיטות מחמירים מפורטים.

התכנות ראשי מי שפיר ו ממברנות התאים כדי Pluripotency בתנאים קסנו-חופשית

Autologous cell-based therapies got a step closer to reality with the introduction of induced pluripotent stem cells. Fetal stem cells, such as amniotic ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Stable and Efficient Genetic Modification of Cells in the Adult Mouse V-SVZ for the Analysis of Neural Stem Cell Autonomous and Non-autonomous Effects

הנדסה גנטית יציבה ויעילה של תאי V-SVZ העכבר למבוגרים עבור הניתוח של הגזע עצבי נייד אוטונומי והשפעות חד אוטונומיות

Relatively quiescent somatic stem cells support life-long cell renewal in most adult tissues. Neural stem cells in the adult mammalian brain are ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

את ייצור תאי גזע פלוריפוטנטיים מתאי מי שפירים עכבר באמצעות מערכת transposon

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell (MSC) Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

Production and Administration of Therapeutic Mesenchymal Stem/Stromal Cell MSC Spheroids Primed in 3-D Cultures Under Xeno-free Conditions

ייצור ומנהלה של גזע הטיפולי mesenchymal / תא סטרומה (MSC) Spheroids הדרוך בתרבויות 3-D בתנאים קסנו ללא

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) hold great promise in bioengineering and regenerative medicine. MSCs can be isolated from multiple adult tissues via ...

Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation

תכנות מחדש מותנה של תאי אפיתל ושט האדם Pediatric לשימוש בהנדסת רקמות וחקירת מחלות

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing ...

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

Computational Analysis of the Caenorhabditis elegans Germline to Study the Distribution of Nuclei, Proteins, and the Cytoskeleton

ניתוח חישובית של Germline Caenorhabditis elegans ללמוד הפצה של גרעינים, חלבונים ו את שלד התא

The Caenorhabditis elegans (C. elegans) germline is used to study several biologically important processes including stem cell development, apoptosis, and ...

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

אינדוקציה ואימות של הזדקנות ביולוגית הסלולר העיקרי בתאי אדם

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

קסנו נטולת מוגדר ותנאים מזין ללא תרבות לדגמי הדור של האדם נגזר iPSC רשתית תא

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

Intravenous and Intra-amniotic In Utero Transplantation in the Murine Model

תוך ורידי, אינטרה-שפיר בתוך הרחם השתלת במודל מאתר

In utero transplantation (IUT) is a unique and versatile mode of therapy that can be used to introduce stem cells, viral vectors, or any other substances ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

אינדוקציה של אנדותל התמיינות בתאים לב בתנאים בסרום נמוך

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Direct Lineage Reprogramming of Adult Mouse Fibroblast to Erythroid Progenitors

ישיר לשושלת התכנות של העכבר למבוגרים פיברובלסט Erythroid אבות

Erythroid cell commitment and differentiation proceed through activation of a lineage-restricted transcriptional network orchestrated by a group of cell ...