Name: mrna interactome capture from plant protoplasts
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

我们承认Joris Winderickx教授的实验室，该实验室提供配有常规紫外灯的紫外线交联设备。 KG由KU Leuven研究基金支持，并承认FWO授予G065713N的支持。

拟南芥叶片叶肉原生质体分离注意：如Yoo 等人 ，2007所述， 拟南芥叶肉叶肉原生质体基本上是分离的，有几个修改40 。 <ol><li> 植物生长 <ol><li>在黑暗中将大约200个拟南芥 Col-0生态型种子在4℃下在无菌水中浸泡2天以进行分层。 注意：这个种子数量足够用于一个非CL样品和一个CL样品（见步骤1.3）。 </li><li>用50％?...

我们成功应用开发用于酵母和人类细胞的mRNA相互作用捕获，植物叶肉叶原生质体。叶肉叶细胞是植物叶片中主要类型的地面组织。该方法的主要优点是其使用体内交联从生理环境中发现蛋白质。 在这个协议中，我们主要存在许多的优化实验条件50（ 例如，原生质体的数量以作为起始原料和UV辐射的持续时间使用）。当使用至少10 7个原?...

真核生物使用多个RNA生物发生调控途径来维持细胞生物学过程。在已知类型的RNA，mRNA的是非常多样的并携带的蛋白质的编码能力和它们的同种型1个 .The PTGR通路引导预的mRNA 2,3的命运。来自不同基因家族的RBPs控制RNA的调节，并且在PTGR中，特异性mRBP通过直接物理相互作用指导mRNAs，形成功能性mRNP。因此，识别和表征mRBPs及其mRNP对于了解细胞mRNA代谢的调节至关重要2。在过去三十年中，各种体外方法 - 包括RNA电泳迁移率转移（REMSA）测定法，通过指数富集测定系统进化配体（SELEX），基于文库衍生构建体，RNA Bind-n-Seq（RBNS），放射性标记或定量荧光RNA结合测定法，X-射线晶体学和NMR光谱法4，5，6，7，8，9 -已被广泛应用到限制性商业惯例的研究，主要是从哺乳动物细胞。这些哺乳动物RBP研究的结果可以通过RNA结合蛋白DataBase（RBPDB）进行搜索，收集了已发表的观察10 。 尽管这些体外方法是强大的工具，但它们确定了来自给定的RNA序列库的结合RNA基序，因此在发现新的靶RNA的能力方面受到限制。计算策略预测基因组范围的RBP也是如此，它们基于蛋白质序列和结构15的保守性。为了克服这个，一个新的实验方法哈已被确定，其允许识别感兴趣的RBP相互作用的RNA图案，以及用于确定结合的精确位置。这种称为“交联和免疫沉淀”（CLIP）的方法由体内紫外线交联，然后进行免疫沉淀11 。早期研究表明，DNA和RNA核苷酸的光激活可以发生在大于245nm的激发UV波长处。通过胸苷的反应似乎是有利的（按光反应性降低的顺序排列：dT≥dC&gt; rU&gt; rC，dA，dG） 12 。使用波长为254nm（UV-C）的紫外光，观察到当RNA核苷酸和蛋白质残基之间的共价键仅在几埃（Å）的范围内时产生。因此，这种现象称为RNA和RBP的“零长度”交联。之后可以进行严格的净化程序<html>很少背景13,14杜热。 与CLIP相辅相成的策略是将体内紫外线交联与蛋白质鉴定相结合，以描述RBP的景观。许多这样的全基因组基因结合的蛋白质组已经从酵母细胞，胚胎干细胞（ESC），并使用该新的实验方法的人细胞系（ 即，HEK293和HeLa）中分离，被称为“mRNA的相互作用组捕获” 18 19，20，21。该方法由体内紫外线交联，然后是mRNP纯化和基于MS的蛋白质组学。通过应用这种策略，已经发现了许多含有非典型RBD的新型“月光”RBP，并且已经清楚的是，更多的蛋白质具有比以前所想象的RNA结合能力“&gt; 15，16，17，使用这种方法允许新的应用程序和调查限制性商业惯例时，回答新的生物学问题的能力。例如，最近的一项研究调查了mRNA的结合蛋白质（核心RBP的保护蛋白质组）酵母和人类细胞之间22 。 已经发现植物限制性商业惯例参与生长和发育（ 例如 ，在开花时间的转录后调节，昼夜节律钟，并在线粒体和叶绿体基因表达）的24，25，26，27，28，29 。此外，他们被认为在响应非生物胁迫的细胞过程中进行功能（ 例如，感冒，干旱，salinity，和脱落酸（ABA））31，32，33，34。基于RNA识别基序（RRM）和K同源性（KH）结构域序列基因， 拟南芥基因组中有超过200种预测的RBP基因;在水稻，大约250已注意到35,36。值得注意的是，许多预测限制性商业惯例似乎是独特的植物（ 例如，没有后生动物直向同源物，以含有RRM结构域预测拟南芥限制性商业惯例的约50％）35，这表明许多可以用作新的功能。大多数预测RBP的功能仍然没有表征23 。 通过使用来自拟南芥的幼苗，叶组织，培养的根细胞和叶肉叶原生质体的mRNA结合的蛋白质组分离基因相互作用组捕获近日有报道称38，39。这些研究表明在不久的将来系统地对植物功能性RBP进行编目的潜力很大。在这里，我们提出了从植物原生质体（ 即没有细胞壁的细胞）捕获mRNA相互作用的方案。 拟南芥叶片叶肉原生质体是叶细胞的主要类型。分离的原生质体允许UV光最佳地接近细胞。这种细胞类型可以在瞬时表达功能表征40,41蛋白质测定中。此外，原生质体已被应用到其它几种植物细胞类型和物种42，43，44（ 例如，彼得森等人 ，2009;和巴格曼伯恩鲍姆，2010;和Hong 等人 ，2012）。 &lt;p class =“jove_content”&gt;该方法总共包含11个步骤（ 图1A ）。首先分离拟南芥叶肉叶肉原生质体（步骤1），随后UV照射形成交联的mRNP（步骤2）。当原生质体在变性条件下裂解（步骤3）时，将交联的mRNP释放在裂解/结合缓冲液中，并通过oligo-d（T） 25珠（步骤4）下拉。经过几轮严格洗涤后，将mRNPs纯化并进一步分析。在纯化交联的mRNA之前，通过蛋白酶K消化mRBPs的变性肽，并通过qRT-PCR验证RNA质量（步骤5和6）。经RNA酶处理和蛋白质浓缩（步骤7）后，蛋白质质量由SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和银染法（步骤8）进行控制。在交联样品（CL）和非交联样品（非CL;交联样品）之间，蛋白质带图案的差异可以容易地可视化。来自不经受紫外线照射的原生质体的阴性对照样品）。蛋白质的鉴定通过基于MS的蛋白质组学获得。通过一维聚丙烯酰胺凝胶电泳（1D-PAGE）分离来自CL样品的蛋白质以除去可能的背景污染，并使用胰蛋白酶将其“凝胶内消化”成短肽，并进行纯化（步骤9）。偶联到质谱（纳米LC-MS）的纳米反相液相色谱法允许测定mRNA结合蛋白质组中的确定蛋白质的量（步骤10）。最后，使用生物信息学分析对所鉴定的mRBP进行表征和编目（步骤11）。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 M Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1902-500G</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Art. 4935</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M MES (pH 5.7) 
			(4-morpholineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			MMg solution, 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>CELLULASE 
			&#8220;ONOZUKA&#8221; 
			R-10, 10 g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>MACEROZYME R-10, 10g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% (w/v) BSA 
			(Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Chem-Lab NV</td>
			<td>CL00.0317.1000</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td>W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiCl 
			(Lithium Chloride)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>199885000</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2 &#38; 
			Low salt buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% (w/v) LiDS 
			(Lithium Dodecyl Sulphate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4632-25G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M DTT 
			(Dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Wash buffer 2</td>
			<td>307866</td>
			<td>Lysis/binding buffer,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl))</td>
			<td>Acros &#38; 
			Fisher Chemical</td>
			<td>167620010 &#38; 
			H/1200/PB15</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>ED-500G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8.22184.0500</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M NaOH</td>
			<td>VWR PROLABO CHEMICALS</td>
			<td>28244.295</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (pH 7.4) 
