Name: mrna interactome capture from plant protoplasts
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

ونحن نعترف مختبر البروفيسور جوريس ويندريككس، الذي قدم الأشعة فوق البنفسجية جهاز يشابك مجهزة مصباح الأشعة فوق البنفسجية التقليدية. ويدعم كغ من قبل صندوق أبحاث جامعة ليوفن ويوافق على الدعم من منحة فو G065713N.

1. أرابيدوبسيس ليف ميسوفيل بروتوبلاست العزلة ملاحظة: بروتوبلاستس نبات أرابيدوبسيس ميسوفيل معزولة أساسا كما وصفها يو وآخرون ، 2007، مع العديد من التعديلات 40 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;directi...

طبقنا بنجاح مرنا التقاط إنتيراكتوم، وضعت للخميرة والخلايا البشرية، لزراعة بروتوبلاستس ميسوفيل ورقة. خلايا ميسوفيل ليف هي النوع الرئيسي من الأنسجة الأرضية في أوراق النبات. الميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أنه يستخدم في الجسم الحي كروسلينكينغ لاكتشاف البروتينا?...

تستخدم اليوكاريوتس مسارات تنظيمية متعددة ل رنا بيوجينيسيس للحفاظ على العمليات البيولوجية الخلوية. من بين الأنواع المعروفة من الحمض النووي الريبي، مرنا متنوعة جدا ويحمل القدرة على الترميز من البروتينات و إسوفورمز 1 .The بتغر مسار يوجه مصير ما قبل مرناس 2 ، 3 . الممارسات التجارية التقييدية من مختلف الأسر الجينات السيطرة على تنظيم الحمض النووي الريبي، وفي بتغر، مربس محددة دليل مرناس من خلال التفاعلات المادية المباشرة، تشكيل مرنبس وظيفية. لذلك، تحديد و مربس وصفها و مرنبس أمر بالغ الأهمية لفهم تنظيم استقلاب مرنا الخلوي 2. على مدى العقود الثلاثة الماضية، ومختلف في الطرق المختبرية - بما في ذلك الحمض النووي الريبي التحولات التحول (ريمزا) المقايسات، والتطور المنهجي للروابط بواسطة المقايسات الإثراء الأسي (سيليكس) استنادا إلى البنى المستمدة من المكتبة، رنا بيند-n-سيق (ربنز)، راديولبلد أو الكميةومضامين ملزمة الحمض النووي الريبي مضان، والبلورات بالأشعة السينية، وطيفي الرنين المغناطيسي النووي 4 ، 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 - تم تطبيقها على نطاق واسع لدراسات الممارسات التجارية التقييدية، وذلك أساسا من خلايا الثدييات. ويمكن البحث عن نتائج هذه الدراسات من الممارسات التجارية التقييدية الثدييات عن طريق قاعدة بيانات البروتين ملزم رنا (رببدب)، الذي يجمع الملاحظات المنشورة 10 . على الرغم من أن هذه النهج في المختبر هي أدوات قوية، فإنها تحدد الحواف الحمض النووي الريبي ملزمة من تجمع الحمض النووي الريبي معين من تسلسل، وبالتالي فهي محدودة في قدرتها على اكتشاف رنا المستهدفة الجديدة. وينطبق الشيء نفسه على الاستراتيجيات الحسابية للتنبؤ بالممارسات التجارية التقييدية على نطاق الجينوم، والتي تقوم على حفظ تسلسل البروتين والبنية 15 . للتغلب على هذا، طريقة تجريبية جديدة هاتم تأسيسها التي تسمح لتحديد زخارف الحمض النووي الريبي أن تتفاعل ربب الفائدة مع، وكذلك لتحديد الموقع الدقيق للالتزام. هذه الطريقة، ودعا &quot;يشابك ومناعي&quot; (كليب)، ويتألف من في الجسم الحي الأشعة فوق البنفسجية يشابها تليها مناعي 11 . وقد أظهرت الدراسات المبكرة أن فوتواكتيفاتيون من الحمض النووي والنيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي يمكن أن تحدث في موجات الأشعة فوق البنفسجية الإثارة أكبر من 245 نانومتر. التفاعل من خلال ثيميدين يبدو أن يفضل (رتبة في الترتيب من انخفاض النشاط الضوئي: دت ≥ دك&gt; رو&gt; رك، دا، دغ) 12 . باستخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع طول موجة من 254 نانومتر (أوف-C)، لوحظ أن الروابط التساهمية بين النيوكليوتيدات الحمض النووي الريبي ومخلفات البروتين يتم إنشاؤها عندما يكون في مجموعة من عدد قليل من أنغسترومز (Å). وبالتالي تسمى هذه الظاهرة &quot;الصفر طول&quot; تشابك رنا و ربب. هذا يمكن أن يتبعها بروسيس التنقية الصارمة<html> ديور ويث ليتل باكغروند 13 ، 14 . وهناك استراتيجية مكملة ل كليب هو الجمع بين في الجسم الحي الأشعة فوق البنفسجية يشابك مع تحديد البروتين لوصف المشهد من الممارسات التجارية التقييدية. وقد تم عزل عدد من هذه البروتينات المرتبطة مرنا الجينوم على نطاق واسع من خلايا الخميرة والخلايا الجذعية الجنينية (إيسس)، وخلايا الخلايا البشرية ( أي HEK293 و هيلا) باستخدام هذا النهج التجريبي الرواية، ودعا &quot;مرنا إنتيراكتوم التقاط&quot; 18 ، 19 ، 20 ، 21 . وتتكون هذه الطريقة من في الجسم الحي الأشعة فوق البنفسجية يشابها تليها تنقية مرنب والبروتيوميات المستندة إلى مس. من خلال تطبيق هذه الاستراتيجية، تم اكتشاف العديد من رواية &quot;مونلايتينغ&quot; ربس التي تحتوي على ربد غير متعارف عليها، وأصبح من الواضح أن المزيد من البروتينات لديها قدرات ملزمة رنا مما كان مفترضا سابقا&quot;&gt; 15 ، 16 ، 17. استخدام هذا الأسلوب يسمح للتطبيقات الجديدة والقدرة على الإجابة على الأسئلة البيولوجية الجديدة عند التحقيق الممارسات التجارية على سبيل المثال، على سبيل المثال، وقد بحثت دراسة حديثة لحفظ بروتيوم مرنا ملزمة (ربب الأساسية بروتيوم) بين الخميرة والخلايا البشرية 22 . وقد وجد بالفعل أن الممارسات التجارية التقييدية النباتية تشارك في النمو والتنمية (على سبيل المثال ، في التنظيم اللاحق للوقت المزهر، والساعة البيولوجية، والتعبير الجيني في الميتوكوندريا والبلاستيك) 24 و 25 و 26 و 27 و 28 و 29 . وعلاوة على ذلك، يعتقد أنها تؤدي وظائف في العمليات الخلوية التي تستجيب