Name: application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices
Uploaded: 2017-07-31T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices at JoVE.com

Vi är tacksamma för det ekonomiska stödet från Whitehall Foundation. Vi vill tacka Samuel T. Kissinger för de värdefulla kommentarerna.

1. Systeminställning <ol><li> Konstruera tryckregulatorn. <ol><li> Montera tryckregulatorn enligt kretskortet ( Figur 1 ). Löd de nödvändiga delarna på det tryckta kretskortet (PCB) som tillverkats enligt elkretsschemat ( Figur 1b ). Använd standardmotstånd, lysdioder, metalloxidhalvlederfält-Eeffect-transistorer (MOSFET), kondensatorer och kontakter (se materialet ). Löds magnetventiler på PCB. Anslut luftpumpen och lufttrycksgivar...

<ol>
	<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li><li>Collins, M. D., Gordon, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+liposome+preparation+for+imaging+and+patch-clamp+electrophysiology.">Giant liposome preparation for imaging and patch-clamp electrophysiology.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., Franzesi, G. T., Chow, B. Y., Boyden, E. S., Forest, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+whole-cell+patch-clamp+electrophysiology+of+neurons+in+vivo.">Automated whole-cell patch-clamp electrophysiology of neurons in vivo.</a> Nat Methods. 9 (6), 585-587 (2012).</li><li>Desai, N. S., Siegel, J. J., Taylor, W., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATLAB-based+automated+patch-clamp+system+for+awake+behaving+mice.">MATLAB-based automated patch-clamp system for awake behaving mice.</a> J Neurophysiol. 114 (2), 1331-1345 (2015).</li><li>Kodandaramaiah, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+operation+of+the+autopatcher+for+automated+intracellular+neural+recording+in+vivo.">Assembly and operation of the autopatcher for automated intracellular neural recording in vivo.</a> Nat Protocols. 11 (4), 634-654 (2016).</li><li>Wu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+autopatching+with+automated+pipette+and+cell+detection+in+vitro.">Integration of autopatching with automated pipette and cell detection in vitro.</a> J Neurophysiol. 116 (4), 1564-1578 (2016).</li><li>Perin, R., Markram, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+computer-assisted+multi-electrode+patch-clamp+system.">A computer-assisted multi-electrode patch-clamp system.</a> J Vis Exp. (80), e50630 (2013).</li><li>Fertig, N., Blick, R. H., Behrends, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+cell+patch+clamp+recording+performed+on+a+planar+glass+chip.">Whole cell patch clamp recording performed on a planar glass chip.</a> Biophys J. 82 (6), 3056-3062 (2002).</li><li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller.">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. (20), (2008).</li><li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+Patch-clamp+Recordings+in+Brain+Slices.">Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li><li>Campagnola, L., Kratz, M. B., Manis, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACQ4:+an+open-source+software+platform+for+data+acquisition+and+analysis+in+neurophysiology+research.">ACQ4: an open-source software platform for data acquisition and analysis in neurophysiology research.</a> Front Neuroinform. 8 (3), (2014).</li><li>Kolb, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleaning+patch-clamp+pipettes+for+immediate+reuse.">Cleaning patch-clamp pipettes for immediate reuse.</a> Sci Rep. 6, (2016).</li></ol>

Här beskriver vi en metod för automatiska bildstyrda patch clampinspelningar in vitro . Nyckelstegen i denna process sammanfattas enligt följande. Först användes datorvision för att automatiskt känna igen pipettspetsen med hjälp av en serie bilder som förvärvats via ett mikroskop. Denna information används sedan för att beräkna koordinatomvandlingsfunktionen mellan mikroskopet och manipulatorkoordinatsystemen. Datorsyn används för att automatiskt detektera fluorescensmärkta celler och identifier...

