Name: application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices
Uploaded: 2017-07-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices at JoVE.com

Nous sommes reconnaissants pour le soutien financier de la Fondation Whitehall. Nous tenons à remercier Samuel T. Kissinger pour les commentaires précieux.

1. Configuration du système <ol><li> Construire l&#39;unité de contrôle de la pression. <ol><li> Assembler l&#39;unité de commande de pression en fonction de la carte de circuit ( Figure 1 ). Souder les pièces nécessaires sur la carte de circuit imprimé (PCB) fabriquée selon les schémas de circuit électrique ( figure 1b ). Utilisez des résistances standard, des diodes électroluminescentes, des transistors à effet de champ à semi-conducteurs en m...

<ol>
	<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposome+preparation+for+imaging+and+patch-clamp+electrophysiology.">Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).</li><li>Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATLAB-based+automated+patch-clamp+system+for+awake+behaving+mice.">MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+operation+of+the+autopatcher+for+automated+intracellular+neural+recording+in+vivo.">Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo.</a> Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+autopatching+with+automated+pipette+and+cell+detection+in+vitro.">Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro.</a> J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).</li><li>Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-assisted+multi-electrode+patch-clamp+system.">A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system.</a> J Vis Exp. (80), e50630 (2013).</li><li>Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+patch+clamp+recording+performed+on+a+planar+glass+chip.">Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip.</a> Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. (20), (2008).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACQ4:+an+open-source+software+platform+for+data+acquisition+and+analysis+in+neurophysiology+research.">ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research.</a> Front Neuroinform. 8 (3), (2014).</li><li>Kolb, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+patch-clamp+pipettes+for+immediate+reuse.">Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li></ol>

Ici, nous décrivons une méthode pour les enregistrements automatiques de pince à patchs guidés par image in vitro . Les étapes clés de ce processus sont résumées comme suit. Tout d&#39;abord, la vision par ordinateur est utilisée pour reconnaître automatiquement la pointe de la pipette à l&#39;aide d&#39;une série d&#39;images acquises au microscope. Cette information est ensuite utilisée pour calculer la fonction de transformation de coordonnées entre le microscope et les systèmes de coordonnée...

La technique de pincement de patch a été développée pour la première fois par Neher et Sakmann dans les années 1970 pour étudier les canaux ioniques des membranes excitables 1 . Depuis lors, le serrage des patchs a été appliqué à l&#39;étude de nombreux sujets différents au niveau cellulaire, synaptique et de circuit - in vitro et in vivo - dans de nombreux types de cellules différentes, y compris les neurones, les cardiomyocytes, les ovocytes Xenopus et les liposomes artificiels 2 . Ce processus implique l&#39;identification correcte et le ciblage d&#39;une cellule d&#39;intérêt, un contrôle complexe du micromanipulateur pour déplacer la pipette patch à proximité immédiate de la cellule, l&#39;application de pression positive et négative à la pipette au bon moment pour établir un patch rigide rigide, Et une interruption pour établir une configuration de patch de cellule complète. Le serrage des patchs est généralement effectué manuellement et nécessite une formation approfondie pour maîtriser. Même pour un chercheur expérimenté avec le patchClamp, le taux de réussite est relativement faible. Plus récemment, plusieurs tentatives ont été faites pour automatiser les expériences de patch-clamp. Deux stratégies principales ont évolué pour accomplir l&#39;automatisation: augmenter l&#39;équipement de serrage standard pour assurer le contrôle automatique du processus de correctif et la conception de nouveaux équipements et techniques dès le début. La première stratégie est adaptable au matériel existant et peut être utilisée dans une variété d&#39;applications de pince de patch, y compris la pince de patch aveugle in vivo 3 , 4 , 5 , la pince de patch in vitro de tranches de cerveau aiguë, les cultures de coupe organotypiques et les neurones dissociés cultivés 6 . Il permet l&#39;interrogation de circuits locaux complexes en utilisant simultanément plusieurs micromanipulateurs 7 . La méthode de correction planaire est un exemple de la nouvelle stratégie de développement, qui peut atteindre le haut débit simultané pAtch clamp de cellules en suspension à des fins de dépistage de drogue 8 . Cependant, la méthode de correction planaire n&#39;est pas applicable à tous les types de cellules, en particulier les neurones avec des processus longs ou des circuits intacts contenant des connexions étendues. Cela limite son application à la cartographie des circuits complexes du système nerveux, ce qui constitue un atout majeur de la technologie de serre-câbles traditionnelle. Nous avons développé un système qui automatise le processus de pincement de patch manuel in vitro en augmentant le matériel de serre-câbles standard. Notre système, Autopatcher IG, fournit l&#39;étalonnage automatique de la pipette, l&#39;identification des cibles de la cellule fluorescente, le contrôle automatique des mouvements des pipettes, la correction automatique des cellules entières et l&#39;enregistrement des données. Le système peut automatiquement acquérir plusieurs images de tranches de cerveau à différentes profondeurs; Les analyser en utilisant la vision par ordinateur; Et extraire des informations, y compris les coordonnées des cellules marquées par fluorescence. Cette information peut alors êtreUtilisé pour cibler et corriger automatiquement les cellules d&#39;intérêt. Le logiciel est écrit en Python, un langage de programmation open-source gratuit, utilisant plusieurs bibliothèques open-source. Cela garantit son accessibilité à d&#39;autres chercheurs et améliore la reproductibilité et la rigueur des expériences d&#39;électrophysiologie. Le système a une conception modulaire, de sorte qu&#39;un matériel supplémentaire peut facilement être interfacé avec le système actuel démontré ici.

