Name: sample preparation for mass spectrometry-based identification of rna-binding regions
Uploaded: 2017-09-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions at JoVE.com

R.B. ble støttet av den Searle Scholars Program, ww Smith Foundation (C1404) og mars Dimes Foundation (1-FY-15-344). B.A.G anerkjenner støtte fra NIH gir R01GM110174 og NIH R01AI118891, og DOD gi BC123187P1. R.W.-T. ble støttet av NIH trening grant T32GM008216.

1. kultur og utvidelse av mESCs Merk: mus embryonale stamceller er enkle å kultur og raskt kan utvides til den store tall som kreves av biokjemiske eksperimenter takket være rask sykling tiden. Sunn mESCs dobbel hver 12 h.
<ol><li>Utvid mESCs til ønsket nummeret på gelatinized plater i mESC medium (se nedenfor) i en vev kultur inkubator holdt på 37 ° C, 5% CO 2, og &#62; 95% fuktighet. 
	Merk: Nok plater bør være forberedt på 3-5 biologiske gjentak for den + 4SU ut...

<ol>
	<li>Bonasio, R., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+transcription+by+long+noncoding+RNAs.">Regulation of transcription by long noncoding RNAs.</a> Annu Rev Genet. 48, 433-455 (2014).</li><li>Bonasio, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+topics+in+epigenetics:+ants,+brains,+and+noncoding+RNAs.">Emerging topics in epigenetics: ants, brains, and noncoding RNAs.</a> Ann N Y Acad Sci. 1260, 14-23 (2012).</li><li>Rinn, J. L., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+regulation+by+long+noncoding+RNAs.">Genome regulation by long noncoding RNAs.</a> Annu Rev Biochem. 81, 145-166 (2012).</li><li>Goff, L. A., Rinn, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linking+RNA+biology+to+lncRNAs.">Linking RNA biology to lncRNAs.</a> Genome Res. 25 (10), 1456-1465 (2015).</li><li>Holoch, D., Moazed, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-mediated+epigenetic+regulation+of+gene+expression.">RNA-mediated epigenetic regulation of gene expression.</a> Nat Rev Genet. 16 (2), 71-84 (2015).</li><li>Chu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+discovery+of+Xist+RNA+binding+proteins.">Systematic discovery of Xist RNA binding proteins.</a> Cell. 161 (2), 404-416 (2015).</li><li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3.">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521 (7551), 232-236 (2015).</li><li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation.">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349 (6245), (2015).</li><li>Lunde, B. M., Moore, C., Varani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins:+modular+design+for+efficient+function.">RNA-binding proteins: modular design for efficient function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (6), 479-490 (2007).</li><li>Cabili, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+annotation+of+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+reveals+global+properties+and+specific+subclasses.">Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses.</a> Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+RNA+biology+from+an+atlas+of+mammalian+mRNA-binding+proteins.">Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins.</a> Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).</li><li>Baltz, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mRNA-bound+proteome+and+its+global+occupancy+profile+on+protein-coding+transcripts.">The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts.</a> Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).</li><li>Kwon, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+protein+repertoire+of+embryonic+stem+cells.">The RNA-binding protein repertoire of embryonic stem cells.</a> Nat Struct Mol Biol. 20 (9), 1122-1130 (2013).</li><li>Beckmann, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA-binding+proteomes+from+yeast+to+man+harbour+conserved+enigmRBPs.">The RNA-binding proteomes from yeast to man harbour conserved enigmRBPs.</a> Nat Commun. 6, 10127 (2015).</li><li>Conrad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+interactome+capture+of+the+human+cell+nucleus.">Serial interactome capture of the human cell nucleus.</a> Nat Commun. 7, 11212 (2016).</li><li>Wilusz, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+triple+helix+stabilizes+the+3'+ends+of+long+noncoding+RNAs+that+lack+poly(A)+tails.">A triple helix stabilizes the 3' ends of long noncoding RNAs that lack poly(A) tails.