للإجهاد اللاأحيائي (على سبيل المثال، البرد، الجفاف، سالينيتي، و أبسيسيك أسيد (أبا)) 31 ، 32 ، 33 ، 34 . هناك أكثر من 200 الجينات ربب المتوقع في الجينوم أرابيدوبسيس ثاليانا ، استنادا إلى رنا الاعتراف عزر (رم) و K التماثل (خ) تسلسل مجال المجال. في الأرز، لوحظ ما يقرب من 250 ، 35 ، 36 . ومن الجدير بالذكر أن العديد من التنبؤات المحتوية على البروتينات تبدو فريدة من نوعها للنباتات (على سبيل المثال، لا أورثولوغ ميتازوان إلى ما يقرب من 50٪ من اربيدوبسيس تنبؤات ربس التي تحتوي على مجال رم) 35 ، مما يشير إلى أن العديد قد تخدم وظائف جديدة. ولا تزال وظائف معظم الممارسات التجارية التقييدية المتوقعة غير معهودة 23 . عزل بروتيوم مرنا المرتبطة من شتلات أرابيدوبسيس أتيولاتد، الأنسجة ورقة، الخلايا الجذرية مثقف، و بروتوبلاستس ورقة ميسوفيل من خلال استخداموقد تم الإبلاغ عن مرنا تفاعلية التقاط مؤخرا 38 ، 39 . وتدل هذه الدراسات على الإمكانية القوية للفهرسة المنهجية للممارسات التجارية التقييدية الوظيفية في النباتات في المستقبل القريب. هنا، نقدم بروتوكول لالتقاط مرنا التفاعلي من بروتوبلاستس النبات ( أي الخلايا دون جدران الخلايا). أرابيدوبسيس ثاليانا ليفس ميسوفيل بروتوبلاستس هي النوع الرئيسي من الخلايا الورقية. بروتوبلاستس معزولة تسمح الوصول الأمثل للضوء الأشعة فوق البنفسجية إلى الخلايا. ويمكن استخدام هذا النوع من الخلايا في المقايسات التي تعبر عن عابرة البروتينات لتوصيف وظيفي 40 ، 41 . وعلاوة على ذلك، تم تطبيق بروتوبلاستينغ على العديد من أنواع الخلايا النباتية الأخرى والأنواع 42 ، 43 ، 44 (على سبيل المثال، بيترسون وآخرون ، 2009؛ بارغمان وبيرنبوم، 2010؛ وهونغ وآخرون ، 2012). &lt;p كلاس = &quot;jove_content&quot;&gt; تتضمن الطريقة ما مجموعه 11 خطوة ( الشكل 1A ). أرابيدوبسيس أوراق بروتوبلاستس ميسوفيل معزولة أولا (الخطوة 1)، وبالتالي الأشعة فوق البنفسجية المشع لتشكيل مرنبس كروسلينكد (الخطوة 2). عندما يتم تحلل بروتوبلاستس تحت ظروف تغيير طبيعة (الخطوة 3)، يتم الافراج عن مرنبس كروسلينكد في تحلل / العازلة ملزمة وسحبت من قبل أوليغو د (T) 25 الخرز (الخطوة 4). بعد عدة جولات من يغسل صارمة، يتم تنقية مرنبس وتحليلها. يتم هضم الببتيدات التشويه والتحريف من مربس بواسطة بروتين K قبل تنقية مرناس كروسلينكد ويتم التحقق من جودة الحمض النووي الريبي بواسطة كرت-ير (الخطوات 5 و 6). بعد العلاج ريبونوكلياز وتركيز البروتين (الخطوة 7)، يتم التحكم في جودة البروتين بواسطة سدز بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (سدز-بادج) والفضة تلطيخ (الخطوة 8). الفرق في أنماط الفرقة البروتين يمكن بسهولة أن تصور بين عينة كروسلينكد (كل) وعينة غير كروسلينكد (غير كل؛عينة السيطرة السلبية من بروتوبلاستس التي لا تتعرض للأشعة فوق البنفسجية التشعيع). ويتحقق تحديد البروتينات من خلال البروتيوميات التي تستند إلى مس. يتم فصل البروتينات من عينة كل من هلام بولي أكريلاميد الكهربائي واحد الأبعاد (1D-بادج) لإزالة التلوث الخلفية المحتملة، هي &quot;في هلام هضمها&quot; إلى الببتيدات قصيرة باستخدام التربسين، وتنقيتها (الخطوة 9). نانو عكس المرحلة اللوني السائل إلى جانب مطياف الكتلة (نانو-لك-مس) يسمح لتحديد كمية من البروتينات نهائية في بروتيوم مرنا ملزمة (الخطوة 10). وأخيرا، يتم وصف المربس المحددة وفهرسة باستخدام التحليل المعلوماتية الحيوية (الخطوة 11).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 M Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1902-500G</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Art. 4935</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M MES (pH 5.7) 
			(4-morpholineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			MMg solution, 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>CELLULASE 
			&#8220;ONOZUKA&#8221; 
			R-10, 10 g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>MACEROZYME R-10, 10g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% (w/v) BSA 
			(Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Chem-Lab NV</td>
			<td>CL00.0317.1000</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td>W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiCl 
			(Lithium Chloride)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>199885000</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2 &#38; 
			Low salt buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% (w/v) LiDS 
			(Lithium Dodecyl Sulphate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4632-25G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M DTT 
			(Dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Wash buffer 2</td>
			<td>307866</td>
			<td>Lysis/binding buffer,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl))</td>
			<td>Acros &#38; 
			Fisher Chemical</td>
			<td>167620010 &#38; 
			H/1200/PB15</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>ED-500G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8.22184.0500</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M NaOH</td>
			<td>VWR PROLABO CHEMICALS</td>
			<td>28244.295</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (pH 7.4) 
