Name: sample preparation for mass spectrometry-based identification of rna-binding regions
Uploaded: 2017-09-28T14:00:00
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R.B. Searle विद्वानों कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था, W.W. स्मिथ फाउंडेशन (C1404), और सिक्का फाउंडेशन के मार्च (1-वित्तीय-15-344) । बी. ए. जी NIH अनुदान R01GM110174 और NIH R01AI118891, साथ ही DOD अनुदान BC123187P1 से समर्थन स्वीकार करता है. आर.-टी. NIH प्रशिक्षण अनुदान T32GM008216 द्वारा समर्थित किया गया था ।

1. mESCs की संस्कृति और विस्तार नोट: माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं को संस्कृति के लिए आसान कर रहे हैं और जल्दी से अपने तेजी से साइकिल चालन समय के लिए धन्यवाद जैव रासायनिक प्रयोगों द्वारा आवश्यक बड?...

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	<li>Bonasio, R., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+transcription+by+long+noncoding+RNAs.">Regulation of transcription by long noncoding RNAs.</a> Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).</li><li>Bonasio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+topics+in+epigenetics:+ants,+brains,+and+noncoding+RNAs.">Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs.</a> Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).</li><li>Rinn, J. L., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+regulation+by+long+noncoding+RNAs.">Genome regulation by long noncoding RNAs.</a> Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).</li><li>Goff, L. A., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+RNA+biology+to+lncRNAs.">Linking RNA biology to lncRNAs.</a> Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).</li><li>Holoch, D., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-mediated+epigenetic+regulation+of+gene+expression.">RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression.</a> Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).</li><li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins.">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation.">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li><li>Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins:+modular+design+for+efficient+function.">RNA-binding proteins: modular design for efficient function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).</li><li>Cabili, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+annotation+of+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+reveals+global+properties+and+specific+subclasses.">Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses.</a> Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins.">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li><li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts.">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li><li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells.">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li><li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs.">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nat Commun. 6, 10127 (2015).</li><li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus.">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nat Commun. 7, 11212 (2016).</li><li>Wilusz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+helix+stabilizes+the+3'+ends+of+long+noncoding+RNAs+that+lack+poly(A)+tails.">A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails.</a> Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).</li><li>Kim, T. K., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+and+Functional+Commonalities+between+Enhancers+and+Promoters.">Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters.</a> Cell. 162 (5), 948-959 (2015).</li><li>Brannan, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SONAR+Discovers+RNA-Binding+Proteins+from+Analysis+of+Large-Scale+Protein-Protein+Interactomes.">SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes.</a> Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).</li><li>Bonasio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+with+RNA+direct+the+Polycomb+group+protein+SCML2+to+chromatin+where+it+represses+target+genes.">Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes.</a> Elife. 3, e02637 (2014).</li><li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+JARID2+and+noncoding+RNAs+regulate+PRC2+recruitment+to+chromatin.">Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin.</a> Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).</li><li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+the+PRC2+component+Ezh2+is+cell+cycle-regulated+and+up-regulates+its+binding+to+ncRNA.">Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA.</a> Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).</li><li>Saldana-Meyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+regulates+the+human+p53+gene+through+direct+interaction+with+its+natural+antisense+transcript,+Wrap53.">CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53.</a> Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Identification+of+RNA-Binding+Domains+in+Human+Cells.">Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells.</a> Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li><li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Mapping+of+RNA-Binding+Regions+in+the+Nuclear+Proteome+of+Embryonic+Stem+Cells.">High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).</li><li>Favre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Thiouridine+photosensitized+RNA-protein+crosslinking+in+mammalian+cells.">4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP.">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li><li>Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thionucleobases+as+intrinsic+photoaffinity+probes+of+nucleic+acid+structure+and+nucleic+acid-protein+interactions.">Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions.</a> J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+U1+snRNP,+a+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle,+reveals+the+mechanism+of+5'+splice+site+recognition.">Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li></ol>

हम mESCs में RBR आईडी प्रदर्शन करने के लिए एक विस्तृत प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का वर्णन और, उचित संशोधनों के साथ, आरएनए में 4SU को शामिल कर सकते हैं कि किसी भी सेल में. अंय सेल प्रकार के दृष्टिकोण के अनुकूलन की आवश्...

