Name: sample preparation for mass spectrometry-based identification of rna-binding regions
Uploaded: 2017-09-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions at JoVE.com

R.B. נתמכה על ידי התוכנית מלומדים סירל קרן סמית וו (C1404), הצעדה של מטבעות קרן (1-שנות כספים-15-344). שקית מאשר תמיכה של NIH מעניקה R01GM110174 ו- NIH R01AI118891, כמו גם משרד ההגנה הענק BC123187P1. סיפורם-טי נתמך על ידי מענק הכשרה-NIH T32GM008216.

1. תרבות והרחבה של mESCs הערה: תאי גזע עובריים בעכבר הם קלים לתרבות, ניתן להרחיב במהירות למספרים גדולים הנדרשים על ידי ניסויים הביוכימי בזכות שלהם פעם אופניים מהירה. MESCs בריא להכפיל את כל ה 12
<ol><li>MESCs הרחב למספר הרצוי על הצלחות gelatinized mESC בינוני (ראו להלן) חממה תרביות רקמה שמרו ב 37...

<ol>
	<li>Bonasio, R., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+transcription+by+long+noncoding+RNAs.">Regulation of transcription by long noncoding RNAs.</a> Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).</li><li>Bonasio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+topics+in+epigenetics:+ants,+brains,+and+noncoding+RNAs.">Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs.</a> Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).</li><li>Rinn, J. L., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+regulation+by+long+noncoding+RNAs.">Genome regulation by long noncoding RNAs.</a> Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).</li><li>Goff, L. A., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+RNA+biology+to+lncRNAs.">Linking RNA biology to lncRNAs.</a> Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).</li><li>Holoch, D., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-mediated+epigenetic+regulation+of+gene+expression.">RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression.</a> Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).</li><li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins.">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation.">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li><li>Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins:+modular+design+for+efficient+function.">RNA-binding proteins: modular design for efficient function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).</li><li>Cabili, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+annotation+of+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+reveals+global+properties+and+specific+subclasses.">Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses.</a> Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins.">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li><li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts.">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li><li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells.">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li><li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs.">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nat Commun. 6, 10127 (2015).</li><li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus.">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nat Commun. 7, 11212 (2016).</li><li>Wilusz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+helix+stabilizes+the+3'+ends+of+long+noncoding+RNAs+that+lack+poly(A)+tails.">A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails.</a> Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).</li><li>Kim, T. K., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+and+Functional+Commonalities+between+Enhancers+and+Promoters.">Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters.</a> Cell. 162 (5), 948-959 (2015).</li><li>Brannan, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SONAR+Discovers+RNA-Binding+Proteins+from+Analysis+of+Large-Scale+Protein-Protein+Interactomes.">SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes.</a> Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).</li><li>Bonasio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+with+RNA+direct+the+Polycomb+group+protein+SCML2+to+chromatin+where+it+represses+target+genes.">Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes.</a> Elife. 3, e02637 (2014).</li><li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+JARID2+and+noncoding+RNAs+regulate+PRC2+recruitment+to+chromatin.">Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin.</a> Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).</li><li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+the+PRC2+component+Ezh2+is+cell+cycle-regulated+and+up-regulates+its+binding+to+ncRNA.">Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA.</a> Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).</li><li>Saldana-Meyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+regulates+the+human+p53+gene+through+direct+interaction+with+its+natural+antisense+transcript,+Wrap53.">CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53.</a> Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Identification+of+RNA-Binding+Domains+in+Human+Cells.">Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells.</a> Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li><li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Mapping+of+RNA-Binding+Regions+in+the+Nuclear+Proteome+of+Embryonic+Stem+Cells.">High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).</li><li>Favre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Thiouridine+photosensitized+RNA-protein+crosslinking+in+mammalian+cells.">4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP.">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li><li>Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thionucleobases+as+intrinsic+photoaffinity+probes+of+nucleic+acid+structure+and+nucleic+acid-protein+interactions.">Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions.</a> J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+U1+snRNP,+a+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle,+reveals+the+mechanism+of+5'+splice+site+recognition.">Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li></ol>

אנו מתארים פרוטוקול נסיוני מפורט לביצוע RBR-ID mESCs ו, עם והתאמות, בתוך כל תא שאינו ניתן לשלב 4SU RNA. סוגי תאים אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה של הגישה כדי להבטיח קליטה מספיק רעש יחס. בנוסף, בעוד הפרוטוקול המתוארים בזאת מתמקדת על הבחינה של גרעיני RBPs, הטכנולוגיה RBR-ID צריך להיות מותאם בקלות תאים הסלו...