Plåstringstekniken utvecklades först av Neher och Sakmann på 1970-talet för att studera joniska kanaler av excitativa membran 1 . Sedan dess har patch clamping applicerats på studien av många olika ämnen på cellulär, synaptisk och kretsnivå - både in vitro och in vivo - i många olika celltyper, inklusive neuroner, kardiomyocyter, Xenopus-oocyter och artificiella liposomer 2 . Denna process innefattar korrekt identifiering och inriktning av en cell av intresse, invecklad mikromanipulatorkontroll för att flytta patchpipetten i närheten av cellen, appliceringen av positivt och negativt tryck till pipetten vid rätt tidpunkt för att etablera en tät gigasplåster, Och ett inbrott för att upprätta en helcells patch-konfiguration. Patchklämning utförs typiskt manuellt och kräver omfattande träning för att behärska. Även för en forskare som har erfarenhet av plåstretKlämma är framgångsgraden relativt låg. Mer nyligen har flera försök gjorts för att automatisera patch-clamp-experiment. Två huvudstrategier har utvecklats för att åstadkomma automatisering: förstärkning av standard patch clamp utrustning för automatisk kontroll av patchprocessen och utformning av ny utrustning och tekniker från grunden. Den tidigare strategin är anpassningsbar till befintlig hårdvara och kan användas i en mängd olika patch-klämapplikationer, inklusive in vivo blindplastklemma 3 , 4 , 5 , in vitro patchklämma av akuta hjärnskivor, organotypa skivkulturer och odlade dissocierade neuroner 6 . Det möjliggör förhör av komplexa lokala kretsar genom att samtidigt använda flera mikromomanipulatorer 7 . Den plana patchmetoden är ett exempel på den nya utvecklingsstrategin, som kan uppnå den höga genomströmningen samtidigt pAtch clamp av celler i suspension för läkemedelsskärmningsändamål 8 . Den plana patchmetoden är dock inte tillämplig på alla celltyper, särskilt neuroner med långa processer eller intakta kretsar som innehåller omfattande anslutningar. Detta begränsar dess tillämpning för att kartlägga den invecklade kretsloppet i nervsystemet, vilket är en viktig fördel med traditionell patch clamp-teknik. Vi har utvecklat ett system som automatiserar den manuella patch clamp processen in vitro genom att förstärka standard patch clamp hårdvara. Vårt system, Autopatcher IG, tillhandahåller automatisk pipettkalibrering, identifiering av fluorescerande celler, automatisk styrning av pipettrörelse, automatisk helcellsplåtering och dataloggning. Systemet kan automatiskt förvärva flera bilder av hjärnskivor på olika djup; Analysera dem med hjälp av datorsyn Och extrahera information, inklusive koordinaterna för fluorescensmärkta celler. Denna information kan då varaAnvänds för att rikta in och automatiskt patchera celler av intresse. Programvaran är skriven i Python-ett fritt språkprogram med öppen källkod, med flera bibliotek med öppen källkod. Detta säkerställer dess tillgänglighet till andra forskare och förbättrar reproducerbarheten och rigoriteten i elektrofysiologiska experiment. Systemet har en modulär design, så att extra maskinvara enkelt kan kopplas till det nuvarande systemet som visas här.