</a> Genes Dev. 26 (21), 2392-2407 (2012).</li><li>Kim, T. K., Shiekhattar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architectural+and+Functional+Commonalities+between+Enhancers+and+Promoters.">Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters.</a> Cell. 162 (5), 948-959 (2015).</li><li>Brannan, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SONAR+Discovers+RNA-Binding+Proteins+from+Analysis+of+Large-Scale+Protein-Protein+Interactomes.">SONAR Discovers RNA-Binding Proteins from Analysis of Large-Scale Protein-Protein Interactomes.</a> Mol Cell. 64 (2), 282-293 (2016).</li><li>Bonasio, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+with+RNA+direct+the+Polycomb+group+protein+SCML2+to+chromatin+where+it+represses+target+genes.">Interactions with RNA direct the Polycomb group protein SCML2 to chromatin where it represses target genes.</a> Elife. 3, e02637 (2014).</li><li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+JARID2+and+noncoding+RNAs+regulate+PRC2+recruitment+to+chromatin.">Interactions between JARID2 and noncoding RNAs regulate PRC2 recruitment to chromatin.</a> Mol Cell. 53 (2), 290-300 (2014).</li><li>Kaneko, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+the+PRC2+component+Ezh2+is+cell+cycle-regulated+and+up-regulates+its+binding+to+ncRNA.">Phosphorylation of the PRC2 component Ezh2 is cell cycle-regulated and up-regulates its binding to ncRNA.</a> Genes Dev. 24 (23), 2615-2620 (2010).</li><li>Saldana-Meyer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CTCF+regulates+the+human+p53+gene+through+direct+interaction+with+its+natural+antisense+transcript,+Wrap53.">CTCF regulates the human p53 gene through direct interaction with its natural antisense transcript, Wrap53.</a> Genes Dev. 28 (7), 723-734 (2014).</li><li>Castello, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Identification+of+RNA-Binding+Domains+in+Human+Cells.">Comprehensive Identification of RNA-Binding Domains in Human Cells.</a> Mol Cell. 63 (4), 696-710 (2016).</li><li>He, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Resolution+Mapping+of+RNA-Binding+Regions+in+the+Nuclear+Proteome+of+Embryonic+Stem+Cells.">High-Resolution Mapping of RNA-Binding Regions in the Nuclear Proteome of Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell. 64 (2), 416-430 (2016).</li><li>Favre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=4-Thiouridine+photosensitized+RNA-protein+crosslinking+in+mammalian+cells.">4-Thiouridine photosensitized RNA-protein crosslinking in mammalian cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 141 (2), 847-854 (1986).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome-wide+identification+of+RNA-binding+protein+and+microRNA+target+sites+by+PAR-CLIP.">Transcriptome-wide identification of RNA-binding protein and microRNA target sites by PAR-CLIP.</a> Cell. 141 (1), 129-141 (2010).</li><li>Favre, A., Saintome, C., Fourrey, J. L., Clivio, P., Laugaa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thionucleobases+as+intrinsic+photoaffinity+probes+of+nucleic+acid+structure+and+nucleic+acid-protein+interactions.">Thionucleobases as intrinsic photoaffinity probes of nucleic acid structure and nucleic acid-protein interactions.</a> J Photochem Photobiol B. 42 (2), 109-124 (1998).</li><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding.">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nat Protoc. 11 (12), 2301-2319 (2016).</li><li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skyline:+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments.">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li><li>Kondo, Y., Oubridge, C., van Roon, A. M., Nagai, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+human+U1+snRNP,+a+small+nuclear+ribonucleoprotein+particle,+reveals+the+mechanism+of+5'+splice+site+recognition.">Crystal structure of human U1 snRNP, a small nuclear ribonucleoprotein particle, reveals the mechanism of 5' splice site recognition.</a> Elife. 4, (2015).</li><li>Hafner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAR-CliP--a+method+to+identify+transcriptome-wide+the+binding+sites+of+RNA+binding+proteins.">PAR-CliP--a method to identify transcriptome-wide the binding sites of RNA binding proteins.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li></ol>