<table width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:115px;">QImaging</td>
			<td style="width:147px;">Rolera Bolt</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="width:231px;height:101px;">Electrophysiology rig</td>
			<td style="width:115px;">Scientifica</td>
			<td style="width:147px;">SliceScope Pro 2000</td>
			<td style="width:256px;">Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is &#8220;Linlab2&#8221;.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Amplifier</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:147px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:256px;">computer-controlled microelectrode amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Digitizer</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:147px;">Axon Digidata 1550</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="width:231px;height:55px;">LED light source</td>
			<td style="width:115px;">Cool LED</td>
			<td style="width:147px;">pE-100</td>
			<td style="width:256px;">488nm wavelength</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td height="98" style="width:231px;height:98px;">Data acquisition board</td>
			<td style="width:115px;">Measurement Computing</td>
			<td style="width:147px;">USB1208-FS</td>
			<td style="width:256px;">Secondary DAQ. 
			See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">Solenoid valves</td>
			<td style="width:115px;">The Lee Co.</td>
			<td style="width:147px;">LHDA0531115H</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Air pump</td>
			<td style="width:115px;">Virtual industry</td>
			<td style="width:147px;">VMP1625MX-12-90-CH</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Air pressure sensor</td>
			<td style="width:115px;">Freescale semiconductor</td>
			<td style="width:147px;">MPXV7025G</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Slice hold-down</td>
			<td style="width:115px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:147px;">64-1415 (SHD-40/2)</td>
			<td style="width:256px;">Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Python</td>
			<td style="width:115px;">Anaconda</td>
			<td style="width:147px;">version 2.7 (32-bit for windows)</td>
			<td style="width:256px;">https://www.continuum.io/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:231px;height:20px;">Screw Terminals</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:115px;height:41px;">Sparkfun</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:147px;height:41px;">PRT - 08084</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:256px;height:41px;">Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">(2-Pin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">N-Channel MOSFET 60V 30A</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM - 10213</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="75">
			<td height="75" style="width:231px;height:75px;">DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-07937</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">LED - Basic Red 5mm</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM-09590</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">LED - Basic Green 5mm</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM-09592</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="width:231px;height:99px;">DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-12748</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="width:231px;height:99px;">Wall Adapter Power Supply - 12VDC 600mA</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">TOL-09442</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="159">
			<td height="159" style="width:231px;height:159px;">Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-11367</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="75">
			<td height="75" style="width:231px;height:75px;">Locking Male x Female X Female Stopcock</td>
			<td style="width:115px;">ARK-PLAS</td>
			<td style="width:147px;">RCX10-GP0</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="width:231px;height:77px;">Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings</td>
			<td style="width:115px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:147px;">14-171-129</td>
			<td style="width:256px;">Outer Diameter: 1/8 in. 
			Inner Diameter: 1/16 in.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">BNC male to BNC male coaxial cable</td>
			<td style="width:115px;">Belkin Components</td>
			<td style="width:147px;">F3K101-06-E</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">560 Ohm Resistor (5% tolerance)</td>
			<td style="width:115px;">Radioshack</td>
			<td style="width:147px;">2711116</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:115px;">General Valve</td>
			<td style="width:147px;">Picospritzer II</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices

La pince à blocs de cellules entières est la méthode standard d&#39;or pour mesurer les propriétés électriques des cellules individuelles. Cependant, la pince de patch in vitro reste une technique difficile et à faible débit en raison de sa complexité et de sa grande dépendance vis-à-vis du fonctionnement et du contrôle de l&#39;utilisateur. Ce manuscrit démontre un système de pincement de patch automatique guidé par image pour des expériences in vitro de patch clamp de cellules entières dans des tranches de cerveau aiguë. Notre système met en œuvre un algorithme basé sur la vision par ordinateur pour détecter les cellules marquées par fluorescence et pour les cibler pour une correction entièrement automatique à l&#39;aide d&#39;un micromanipulateur et d&#39;un contrôle interne de la pression de la pipette. L&#39;ensemble du processus est hautement automatisé, avec des exigences minimales pour l&#39;intervention humaine. Les informations expérimentales en temps réel, y compris la résistance électrique et la pression interne de la pipette, sont documentées électroniquement pour des analyses futures et pour l&#39;optimisation de différents types de cellules. Bien que notre système soit décrit dans le contexte du brai aiguN enregistrements de tranche, il peut également être appliqué à la pince de correction automatisée guidée par l&#39;image des neurones dissociés, des cultures de tranches organotypiques et d&#39;autres types de cellules non neuronales.

<html> Notre système a été testé sur sa capacité à réparer les cellules dans des tranches de cerveau aiguë, des cellules souches pluripotentes induites par la souris (iPSC) différenciées en neurones et des cellules HEK 293 exprimant artificiellement des canaux d&#39;intérêt. La figure 3 montre une expérience utilisant des souris transgéniques Thy1-ChR2-YFP (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) ciblant les neurones pyramidaux de la couche 5 ma...

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Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices (Video) | JoVE

Ce protocole décrit comment mener des expériences automatiques de fixation de patch guidées par image à l&#39;aide d&#39;un système récemment développé pour un équipement d&#39;électrophysiologie standard in vitro .

Application de la pincée de patch automatisée guidée par image pour l&#39;étude des neurones dans les tranches de cerveau

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