Name: mrna interactome capture from plant protoplasts
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

Vi anerkender lab af prof. Joris winderickx, som gav UV-tværbindingsapparatet udstyret med den konventionelle UV-lampe. KG støttes af KU Leuvens forskningsfond og anerkender støtte fra FWO-tilskud G065713N.

1. Arabidopsis Leaf Mesophyll Protoplast Isolation BEMÆRK: Arabidopsis leaf mesophyll protoplaster er i det væsentlige isoleret som beskrevet af Yoo et al ., 2007, med flere modifikationer 40 . <ol><li> Vækst af planter <ol><li> Sug ca. 200 Arabidopsis thaliana Col-0 økotype frø i steriliseret vand i 2 dage ved 4 ° C i mørke til stratificering. BEMÆRK: Dette antal frø er nok til en ikke-CL-prøve o...

Vi har med succes anvendt mRNA interactome capture, udviklet til gær og humane celler, til at plante blad mesophyll protoplaster. Blad mesofylceller er den vigtigste type af jordvæv i plantebladene. Den største fordel ved denne metode er, at den bruger in vivo tværbinding for at opdage proteinerne fra et fysiologisk miljø. I denne protokol præsenterer vi primært en række optimerede forsøgsbetingelser ( fx antallet af protoplaster, der skal anvendes som udgangsmater...