RBR-आईडी पद्धति का उद्देश्य उपन्यास आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन्स (RBPs) की पहचान करना और उनके आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों (RBRs) को, आरएनए-बाइंडिंग म्यूटेंट के डिजाइन की सुविधा के लिए और जैविक और जैव रासायनिक की जांच करने के लिए, पेप्टाइड-स्तर के रिज़ॉल्यूशन के साथ मैप करना है । प्रोटीन-आरएनए बातचीत के कार्य.
आरएनए जैव अणुओं के बीच अद्वितीय है के रूप में यह दोनों एक आनुवंशिक जानकारी ले जाने के दूत के रूप में कार्य कर सकते हैं और भी जटिल तीन में गुना और अधिक प्रोटीन के उन लोगों के लिए सदृश रासायनिक कार्यों के साथ आयामी संरचनाओं1,2. सबूत के एक बढ़ती शरीर पता चलता है कि RNAs (ncRNAs) विभिंन जीन विनियामक और epigenetic रास्ते में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते है3,4,5 और, आमतौर पर, इन विनियामक कार्य संगीत कार्यक्रम में मध्यस्थता कर रहे है एक दिया आरएनए के साथ विशेष रूप से बातचीत कि प्रोटीन के साथ. विशेष प्रासंगिकता के, प्रोटीन बातचीत का एक सेट हाल ही में तीव्रता से अध्ययन लंबे ncRNA (lncRNA) Xist के लिए पहचान की थी, कैसे इस lncRNA मध्यस्थता में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करने के एक्स गुणसूत्र महिला कोशिकाओं में निष्क्रियता6,7 ,8. विशेष रूप से, इन Xist के कई-इंटरैक्ट प्रोटीन किसी भी विहित आरएनए-बाइंडिंग डोमेन9को शामिल नहीं करते हैं, और इसलिए उनकी आरएनए-बाइंडिंग गतिविधि को केवल उनके प्राथमिक अनुक्रम के आधार पर silico में नहीं लगाया जा सकता । यह देखते हुए कि हजारों lncRNAs किसी भी सेल10में व्यक्त कर रहे हैं, यह मान लेना उचित है कि उनमें से कई के साथ बातचीत के माध्यम से कार्य हो सकता है अभी तक आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (RBPs) की खोज की है । एक प्रयोगात्मक रणनीति इन उपंयास RBPs की पहचान करने के लिए इसलिए बहुत ncRNAs के जैविक समारोह विदारक के कार्य की सुविधा होगी ।
पिछले प्रयास RBPs empirically की पहचान करने के लिए polyA + आरएनए सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री (MS)11,12,13,14,15के लिए युग्मित चयन पर भरोसा किया है । हालांकि इन प्रयोगों ख्यात RBPs की सूची में कई प्रोटीन जोड़ा, डिजाइन द्वारा वे केवल polyadenylated टेप करने के लिए बाध्य प्रोटीन का पता लगा सकता है । हालांकि, सबसे छोटे RNAs और कई lncRNAs polyadenylated नहीं हैं । 16 , 17 और उनके बातचीत प्रोटीन की संभावना इन प्रयोगों में याद किया गया होगा । एक ताजा अध्ययन प्रोटीन interactome डेटाबेस के लिए सीखने की मशीन लागू प्रोटीन की पहचान करने के लिए कि सह कई ज्ञात RBPs के साथ शुद्ध और पता चला कि इन आवर्तक RBP भागीदारों और आरएनए-बाध्यकारी गतिविधियों के अधिकारी के पास होने की संभावना थे18. हालांकि, इस दृष्टिकोण मौजूदा बड़े संपर्क डेटाबेस खनन पर निर्भर करता है और केवल प्रोटीन की पहचान कर सकते है कि सह जा सकता है ज्ञात RBPs के साथ गैर denaturing स्थितियों में शुद्ध, इस प्रकार विश्लेषण अघुलनशील से छोड़कर, झिल्ली एंबेडेड, और दुर्लभ प्रोटीन.
एक सदाशई RBP के रूप में एक प्रोटीन की पहचान अक्सर स्वचालित रूप से प्रोटीन-आरएनए बातचीत के जैविक और जैव रासायनिक समारोह के बारे में जानकारी नहीं निकलेगा । इस बिंदु को संबोधित करने के लिए, यह आम तौर पर वांछनीय है प्रोटीन डोमेन और एमिनो एसिड बातचीत में शामिल अवशेषों की पहचान इतना है कि विशिष्ट म्यूटेंट के लिए प्रत्येक उपंयास के संदर्भ में आरएनए बाध्यकारी समारोह का परीक्षण करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है RBP19, 20. हमारे समूह और अंय लोगों द्वारा पिछले प्रयासों संयोजक प्रोटीन टुकड़े और हटाने म्यूटेंट का इस्तेमाल किया है आरएनए बंधन क्षेत्रों की पहचान (RBRs)19,20,21,22; हालांकि, इस तरह के दृष्टिकोण उच्च प्रवाह विश्लेषण के साथ श्रम गहन और असंगत हैं । हाल ही में, एक अध्ययन में एक उच्च प्रवाह वाले फैशन में आरएनए-बाइंडिंग गतिविधियों को जन स्पेक्ट्रोमेट्री23का उपयोग करते हुए मैप करने के लिए एक प्रायोगिक कार्यनीति बताई गई है; हालांकि, इस दृष्टिकोण एक डबल polyA + आरएनए चयन पर भरोसा है, और इस तरह RBP पहचान दृष्टिकोण ऊपर वर्णित के रूप में एक ही सीमाओं किया ।
हमने एक तकनीक विकसित की, जो कि आरएनए बाइंडिंग क्षेत्र पहचान (RBR-ID) है, जो प्रोटीन-आरएनए photocrosslinking और मात्रात्मक द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री का शोषण करता है ताकि प्रोटीन और प्रोटीन क्षेत्रों की पहचान की जा सके जो बिना जीवित कोशिकाओं में आरएनए के साथ इंटरैक्ट कर रहे हैं आरएनए polyadenylation स्थिति पर धारणा, इस प्रकार polyA-RNAs24के लिए बाध्य RBPs सहित । इसके अलावा, इस विधि crosslinking पर विशेष रूप से निर्भर करता है और प्रोटीन घुलनशीलता या पहुंच पर कोई आवश्यकताओं है और इस तरह झिल्ली (जैसे परमाणु लिफाफा) या खराब घुलनशील डिब्बों के भीतर आरएनए-बाध्यकारी गतिविधियों को मैप करने के लिए उपयुक्त है ( परमाणु मैट्रिक्स उदा ) । हम प्रायोगिक चरणों का वर्णन करने के लिए RBR माउस भ्रूण स्टेम सेल (mESCs) के नाभिक के लिए आईडी लेकिन मामूली संशोधनों के साथ इस प्रोटोकॉल सेल प्रकार की एक किस्म के लिए उपयुक्त होना चाहिए, बशर्ते कि वे कुशलतापूर्वक संस्कृति से 4SU को शामिल कर सकते है मध्यम.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, qualified, US origin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution 200 mM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PZ0162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution,2% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-thiouridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4509</td>
			<td>50 mM stock in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrolinker XL-1500</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-992-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>78830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CO-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>542334</td>
			<td>Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, sequencing grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk</td>
			<td>3M</td>
			<td>66883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLIGO R3 Reversed - Phase Resin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1133903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8263</td>
			<td>High purity nuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>updated with FB505110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReproSil-Pur 18-AQ</td>
			<td>Dr. Maisch GmbH HPLC</td>
			<td>r13.aq.0003</td>
			<td>Packing material for HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary for nano columns (75 &#181;m)</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068150017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant software</td>
			<td>Max Planck Institute for Biochemistry</td>
			<td></td>
			<td>Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for mass spectrometry-based identification of rna-binding regions