			(Phosphate Buffered Saline) 
			containing 
			(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Chemical, MERCK, 
			Sigma-aldrich &#38; SAFC</td>
			<td>S/3160/60, 
			Art. 4935, 
			71640-250G &#38; 
			60230</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (2 &#956;g/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11789020</td>
			<td>Protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td>qRT-PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td>RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>322415</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>537020</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NH4HCO3 
			(Ammonium bicarbonate) 
			&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td>Gel hydration &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH3CN 
			(Acetonitrile)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>34851-100ML</td>
			<td>Gel dehydration &#38; 
			Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA 
			(Iodoacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I4386-10G</td>
			<td>Alkylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA 
			(Trifluoroacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>302031-10X1ML</td>
			<td>Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA 
			(Formic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>06554-5G</td>
			<td>Peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution (6 ng/&#956;L)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>Peltracom</td>
			<td>LP2D</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite 3</td>
			<td>Sibli AS</td>
			<td>05VERMICULIET</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150 x 20 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE2M229104</td>
			<td>Homogenization of final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T585</td>
			<td>Rosette leaf strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-75 &#956;m nylon mesh</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>74010</td>
			<td>Protoplast suspension filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL round bottom tubes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1918-10EA</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer 
			(B&#252;rker hemocytometer)</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td>Protoplast cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinking apparatus 
			(HL-2000 HybriLinker)</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>UVP95003101</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp 
			(Sankyo-Denki G8T5)</td>
			<td>SANKYO 
			DENKI</td>
			<td>SD G8T5</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL glass syringe</td>
			<td>FORTUNA Optima</td>
			<td>Z314560</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow needle (0.9 x 25 mm)</td>
			<td>Becton Dickinson microlance 3</td>
			<td>2021-04</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Model L26</td>
			<td>Labinco BV</td>
			<td>26110912</td>
			<td>Sample incubation by rotating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-d(T)25 magnetic beads 
			(5 mg/mL)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1419S</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units 
			(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>mRBP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td>Silver-staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit 
			(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)</td>
			<td>STRATEC Molecular</td>
			<td>1064100300</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR cycler 
			(StepOne Real-Time PCR cycler)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>cDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-C18 columns 
			(Millipore Zip Tip &#181;-C18 columns)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>720046-960EA</td>
			<td>Peptide purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer 
			(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column 
			(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES800</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 precolumn 
			(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for qRT-PCR assay</td>
			<td colspan="3">Sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBQ10 mRNA 
			(Li et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG 
			Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S rRNA 
			(Durut et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG 
			Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mrna interactome capture from plant protoplasts