<table width="747">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">CCD Camera</td>
			<td style="width:115px;">QImaging</td>
			<td style="width:147px;">Rolera Bolt</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="width:231px;height:101px;">Electrophysiology rig</td>
			<td style="width:115px;">Scientifica</td>
			<td style="width:147px;">SliceScope Pro 2000</td>
			<td style="width:256px;">Include microscope and manipulators. The manufacturer provided manipulator control software demonstrated in this manuscript is &#8220;Linlab2&#8221;.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Amplifier</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:147px;">MultiClamp 700B</td>
			<td style="width:256px;">computer-controlled microelectrode amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Digitizer</td>
			<td style="width:115px;">Molecular Devices</td>
			<td style="width:147px;">Axon Digidata 1550</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="width:231px;height:55px;">LED light source</td>
			<td style="width:115px;">Cool LED</td>
			<td style="width:147px;">pE-100</td>
			<td style="width:256px;">488nm wavelength</td>
		</tr>
		<tr height="98">
			<td height="98" style="width:231px;height:98px;">Data acquisition board</td>
			<td style="width:115px;">Measurement Computing</td>
			<td style="width:147px;">USB1208-FS</td>
			<td style="width:256px;">Secondary DAQ. 
			See manual at : http://www.mccdaq.com/pdfs/manuals/USB-1208FS.pdf</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">Solenoid valves</td>
			<td style="width:115px;">The Lee Co.</td>
			<td style="width:147px;">LHDA0531115H</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Air pump</td>
			<td style="width:115px;">Virtual industry</td>
			<td style="width:147px;">VMP1625MX-12-90-CH</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Air pressure sensor</td>
			<td style="width:115px;">Freescale semiconductor</td>
			<td style="width:147px;">MPXV7025G</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Slice hold-down</td>
			<td style="width:115px;">Warner instruments</td>
			<td style="width:147px;">64-1415 (SHD-40/2)</td>
			<td style="width:256px;">Slice Anchor Kit, Flat for RC-40 Chamber, 2.0 mm, 19.7 mm</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">Python</td>
			<td style="width:115px;">Anaconda</td>
			<td style="width:147px;">version 2.7 (32-bit for windows)</td>
			<td style="width:256px;">https://www.continuum.io/downloads</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:231px;height:20px;">Screw Terminals</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:115px;height:41px;">Sparkfun</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:147px;height:41px;">PRT - 08084</td>
			<td height="41" rowspan="2" style="width:256px;height:41px;">Screw Terminals 3.5mm Pitch (2-Pin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">(2-Pin)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">N-Channel MOSFET 60V 30A</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM - 10213</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="75">
			<td height="75" style="width:231px;height:75px;">DIP Sockets Solder Tail - 8-Pin</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-07937</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">LED - Basic Red 5mm</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM-09590</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">LED - Basic Green 5mm</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">COM-09592</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="width:231px;height:99px;">DC Barrel Power Jack/Connector (SMD)</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-12748</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="99">
			<td height="99" style="width:231px;height:99px;">Wall Adapter Power Supply - 12VDC 600mA</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">TOL-09442</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="159">
			<td height="159" style="width:231px;height:159px;">Hook-Up Wire - Assortment (Solid Core, 22 AWG)</td>
			<td style="width:115px;">Sparkfun</td>
			<td style="width:147px;">PRT-11367</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="75">
			<td height="75" style="width:231px;height:75px;">Locking Male x Female X Female Stopcock</td>
			<td style="width:115px;">ARK-PLAS</td>
			<td style="width:147px;">RCX10-GP0</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="77">
			<td height="77" style="width:231px;height:77px;">Fisherbrand Tygon S3 E-3603 Flexible Tubings</td>
			<td style="width:115px;">Fisher scientific</td>
			<td style="width:147px;">14-171-129</td>
			<td style="width:256px;">Outer Diameter: 1/8 in. 
			Inner Diameter: 1/16 in.</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">BNC male to BNC male coaxial cable</td>
			<td style="width:115px;">Belkin Components</td>
			<td style="width:147px;">F3K101-06-E</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="width:231px;height:41px;">560 Ohm Resistor (5% tolerance)</td>
			<td style="width:115px;">Radioshack</td>
			<td style="width:147px;">2711116</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:231px;height:21px;">Picospritzer</td>
			<td style="width:115px;">General Valve</td>
			<td style="width:147px;">Picospritzer II</td>
			<td style="width:256px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of automated image-guided patch clamp for the study of neurons in brain slices