Vi beskriver en detaljert eksperimentelle protokoll for å utføre RBR-ID i mESCs, og med riktige modifikasjoner, i en celle som kan innlemme 4SU i RNA. Andre celletyper krever optimalisering av tilnærming å sikre et tilstrekkelig signal til støyforhold. I tillegg, mens protokollen beskrevet heri fokuserer på undersøkelse av kjernefysiske RBPs, bør RBR-ID-teknologi være lett tilpasses forskjellige mobilnettet avdelinger, som stoffer eller bestemte organeller, ved bruk av forskjellige fraksjoneres strategier. Param...

Formålet med metoden RBR-ID er å identifisere romanen RNA-bindende proteiner (RBPs) og kart sine RNA-bindende regioner (RBRs) med peptid nivå oppløsning til rette for design av RNA-bindende mutanter og undersøkelsen av biologiske og biokjemiske funksjoner av protein-RNA interaksjoner.
RNA er unik blant biomolecules som det kan både fungere som en budbringer bærer genetisk informasjon og også kaste i komplekse tredimensjonale strukturer biokjemiske funksjoner mer lik de av proteiner1,2. En voksende mengde bevis antyder at noncoding RNAs (ncRNAs) spille en viktig rolle i ulike genet regulatoriske og epigenetic veier3,4,5 , og vanligvis disse regulatoriske funksjonene er formidlet i konsert med proteiner som samhandler med en gitt RNA. Av spesiell relevans, ble et sett av samspill proteiner nylig oppdaget for intenst studerte lang ncRNA (lncRNA) Xist, gir verdifull innsikt i hvordan dette lncRNA formidler X-chromosome inaktivering i kvinnelige celler6,7 ,8. Spesielt, flere av disse Xist-samspill proteiner inneholder ikke noen kanoniske RNA-bindende domener9, og derfor deres RNA-binding aktivitet kunne ikke forventet i sili basert på deres primære sekvens alene. Tatt i betraktning at tusenvis av lncRNAs er uttrykt i en gitt celle10, er det rimelig å anta at mange av dem kan handle via interaksjon med ennå ikke oppdaget RNA-bindende proteiner (RBPs). En eksperimentell strategi å identifisere disse romanen RBPs derfor stor grad vil lette oppgaven med å dissekere den biologiske funksjonen for ncRNAs.
Tidligere forsøk på å identifisere RBPs empirisk avhengig polyA + RNA utvalg kombinert til massespektrometri (MS),11,,12,,13,,14,,15. Selv om disse eksperimentene lagt mange proteiner i listen over mulige RBPs, av design de finner bare proteiner bundet til polyadenylated utskrifter. Men er de fleste små RNAs og mange lncRNAs ikke polyadenylated. 16 , 17 og deres samspill proteiner ville sikkert ha vært savnet i disse eksperimentene. En fersk studie brukt maskinlæring protein-protein interactome databaser å identifisere proteiner som co renset med flere kjente RBPs og viste at disse tilbakevendende RBP partnere var mer sannsynlig å ha RNA-bindende aktiviteter18. Men denne tilnærmingen avhengig gruvedrift eksisterende store interaksjon databaser og kan kun identifisere proteiner som kan være co renset i ikke-denaturing forhold med kjente RBPs, dermed unntatt fra analyse uløselig membran-embedded og knappe proteiner.
Identifikasjon av et protein som en bona fide RBP ofte gir ikke informasjon om biologisk og/eller biokjemiske funksjonen av protein-RNA samhandlingen automatisk. For å løse dette punktet, er det vanligvis ønskelig å identifisere protein domene og aminosyre rester i samhandlingen slik at bestemte mutanter kan utformes til å teste funksjonen av RNA binding i forbindelse med hver romanen RBP19, 20. forrige innsats av vår gruppe og andre har brukt rekombinante proteinfragmenter og sletting mutanter for å identifisere RNA bindende områder (RBRs)19,20,21,22; men er disse arbeidskrevende og inkompatibel med høy gjennomstrømming analyser. Flere nylig, en studie beskrevet en eksperimentell strategi for å tilordne RNA-bindende aktiviteter i en høy gjennomstrømming mote bruker massespektrometri23; men denne tilnærmingen avhengig av et dobbelt polyA + RNA utvalg, og dermed bar de samme begrensningene som RBP identifikasjon nærmer seg beskrevet ovenfor.
Vi utviklet en teknikk, kalt RNA bindende område-IDen RBR-, som utnytter protein-RNA photocrosslinking og kvantitative massespektrometri å identifisere proteiner og protein regioner samarbeidsstil RNA i levende celler uten å gjøre Forutsetningen om RNA polyadenylation status, dermed inkludert RBPs bundet til polyA-RNAs24. Videre denne metoden avhenger utelukkende på crosslinking og har ingen krav på protein løselighet eller tilgjengelighet og er derfor egnet til å tilordne RNA-bindende aktiviteter innen membraner (f.eks den kjernefysiske konvolutten) eller dårlig løselig rom ( f.eks kjernefysiske matrix). Beskriver vi eksperimentelle trinnene for å utføre RBR-ID for kjerner i mus embryonale stamceller (mESCs), men med mindre modifikasjoner denne protokollen bør være egnet for en rekke celletyper, forutsatt at de kan effektivt innlemme 4SU fra kulturen medium.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10829018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum, qualified, US origin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>26140079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine solution 200 mM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO Leukemia Inhibitory Factor (LIF)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHIR99021</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>4423</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PD0325901</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PZ0162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution,2% in water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-thiouridine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4509</td>
			<td>50 mM stock in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrolinker XL-1500</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>11-992-90</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>78830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGEPAL CO-630</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>542334</td>
			<td>Commercial form of octyl-phenoxy-polyethoxy-ethanol detergent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>I6125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin, sequencing grade</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Empore solid phase extraction disk</td>
			<td>3M</td>
			<td>66883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OLIGO R3 Reversed - Phase Resin</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1133903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E8263</td>
			<td>High purity nuclease</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonic Dismembrator Model 100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>discontinued</td>
			<td>updated with FB505110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade acetonitrile</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>A955-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A11650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium Bicarbonate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A6141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>49199</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ReproSil-Pur 18-AQ</td>
			<td>Dr. Maisch GmbH HPLC</td>
			<td>r13.aq.0003</td>
			<td>Packing material for HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary for nano columns (75 &#181;m)</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068150017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant software</td>
			<td>Max Planck Institute for Biochemistry</td>
			<td></td>
			<td>Can perform chromatographic alignment of multiple MS runs</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation for mass spectrometry-based identification of rna-binding regions