कोडिंग RNAs जीन अभिव्यक्ति, क्रोमेटिन संरचना, और डीएनए की मरंमत को विनियमित सहित कई परमाणु प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । ज्यादातर मामलों में, RNAs कोडिंग की कार्रवाई प्रोटीन जिसका कार्य बारी में है द्वारा मध्यस्थता है RNAs के साथ इन बातचीत द्वारा विनियमित । इसी के अनुरूप, नाभिकीय कार्यों में शामिल प्रोटीन की बढ़ती संख्या को आरएनए से बाइंड करने की सूचना मिली है और कुछ मामलों में इन प्रोटीनों की आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों को अक्सर श्रमसाध्य, उंमीदवार-आधारित तरीकों के माध्यम से मैप किया गया है ।
यहां, हम आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन्स और उनके आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों का उच्च-प्रवाह, proteome-विस्तारित निष्पक्ष पहचान करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल की रिपोर्ट करते हैं । पद्धति सेलुलर आरएनए में एक photoreactive uridine एनालॉग के शामिल होने पर निर्भर करता है, यूवी मध्यस्थता प्रोटीन-आरएनए crosslinking द्वारा पीछा किया, और crosslinked के भीतर आरएनए-proteome पेप्टाइड्स प्रकट करने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण. यद्यपि हम माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के लिए प्रक्रिया का वर्णन, प्रोटोकॉल आसानी से प्रसंस्कृत कोशिकाओं की एक किस्म के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।