البروتينات ملزمة رنا (ربس) تحديد مصائر رنا. وهم يشاركون في جميع مسارات بيوانيسيس الحمض النووي الريبي ويساهم بشكل خاص في تنظيم الجينات بعد النسخي (بتغر) من رنا رسول (مرناس). في السنوات القليلة الماضية، تم عزل عدد من بروتيوم مرنا ملزمة من الخميرة وخلايا الثدييات خطوط بنجاح من خلال استخدام طريقة جديدة تسمى &quot;مرنا التقاط إنتيراكتوم&quot;، والذي يسمح لتحديد البروتينات مرنا ملزمة (مربس) مباشرة من بيئة فسيولوجية. وتتكون هذه الطريقة من في الجسم الحي فوق البنفسجية (أوف) يشابك، سحب إلى أسفل وتنقية المجمعات ريبونوكلوبروتين رسول (مرنبس) من قبل حبات صغيرة (دت)، وتحديد اللاحقة للبروتينات كروسلينكد بواسطة مطياف الكتلة (مس). في الآونة الأخيرة، من خلال تطبيق نفس الطريقة، وقد تم الإبلاغ عن العديد من النباتات مرنا مرتبط بروتيوم في وقت واحد من مختلف مصادر الأنسجة أرابيدوبسيس : شتلات عتيقة،أوراق بروتينات الميزوفيل الورقية، والخلايا الجذرية المستزرعة. هنا، نقدم الأمثل مرنا طريقة التفاعل إنتيراكوموم ل أرابيدوبسيس ثاليانا أوراق بروتوبلاستس ميسوفيل ورقة، وهو نوع الخلية التي تعمل كأداة تنوعا للتجارب التي تشمل المقايسات الخلوية المختلفة. الشروط للحصول على أفضل محصول البروتين تشمل كمية من الأنسجة بدءا ومدة أشعة فوق البنفسجية. في بروتيوم مرنا ملزمة التي تم الحصول عليها من تجربة متوسطة النطاق (10 7 خلايا)، لاحظت ربس أن تم العثور على قدرة ملزم رنا أن تكون ممثلة تمثيلا زائدا، وتم تحديد العديد من الممارسات التجارية التقييدية الجديدة. ويمكن توسيع نطاق التجربة (10 9 خلايا)، ويمكن تطبيق الطريقة المثلى على أنواع الخلايا النباتية الأخرى والأنواع لعزل واسع، الكتالوج، ومقارنة بروتيوم مرنا المرتبطة في النباتات.

