Name: application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices
Uploaded: 2017-07-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices at JoVE.com

Мы благодарны за финансовую поддержку Фонда Уайтхолла. Мы хотели бы поблагодарить Самуэля Т. Киссинджера за ценные замечания.

1. Настройка системы <ol><li> Постройте блок управления давлением. <ol><li> Соберите блок управления давлением в соответствии с картой схемы ( рис. 1 ). Припаяйте необходимые детали к печатной плате (PCB), изготовленной в соответствии с схемами электрических схем ( рис. ...

<ol>
	<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposome+preparation+for+imaging+and+patch-clamp+electrophysiology.">Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).</li><li>Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATLAB-based+automated+patch-clamp+system+for+awake+behaving+mice.">MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+operation+of+the+autopatcher+for+automated+intracellular+neural+recording+in+vivo.">Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo.</a> Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+autopatching+with+automated+pipette+and+cell+detection+in+vitro.">Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro.</a> J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).</li><li>Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-assisted+multi-electrode+patch-clamp+system.">A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system.</a> J Vis Exp. (80), e50630 (2013).</li><li>Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+patch+clamp+recording+performed+on+a+planar+glass+chip.">Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip.</a> Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. (20), (2008).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACQ4:+an+open-source+software+platform+for+data+acquisition+and+analysis+in+neurophysiology+research.">ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research.</a> Front Neuroinform. 8 (3), (2014).</li><li>Kolb, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+patch-clamp+pipettes+for+immediate+reuse.">Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li></ol>

Здесь мы описываем метод автоматической записи патч-зажима с использованием изображений in vitro . Основные этапы этого процесса суммируются следующим образом. Во-первых, компьютерное зрение используется для автоматического распознавания наконечника пипетки с помощью серии изобра...

Техника патч-зажима была впервые разработана Нехером и Сакманом в 1970-х годах для изучения ионных каналов возбудимых мембран 1 . С тех пор патч-зажим был применен к изучению многих разных субъектов на клеточном, синаптическом и контурном уровне - как in vitro, так и in vivo - во многих разных типах клеток, включая нейроны, кардиомиоциты, ооциты Xenopus и искусственные липосомы 2 , Этот процесс включает в себя правильную идентификацию и нацеливание ячейки, представляющей интерес, сложное управление микроманипулятора для перемещения пипетки патча в непосредственной близости от клетки, применение положительного и отрицательного давления к пипетке в надлежащее время для создания плотного гигасеального пластыря, И взлом, чтобы установить конфигурацию патчей цельной ячейки. Зажим патча, как правило, проводится вручную и требует обширного обучения. Даже для исследователя, испытывающего патчЗажим, уровень успеха относительно низок. Совсем недавно было предпринято несколько попыток автоматизировать эксперименты по патч-зажимам. Для достижения автоматизации были разработаны две основные стратегии: расширение стандартного оборудования для зажима патчей для обеспечения автоматического контроля процесса исправления и разработки нового оборудования и технологий с нуля. Бывшая стратегия адаптируется к существующим аппаратным средствам и может использоваться в различных приложениях патч-зажима, в том числе in vivo слепой патч-зажим 3 , 4 , 5 , патч-зажим in vitro острых срезов головного мозга, органотипические срезы кусочков и культивированные диссоциированные нейроны 6 , Это позволяет проводить опрос сложных локальных схем с одновременным использованием нескольких микроманипуляторов. 7 . Метод планарных патчей является примером новой стратегии разработки, которая может обеспечить одновременное выполнение высокопроизводительной pФиксация клеток в суспензии для скрининга наркотиков 8 . Однако метод планарных пятен не применим ко всем типам клеток, особенно к нейронам с длинными процессами или целыми цепями, содержащими обширные соединения. Это ограничивает его применение для картирования сложных схем нервной системы, что является ключевым преимуществом традиционной технологии патч-зажима. Мы разработали систему, которая автоматизирует процесс ручного патч-клеща in vitro , дополняя стандартное аппаратное обеспечение патча. Наша система, Autopatcher IG, обеспечивает автоматическую калибровку пипетки, идентификацию целевых ячеек флуоресцентных клеток, автоматическое управление перемещением пипетки, автоматическое клонирование целых ячеек и регистрацию данных. Система может автоматически получать множественные изображения срезов мозга на разных глубинах; Анализировать их с помощью компьютерного зрения; И извлекают информацию, включая координаты флюоресцентно меченных клеток. Затем эта информация может бытьИспользуется для таргетинга и автоматического исправления интересующих ячеек. Программное обеспечение написано на Python - свободном языке программирования с открытым исходным кодом - с использованием нескольких библиотек с открытым исходным кодом. Это обеспечивает его доступность для других исследователей и улучшает воспроизводимость и строгость экспериментов по электрофизиологии. Система имеет модульную конструкцию, так что дополнительное оборудование может быть легко сопряжено с текущей системой, продемонстрированной здесь.