			(Phosphate Buffered Saline) 
			containing 
			(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Chemical, MERCK, 
			Sigma-aldrich &#38; SAFC</td>
			<td>S/3160/60, 
			Art. 4935, 
			71640-250G &#38; 
			60230</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (2 &#956;g/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11789020</td>
			<td>Protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td>qRT-PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td>RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>322415</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>537020</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NH4HCO3 
			(Ammonium bicarbonate) 
			&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td>Gel hydration &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH3CN 
			(Acetonitrile)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>34851-100ML</td>
			<td>Gel dehydration &#38; 
			Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA 
			(Iodoacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I4386-10G</td>
			<td>Alkylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA 
			(Trifluoroacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>302031-10X1ML</td>
			<td>Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA 
			(Formic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>06554-5G</td>
			<td>Peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution (6 ng/&#956;L)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>Peltracom</td>
			<td>LP2D</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite 3</td>
			<td>Sibli AS</td>
			<td>05VERMICULIET</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150 x 20 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE2M229104</td>
			<td>Homogenization of final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T585</td>
			<td>Rosette leaf strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-75 &#956;m nylon mesh</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>74010</td>
			<td>Protoplast suspension filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL round bottom tubes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1918-10EA</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer 
			(B&#252;rker hemocytometer)</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td>Protoplast cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinking apparatus 
			(HL-2000 HybriLinker)</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>UVP95003101</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp 
			(Sankyo-Denki G8T5)</td>
			<td>SANKYO 
			DENKI</td>
			<td>SD G8T5</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL glass syringe</td>
			<td>FORTUNA Optima</td>
			<td>Z314560</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow needle (0.9 x 25 mm)</td>
			<td>Becton Dickinson microlance 3</td>
			<td>2021-04</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Model L26</td>
			<td>Labinco BV</td>
			<td>26110912</td>
			<td>Sample incubation by rotating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-d(T)25 magnetic beads 
			(5 mg/mL)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1419S</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units 
			(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>mRBP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td>Silver-staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit 
			(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)</td>
			<td>STRATEC Molecular</td>
			<td>1064100300</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR cycler 
			(StepOne Real-Time PCR cycler)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>cDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-C18 columns 
			(Millipore Zip Tip &#181;-C18 columns)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>720046-960EA</td>
			<td>Peptide purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer 
			(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column 
			(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES800</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 precolumn 
			(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for qRT-PCR assay</td>
			<td colspan="3">Sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBQ10 mRNA 
			(Li et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG 
			Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S rRNA 
			(Durut et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG 
			Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mrna interactome capture from plant protoplasts