لاحظنا هالة مميزة، الذي يحيط بيليه حبة في العينة كل، في غسل الخطوة 4.3 مع غسل العازلة 2 ( الشكل 1B ). على الرغم من أنه لم يتم التحقيق، ويمكن تفسير هذه الظاهرة ربما من خلال تدخل المجمعات مرنب كروسلينكد مع حبة التجميع خلال التقاط المغناطيسي...

Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

هنا، نقدم بروتوكول الالتقاط إنتيراكتوم تطبيقها على أرابيدوبسيس ثاليانا أوراق ميسوفيل ورقة بروتوبلاستس. هذه الطريقة تعتمد بشكل حاسم على في الجسم الحي الأشعة فوق البنفسجية يشابك ويسمح لعزل وتحديد البروتينات مرنا مرتبط النبات من بيئة فسيولوجية.

مرنا إنتيراكتوم التقاط من بروتوبلاستس النبات

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

تصميم تجريبي ليزر تسليخ مجهري RNA تسلسل: دروس من تحليل التنمية الذرة ورقة

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

وهناك طريقة استخراج مجزأة بسيطة للتحليل الشامل من الأيض، والليبيدات، والبروتينات من عينة واحدة

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

والعزلة وقياسات الجهاز التنفسي من الميتوكوندريا من التمويل نبات

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

نبات رذاذ الكتلي: أسلوب تاين المحيطة سريع مباشرة تقييم نواتج الأيض من الأنسجة النباتية

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

استخراج الكافيين والنشاط الأنزيمي والتعبير الجيني ل Synthase الكافيين من تعليق خلية النبات

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

دراسة البروتين استيراد المعايشة باستخدام بروتوبلاستس

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

التقاط وتحديد البروتينات الحمض النووي الريبي ملزم باستخدام نقرة الكيمياء-وساعدت الجيش الملكي النيبالي-إينتيراكتومي التقاط استراتيجية (كاريك)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

استخدام الأنابيب الفلورية الرنين نقل الطاقة لدراسة ديناميات البروتين المجمعات في مقياس زمني ميلي ثانية

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

التسمية خاليه ايمونوبريسيبيتيشن الطيف الطيفي سير العمل لتحديد المواقع النووية علي نطاق واسع التنميط

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...