<table width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:115px;">QImaging</td>
			<td style="width:147px;">Rolera Bolt</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="width:231px;height:101px;">Electrophysiology rig</td>
			<td style="width:115px;">Scientifica</td>
			<td style="width:147px;">SliceScope Pro 2000</td>
			<td style="width:256px;">Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is &#8220;Linlab2&#8221;.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Amplifier</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:147px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:256px;">computer-controlled microelectrode amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Digitizer</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:147px;">Axon Digidata 1550</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="width:231px;height:55px;">LED light source</td>
			<td style="width:115px;">Cool LED</td>
			<td style="width:147px;">pE-100</td>
			<td style="width:256px;">488nm wavelength</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td height="98" style="width:231px;height:98px;">Data acquisition board</td>
			<td style="width:115px;">Measurement Computing</td>
			<td style="width:147px;">USB1208-FS</td>
			<td style="width:256px;">Secondary DAQ. 
			See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">Solenoid valves</td>
			<td style="width:115px;">The Lee Co.</td>
			<td style="width:147px;">LHDA0531115H</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Air pump</td>
			<td style="width:115px;">Virtual industry</td>
			<td style="width:147px;">VMP1625MX-12-90-CH</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Air pressure sensor</td>
			<td style="width:115px;">Freescale semiconductor</td>
			<td style="width:147px;">MPXV7025G</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Slice hold-down</td>
			<td style="width:115px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:147px;">64-1415 (SHD-40/2)</td>
			<td style="width:256px;">Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Python</td>
			<td style="width:115px;">Anaconda</td>
			<td style="width:147px;">version 2.7 (32-bit for windows)</td>
			<td style="width:256px;">https://www.continuum.io/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:231px;height:20px;">Screw Terminals</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:115px;height:41px;">Sparkfun</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:147px;height:41px;">PRT - 08084</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:256px;height:41px;">Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">(2-Pin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">N-Channel MOSFET 60V 30A</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM - 10213</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="75">
			<td height="75" style="width:231px;height:75px;">DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-07937</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">LED - Basic Red 5mm</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM-09590</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">LED - Basic Green 5mm</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM-09592</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="width:231px;height:99px;">DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-12748</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="width:231px;height:99px;">Wall Adapter Power Supply - 12VDC 600mA</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">TOL-09442</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="159">
			<td height="159" style="width:231px;height:159px;">Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-11367</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="75">
			<td height="75" style="width:231px;height:75px;">Locking Male x Female X Female Stopcock</td>
			<td style="width:115px;">ARK-PLAS</td>
			<td style="width:147px;">RCX10-GP0</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="width:231px;height:77px;">Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings</td>
			<td style="width:115px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:147px;">14-171-129</td>
			<td style="width:256px;">Outer Diameter: 1/8 in. 
			Inner Diameter: 1/16 in.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">BNC male to BNC male coaxial cable</td>
			<td style="width:115px;">Belkin Components</td>
			<td style="width:147px;">F3K101-06-E</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">560 Ohm Resistor (5% tolerance)</td>
			<td style="width:115px;">Radioshack</td>
			<td style="width:147px;">2711116</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:115px;">General Valve</td>
			<td style="width:147px;">Picospritzer II</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices

Цельноклеточный патч-зажим является золотым стандартным методом для измерения электрических свойств отдельных клеток. Тем не менее, патч-фиксатор in vitro остается сложной и малопроизводительной техникой из-за ее сложности и высокой зависимости от работы и управления пользователем. В этой рукописи демонстрируется автоматическая система патч-фиксации, управляемая ими, для экспериментов с целыми клеточными зажимами in vitro в острых срезах мозга. Наша система реализует алгоритм, основанный на компьютерном зрении, для обнаружения флюоресцентно меченых ячеек и нацеливания на их полностью автоматическое исправление с использованием микроманипулятора и внутреннего контроля давления пипетки. Весь процесс очень автоматизирован, с минимальными требованиями к вмешательству человека. Экспериментальная информация в режиме реального времени, включая электрическое сопротивление и внутреннее давление пипетки, документируется в электронном виде для будущего анализа и оптимизации для разных типов ячеек. Хотя наша система описывается в контексте острого braiN, она также может быть применена к автоматизированному патч-клипу с ориентацией на изображение диссоциированных нейронов, органотипических культур срезов и других типов нейнерональных клеток.

<html> Наша система была проверена на ее способность исправлять клетки в острых срезах головного мозга, мышиные индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs), дифференцированные в нейроны, и клетки HEK 293, искусственно выражающие интересующие каналы. На ?...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices at JoVE.com

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

В этом протоколе описывается, как проводить автоматические эксперименты по патч-зажимам с использованием изображений с использованием системы, недавно разработанной для стандартного электрофизиологического оборудования in vitro .

Применение автоматизированного патч-зажима для изображений для изучения нейронов в средах мозга

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Культивирование и электрофизиологии ячеек на NRCC Патч зажим фишки

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Патч-зажим измерения емкости и Са 2 + Изображений на Одноместный нервных окончаний в сетчатке глаза Ломтики

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Компьютерный многоэлектродной патч-зажим система

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Электрофизиологических и морфологических характеристик нейронов микросхем при остром мозга срезов при использовании парных патч-зажим Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Цельноклеточной патч-зажим Записи в головном мозге Ломтики

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Субклеточные патч-зажим Recordings от Somatodendritic домена нигральных дофамина нейронами

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Препараты и протоколы для всей ячейки патч зажим записи Xenopus laevis тектальный нейронов

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Подготовка острого спинного фрагменты записи поклеточного патч зажим в Substantia Gelatinosa нейронов

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Целевая нейронная травма для неинвазивного отключения головной цепи

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Гипоталамические кисспептиновые нейроны как мишень для записи цельноклеточных пластырей

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...