Hela cellplåster är standardmetoden för att mäta de enskilda cellernas elektriska egenskaper. In vitro patch clampen är dock en utmanande och låg genomströmningsteknik på grund av dess komplexitet och höga beroende av användarens drift och kontroll. Detta manuskript demonstrerar ett bildstyrt automatiskt patch-klämsystem för in vitro -experiment med helcellsplastklem i akuta hjärnskivor. Vårt system implementerar en datorvisionsbaserad algoritm för att detektera fluorescensmärkta celler och att rikta dem till helautomatisk patching med hjälp av en mikromekanipulator och intern pipetttryckskontroll. Hela processen är mycket automatiserad, med minimala krav på mänsklig intervention. Realtids experimentell information, inklusive elektrisk resistans och internt pipetttryck, dokumenteras elektroniskt för framtida analys och för optimering till olika celltyper. Även om vårt system beskrivs i samband med akut braiN-skivinspelningar kan den också appliceras på den automatiska bildstyrda patchklemmen av dissocierade neuroner, organotypa skivkulturer och andra icke-neuronala celltyper.

<html> Vårt system har testats på förmågan att patchera celler i akuta hjärnskivor, musinducerade Pluripotenta stamceller (iPSCs) differentierade till neuroner och HEK 293-celler som artificiellt uttrycker kanaler av intresse. Figur 3 visar ett experiment med användning av Thy1-ChR2-YFP-transgena möss (B6.Cg-Tg (Thy1-COP4 / EYFP) 18Gfng / J) inriktning på fluorescensmärkta skikt 5 pyramidala neuroner i den visuella cortexen. Målcellen var en av de a...

Watch this Scientific Journal Video about Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices at JoVE.com

Application of Automated Image-guided Patch Clamp for the Study of Neurons in Brain Slices

Detta protokoll beskriver hur man utför automatiska bildstyrda patch-clamp-experiment med ett system som nyligen utvecklats för standard in vitro- elektrofysiologiprodukter.

Tillämpning av automatiserad bildstyrd patchklem för studie av neuroner i hjärnskivor

Whole-cell patch clamp is the gold-standard method to measure the electrical properties of single cells. However, the in vitro patch clamp remains a ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Odling och Elektrofysiologi av celler på NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Capacitance Measurements and Ca2+ Imaging at Single Nerve Terminals in Retinal Slices

Patch-clamp Mått kapacitans och Ca 2 + Imaging vid enstaka nervterminaler i näthinnan Slices

Visual stimuli are detected and conveyed over a wide dynamic range of light intensities and frequency changes by specialized neurons in the vertebrate ...

A Computer-assisted Multi-electrode Patch-clamp System

Ett Datorstödd Multi-elektrod Patch-clamp System

The patch-clamp technique is today the most  well-established method for recording electrical activity from individual  neurons or their subcellular ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektro och morfologisk karakterisering av neurala Microcircuits i akut hjärnan skivor Använda Kopplade Patch-Clamp Inspelningar

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Hel-cell patch-clamp inspelningar i hjärnan skivor

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Subcellulära Patch-clamp inspelningar från somatodendritisk området nigrala dopaminneuroner

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparations and Protocols for Whole Cell Patch Clamp Recording of Xenopus laevis Tectal Neurons

Preparat och protokoll för hela cellen Patch Clamp inspelningen av Xenopus laevis Tectal nervceller

The Xenopus tadpole retinotectal circuit, comprised of the retinal ganglion cells (RGCs) in the eye which form synapses directly onto neurons in the optic ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Beredning av akut ryggmärgen skivor för hela-cell Patch-clamp inspelning i Substantia Gelatinosa nervceller

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Targeted Neuronal Injury for the Non-Invasive Disconnection of Brain Circuitry

Riktade neuronal skada för icke-invasiv frånkoppling av brain circuitry

Surgical intervention can be quite effective for treating certain types of medically intractable neurological diseases. This approach is particularly ...

Hypothalamic Kisspeptin Neurons as a Target for Whole-Cell Patch-Clamp Recordings

Hypotalamiska kisspeptin neuroner som ett mål för helcell patch-clamp inspelningar

Kisspeptins are essential for the maturation of the hypothalamic-pituitary-gonadal (HPG) axis and fertility. Hypothalamic kisspeptin neurons located in ...