Noncoding RNAs spille viktige roller i flere kjernefysisk prosessene, inkludert regulere genuttrykk, chromatin struktur og DNA-reparasjon. I de fleste tilfeller er av noncoding RNAs formidlet av proteiner med funksjoner som igjen er regulert av disse interaksjoner med noncoding RNAs. I samsvar med dette, et økende antall proteiner involvert i kjernefysiske funksjoner har blitt rapportert å binde RNA og i noen tilfeller regionene RNA-binding av disse proteinene er tilordnet, ofte gjennom arbeidskrevende, kandidat-baserte metoder.
Vi rapporterer her en detaljert protokoll for å utføre en høy gjennomstrømning og proteom hele objektiv identifikasjon av RNA-bindende proteiner og deres RNA-bindende områder. Metodene er avhengig av inkorporering av en photoreactive uridine analog i den cellulære RNA, etterfulgt av UV-mediert protein-RNA crosslinking og massespektrometri analyser å avsløre RNA-krysskoblet peptider i proteom. Selv om vi beskriver fremgangsmåten for mus embryonale stamceller, bør protokollen være lett tilpasses en rekke kulturperler celler.

Figur 1 viser RBR-ID arbeidsflyten. Fordi relativt lav crosslinking effektiviteten av denne teknikken er det svært viktig å vurdere både uttømming nivå og konsistensen av observerte effekten (P -verdi) over biologiske gjentak. Figur 2 viser en vulkan tomt RBR-ID resultatet. Peptider som overlappes RNA anerkjennelse motiv (RRM) domene Vis svært konsekvent uttømming nivå. RRM domener kan brukes som en positiv for R...

Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions at JoVE.com

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Vi beskriver en protokoll for å identifisere RNA-bindende proteiner og tilordne sine RNA-bindende regioner i levende celler ved hjelp av UV-mediert photocrosslinking og massespektrometri.

Eksempel forberedelse til masse massespektrometri-baserte identifikasjon av RNA-bindende områder

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Tandem Liquid Chromatography&#8211;Mass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

A Tandem Liquid ChromatographyÃƒÆ’Ã‚Â¢ÃƒÂ¢Ã¢â‚¬Å¡Ã‚Â¬ÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã…â€œMass Spectrometry-based Approach for Metabolite Analysis of Staphylococcus aureus

Et tandem-væskekromatografi-massespektrometri basert tilnærming for Metabolitt Analyse av<em&gt; Staphylococcus aureus</em

In an effort to thwart bacterial pathogens, hosts often limit the availability of nutrients at the site of infection. This limitation can alter the ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Fangst og identifikasjon av RNA-bindende proteiner ved hjelp av Klikk kjemi-assistert RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identifikasjon av funksjonelle Protein områder gjennom Chimeric Protein konstruksjon

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptide profilering og identifisering illustrert av angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

En plasmaprøve forberedelse for massespektrometri ved hjelp av en automatisert arbeidsstasjon

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til sonde elektrospray ionisering massespektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Untargeted Liquid Chromatography-Mass Spectrometry-Based Metabolomics Analysis of Wheat Grain

Umålrettet flytende kromatografi-massespektrometribasert metabolomikkanalyse av hvetekorn

Understanding the interactions between genes, the environment and management in agricultural practice could allow more accurate prediction and management ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Prøve forberedelse for proteomics facility innsending og påfølgende dataanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

En prøveforberedelsesrørledning for mikrokrystaller ved VMXm-strålelinjen

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

A Mass Spectrometry-Based Proteomics Approach for Global and High-Confidence Protein R-Methylation Analysis

En massespektrometribasert proteomikktilnærming for global og høykonfidensprotein R-metyleringsanalyse

Protein Arginine (R)-methylation is a widespread protein post-translational modification (PTM) involved in the regulation of several cellular pathways, ...