आरेख 1 RBR-ID वर्कफ़्लो को दर्शाया गया है । इस तकनीक के अपेक्षाकृत कम crosslinking दक्षता के कारण, यह बहुत महत्वपूर्ण है पर विचार करने के लिए दोनों कमी स्तर और मनाया प्रभाव की निरंतरता (पी-?...

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Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

हम आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन को पहचानने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं और यूवी मध्यस्थता photocrosslinking और मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके जीवित कोशिकाओं में उनके आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों को मैप करते हैं ।

आरएनए-बाइंडिंग क्षेत्रों की सामूहिक स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित पहचान के लिए नमूना तैयारी

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

की Metabolite विश्लेषण के लिए एक अग्रानुक्रम तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित दृष्टिकोण<em&gt; स्ताफ्य्लोकोच्चुस</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

पर कब्जा और क्लिक करें रसायन-सहायता प्राप्त आरएनए-interactome कैप्चर (CARIC) रणनीति का उपयोग करके आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन की पहचान

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Chimeric प्रोटीन निर्माण के माध्यम से कार्यात्मक प्रोटीन क्षेत्रों की पहचान

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide प्रोफ़ेशनल और पहचान एंजियोटेन्सिन द्वितीय द्वारा सचित्र

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

एक स्वचालित वर्कस्टेशन का उपयोग करके मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए प्लाज्मा नमूना तैयारी

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

जांच इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना तैयारी

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

गेहूं के अनाज का अलक्षित तरल क्रोमेटोग्राफी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित मेटापोलोमिक्स विश्लेषण

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

प्रोटेओमिक्स सुविधा सबमिशन और बाद के डेटा विश्लेषण के लिए टीएमटी नमूना तैयारी

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

वीएमएक्सएम बीमलाइन में माइक्रोक्रिस्टल के लिए एक नमूना तैयारी पाइपलाइन

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

वैश्विक और उच्च आत्मविश्वास प्रोटीन आर-मिथाइलेशन विश्लेषण के लिए एक मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक्स दृष्टिकोण

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...