מטרת השיטה RBR-ID היא כדי לזהות רנ א מחייב הרומן חלבונים (RBPs) מפת אזורים מחייב RNA שלהם (RBRs) עם פפטיד ברמת רזולוציה כדי להקל על העיצוב של RNA-איגוד מוטציות והחקירה של הביולוגי, הביוכימי פונקציות של אינטראקציות חלבון-RNA.
רנ א היא ייחודית בין מולקולות כמו זה יכול גם לשמש שליח נושא מידע גנטי וגם גם לקפל לתוך מבנים תלת-ממדיים מורכבים עם ביוכימיות פונקציות יותר דומה לאלה של חלבונים1,2. גוף גדל והולך של ראיות מרמז כי noncoding RNAs (ncRNAs) תפקיד חשוב שונים ג'ין מסלולים epigenetic ולניהולו4,3,5 , בדרך כלל, פונקציות רגולטוריות אלו הם מתווכת בהופעה עם חלבונים המקיימים אינטראקציה באופן ספציפי עם RNA נתון. הרלוונטיות, קבוצה של חלבונים שמעצבת זוהה לאחרונה עבור ncRNA זמן ובאינטנסיביות למדה (lncRNA) Xist, מתן ערך תובנה איך lncRNA זו שמתווכת שמושרש איון הנשי תאים6,7 ,8. ראוי לציין, מספר חלבונים אלה אינטראקציה-Xist אינם מכילים כל התחומים הקנוני RNA מחייב9, ולכן הפעילות מחייב RNA שלהם לא יכול להיות החזוי סיליקו בהתבסס על הרצף העיקרי שלהם לבד. בהתחשב בכך כי אלפי lncRNAs באים לידי ביטוי בכל תא נתון10, סביר להניח כי רבים מהם עשוי לפעול באמצעות אינטראקציות עם עדיין מתגלים RNA מחייב חלבונים (RBPs). אסטרטגיית ניסיוני לזהות את אלה RBPs הרומן ולכן להקל במידה רבה על המשימה של לנתח את תפקוד ביולוגי ncRNAs.
ניסיונות קודמים כדי לזהות RBPs מדעית צריכים לסמוך על תיקים עשויים + מבחר RNA מצמידים ספקטרומטר מסה (MS)11,12,13,14,15. למרות ניסויים אלה להוסיף חלבונים רבים רשימת בשם RBPs, על ידי עיצוב שהם יוכלו להבחין רק חלבונים מאוגדים תעתיקים polyadenylated. עם זאת, רוב RNAs קטן lncRNAs רבים אינם polyadenylated. 16 , 17 , חלבונים שמעצבת שלהם סביר הוחמצו בניסויים אלה. מחקר שנערך לאחרונה חלה בלמידה על חלבון interactome מסדי נתונים כדי לזהות חלבונים מטוהרים במשותף עם מספר RBPs ידוע והראה כי השותפים RBP חוזרים ונשנים האלה היו בסבירות גבוהה יותר להחזיק RNA מחייב פעילות18. עם זאת, גישה זו מסתמכת על כרייה מסדי נתונים קיימים של האינטראקציה גדולה, רק לזהות חלבונים אשר יכול להיות שותף מטוהרים בתנאים שאינם denaturing עם RBPs הידוע, ובכך למעט מניתוח לא מסיסים ממברנה-מוטבע, נדיר חלבונים.
הזיהוי של חלבון כמו bona פיד ה RBP לעתים קרובות אינה נותנת באופן אוטומטי מידע על תפקיד ביולוגי ו/או ביוכימי של אינטראקציה חלבון-RNA. כדי להתייחס לנקודה זו, רצוי בדרך כלל לזיהוי חלבון תחום ושל חומצות אמינו משקעי מעורב האינטראקציה כך מוטציות ספציפיות יכול להיות שנועד לבחון את הפונקציה של איגוד ה-RNA בהקשר של כל הרומן RBP19, 20. הקודם המאמצים על ידי הקבוצה שלנו ואחרים השתמשו שברי חלבון רקומביננטי, מוטציות המחיקה כדי לזהות רנ א איגוד אזורים (RBRs)19,20,21,22; עם זאת, גישות כאלה הם עתירי עבודה תואם לניתוחים תפוקה גבוהה. לאחרונה, מחקר תיאר אסטרטגיית ניסיוני למפות RNA מחייב פעילויות אופנה תפוקה גבוהה באמצעות ספקטרומטר מסה23; עם זאת, גישה זו התבססה על מבחר תיקים עשויים זוגי + RNA, וכך נשא עליו אותן מגבלות כמו זיהוי RBP הגישות שתוארו לעיל.
פיתחנו שיטה, הנקרא RNA איגוד אזור זיהוי (RBR-), המנצלת חלבון-RNA photocrosslinking, ספקטרומטר מסה כמותיים כדי לזהות חלבונים ואזורים חלבון אינטראקציה עם ה-RNA בתאים חיים בלי הנחה על מצב פוליאדנילציה RNA, כולל RBPs מאוגדים תיקים עשויים-RNAs24. יתר על כן, שיטה זו מסתמך אך ורק על crosslinking, יש אין דרישות על מסיסות חלבון או נגישות, ולכן הוא מתאים למיפוי RNA מחייב פעילות בתוך ממברנות (למשל מעטפת הגרעין) או תאים מסיסות ( למשל המטריקס גרעינית). אנו מתארים את השלבים ניסיוני כדי לבצע RBR-מזהה הגרעינים של תאי גזע עובריים בעכבר (mESCs) אבל עם שינויים מזעריים פרוטוקול זה צריך להיות מתאים למגוון רחב של סוגי תאים, ובלבד שהם ניתן לשלב ביעילות 4SU מתרבות בינוני.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, qualified, US origin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution 200 mM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PZ0162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution,2% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-thiouridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4509</td>
			<td>50 mM stock in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrolinker XL-1500</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-992-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>78830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CO-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>542334</td>
			<td>Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, sequencing grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk</td>
			<td>3M</td>
			<td>66883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLIGO R3 Reversed - Phase Resin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1133903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8263</td>
			<td>High purity nuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>updated with FB505110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReproSil-Pur 18-AQ</td>
			<td>Dr. Maisch GmbH HPLC</td>
			<td>r13.aq.0003</td>
			<td>Packing material for HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary for nano columns (75 &#181;m)</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068150017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant software</td>
			<td>Max Planck Institute for Biochemistry</td>
			<td></td>
			<td>Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for mass spectrometry-based identification of rna-binding regions