RNA结合蛋白（RBP）决定RNA的命运。他们参与所有的RNA生物发生途径，特别有助于信使RNA（mRNA）的转录后基因调控（PTGR）。在过去几年中，已经通过使用称为“mRNA相互作用捕获”的新方法成功地分离了许多来自酵母和哺乳动物细胞系的mRNA结合蛋白质组，其允许鉴定mRNA结合蛋白（mRBP）直接从生理环境。该方法由体内紫外（UV）交联，寡核苷酸（dT）珠的信使核糖核蛋白复合物（mRNP）的下拉和纯化以及随后通过质谱（MS）鉴定交联蛋白质组成。最近，通过应用相同的方法，已经从不同的拟南芥组织来源同时报道了几种植物mRNA结合的蛋白质组：病毒幼苗，叶组织，叶肉叶原生质体和培养根细胞。在这里，我们提出了拟南芥叶肉叶片原生质体的优化的mRNA相互作用捕获方法，这是一种细胞类型，其用作包括各种细胞测定的实验的通用工具。最佳蛋白质产量的条件包括起始组织的量和UV照射的持续时间。在从中等规模实验（10 7个细胞）获得的mRNA结合蛋白质组中，发现具有RNA结合能力的RBP被超表达，并且鉴定出许多新的RBP。实验可以放大（10 9个细胞），优化的方法可以应用于其他植物细胞类型和物种，以广泛分离，编目和比较植物中mRNA结合的蛋白质组。

在洗涤步骤4.3中用洗涤缓冲液2（ 图1B ）观察到围绕CL样品中的珠粒的特征性晕圈。尽管尚未进行研究，但是这种现象可能通过在磁捕获过程中交联的mRNP复合物与珠聚集的干扰来解释，从而导致形成更扩散的聚集体。这表明oligo-d（T） 25珠捕获是有效的14 。 在非CL对照和CL样品中?...

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mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

在这里，我们提出了应用于拟南芥叶肉叶肉原生质体的相互作用捕获方案。该方法严格依赖于体内紫外线交联，并允许从生理环境中分离和鉴定植物mRNA结合蛋白。

mRNA从植物原生质体捕获

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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从Cryomilled哺乳动物细胞中的蛋白质复合物亲和捕获

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

科研

生物化学

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激光显微切割RNA测序实验设计：从玉米叶片发展的经验分析

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

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一种简单的分级提取方法，用于从单个样品中综合分析代谢物，脂质和蛋白质

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