Noncoding RNAs תפקיד חשוב בתהליכים גרעיניים מספר, לרבות ויסות גנים, הכרומטין ו- DNA לתקן. ברוב המקרים, הפעולה של noncoding RNAs מתווך על ידי פונקציות אשר בתורו מוסדרים על ידי אינטראקציות אלה noncoding RNAs עם חלבונים. בקנה אחד עם זה, מספר גדל והולך של החלבונים המעורבים פונקציות גרעיני דווח לאגד RNA, במקרים אחדים האזורים RNA-איגוד של חלבונים אלו שמופו, לעיתים קרובות באמצעות שיטות מפרך, המבוססים על המועמד.
כאן, אנו מדווחים על פרוטוקול מפורט לביצוע זיהוי מוטים תפוקה גבוהה, פרוטאום ברוחב של RNA-מחייב חלבונים ואזורים מחייב RNA שלהם. המתודולוגיה מתבססת על שילוב של uridine photoreactive אנלוגי ב- הסלולר RNA, ואחריו crosslinking בתיווך UV חלבון-RNA, וניתוחים ספקטרומטר מסה לחשוף RNA-תפור פפטידים בתוך פרוטאום. אמנם אנו מתארים את ההליך עבור תאי גזע עובריים בעכבר, הפרוטוקול צריך ניתן להתאים בקלות במגוון של תאים בתרבית.

איור 1 מציג את זרימת העבודה RBR-ID. בשל יעילות נמוכה יחסית crosslinking טכניקה זו, חשוב מאוד לשקול דלדול רמת והן עקביות של האפקט הנצפה (P -ערך) על פני משכפל ביולוגי. איור 2 מציג את חלקת הר געש כתוצאה RBR-ID. פפטידים חפפו RNA זיהוי מוטיב (RRM) תחום מציגים ר?...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions at JoVE.com

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

אנו מתארים פרוטוקול כדי לזהות רנ א מחייב חלבונים ולמפות אזורים מחייב RNA שלהם ב תאים חיים באמצעות photocrosslinking בתיווך UV וספקטרומטר מסה.

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

גישת טנדם נוזלת כרומטוגרפיה-ספקטרומטריית מסה מבוססת עבור ניתוח המטבוליט<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

לכידת וזיהוי של RNA-מחייב חלבונים באמצעות לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome ללכוד אסטרטגיה (CARIC)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

זיהוי של חלבון פונקציונלי אזורים באמצעות חלבון Chimeric בנייה

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

הכנה לדגימת פלזמה לספקטרומטר מסה באמצעות תחנת עבודה אוטומטית

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

בדיקות מבוססות-כרומטוגרפיה של נוזלים מבוססי-המסה של טבולומיקס חיטה

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

הכנה לדוגמא להגשת מתקנים פרוטאומניקס וניתוח נתונים שלאחר מכן

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

גישה פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריית מסות לניתוח R-מתילציה של חלבונים גלובליים ובביטחון גבוה

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...