Eukaryoter bruger flere RNA biogenese regulatoriske veje til at opretholde cellulære biologiske processer. Blandt de kendte typer af RNA er mRNA meget forskelligartet og bærer kodningskapaciteten af ​​proteiner og deres isoformer 1. PTGR-vejen styrer skæbnen for præ-mRNA&#39;er 2 , 3 . RBP&#39;er fra forskellige genfamilier styrer reguleringen af ​​RNA, og i PTGR styrer bestemte mRBP&#39;er mRNA&#39;er gennem direkte fysiske interaktioner, der danner funktionelle mRNP&#39;er. Derfor er identifikation og karakterisering af mRBP&#39;er og deres mRNP&#39;er afgørende for forståelsen af ​​reguleringen af ​​cellulær mRNA-metabolisme 2. I de sidste tre årtier har forskellige in vitro- metoder - herunder RNA-elektroforetisk mobilitetsforskydning (REMSA) assays, systematisk udvikling af ligander ved eksponentielle berigelsesanalyser (SELEX) baseret på biblioteksafledte konstruktioner, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radioaktivt mærket eller kvantitativtFluorescens-RNA-bindingsassays, røntgenkrystallografi og NMR-spektroskopi 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 - er blevet anvendt bredt til studier af RBP&#39;er, hovedsageligt fra pattedyrceller. Resultaterne af disse undersøgelser af pattedyrs-RBP&#39;er kan søges via den RNA-bindende Protein DataBase (RBPDB), som samler de offentliggjorte observationer 10 . Selv om disse in vitro- metoder er kraftige værktøjer, bestemmer de de bundne RNA-motiver fra en given RNA-pool af sekvenser og er derfor begrænsede i deres evne til at opdage nye mål-RNA&#39;er. Det samme gælder for beregningsstrategier for at forudse genomsamlede RBP&#39;er, som er baseret på bevaring af proteinsekvens og struktur 15 . For at overvinde dette har en ny forsøgsmetode haS er etableret, der muliggør identifikation af RNA-motiverne, som en RBP af interesse interagerer med, såvel som til bestemmelse af den præcise placering af bindingen. Denne metode, der kaldes &quot;tværbinding og immunpræcipitation&quot; (CLIP), består af in vivo UV-tværbinding efterfulgt af immunpræcipitation 11 . Tidlige undersøgelser har vist, at fotoaktivering af DNA- og RNA-nukleotider kan forekomme ved excitation UV-bølgelængder større end 245 nm. Reaktionen gennem thymidin synes at være begunstiget (rang i rækkefølge af nedsat fotoreaktivitet: dT&gt; dC&gt; rU&gt; rC, dA, dG) 12 . Ved anvendelse af UV-lys med en bølgelængde på 254 nm (UV-C) blev det observeret, at kovalente bindinger mellem RNA-nukleotider og proteinrester er skabt, når der kun er nogle få Ångstrømninger (Å). Fænomenet kaldes derfor &quot;nullængde&quot; tværbinding af RNA og RBP. Dette kan efterfølges af en streng rensningsprocedure<html> Dyr med lille baggrund 13 , 14 . En strategi komplementær til CLIP er at kombinere in vivo UV-tværbinding med proteinidentifikation for at beskrive RBPs landskab. Et antal sådanne genomfattede mRNA-bundne proteomer er blevet isoleret fra gærceller, embryonale stamceller (ESC&#39;er) og humane cellelinier ( dvs. HEK293 og HeLa) under anvendelse af denne nye eksperimentelle tilgang, kaldet &quot;mRNA interactome capture&quot; 18 , 19 , 20 , 21 . Fremgangsmåden består af in vivo UV-tværbinding efterfulgt af mRNP-oprensning og MS-baseret proteomik. Ved at anvende denne strategi er mange nye &quot;måneskinnende&quot; RBP&#39;er indeholdende ikke-canoniske RBD&#39;er blevet opdaget, og det er blevet klart, at flere proteiner har RNA-bindende kapacitet end tidligere antaget&quot;&gt; 15 , 16 , 17. Anvendelsen af ​​denne metode giver mulighed for nye applikationer og evnen til at besvare nye biologiske spørgsmål ved undersøgelse af RBP&#39;er. For eksempel har en nylig undersøgelse undersøgt bevarelsen af ​​det mRNA-bundne proteom (kernen RBP Proteom) mellem gær og humane celler 22 . Plant RBP&#39;er har allerede vist sig at være involveret i vækst og udvikling ( f.eks . I posttranskriptionel regulering af blomstringstid, cirkadianuret og genekspression i mitokondrier og chloroplaster) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . Desuden antages de at udføre funktioner i de cellulære processer, der reagerer på abiotiske påvirkninger ( f.eks. Kold, tørke, saLinitet og abscisinsyre (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . Der er mere end 200 forudsagte RBP-gener i Arabidopsis thaliana- genomet, baseret på RNA-genkendelsesmotiv (RRM) og K-homologi (KH) domænesekvensmotiv; I ris er cirka 250 blevet noteret 35 , 36 . Det er bemærkelsesværdigt, at mange forudsagte RBP&#39;er synes at være unikke for planter ( fx ingen metazoan orthologs til ca. 50% af forudsagte Arabidopsis RBP&#39;er indeholdende et RRM-domæne) 35 , hvilket tyder på, at mange kan tjene nye funktioner. Funktionerne af de fleste forudsagte RBP&#39;er forbliver ukarakteriserede 23 . Isoleringen af ​​mRNA-bundne proteomer fra Arabidopsis- ætiolerede frøplanter, bladvæv, dyrkede rodceller og bladmemofylprotoplaster ved anvendelse afMRNA interaktionsoptagelse er for nylig blevet rapporteret 38 , 39 . Disse undersøgelser viser det stærke potentiale for systematisk katalogisering af funktionelle RBP&#39;er i planter i nær fremtid. Her præsenterer vi en protokol for mRNA interactome capture fra planteprotoplaster ( dvs. celler uden cellevægge). Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplaster er den vigtigste type af bladcelle. De isolerede protoplaster tillader optimal adgang til UV-lys til cellerne. Denne celletype kan anvendes i assays, som transientt udtrykker proteiner til funktionel karakterisering 40 , 41 . Desuden er protoplaster blevet anvendt til adskillige andre plantecelletyper og arter 42 , 43 , 44 ( fx Petersson et al ., 2009; Bargmann og Birnbaum, 2010; og Hong et al ., 2012). &lt;P class = &quot;jove_content&quot;&gt; Metoden omfatter i alt 11 trin ( Figur 1A ). Arabidopsis leaf mesophyll protoplaster isoleres først (trin 1) og efterfølgende UV-bestråles til dannelse af tværbundne mRNP&#39;er (trin 2). Når protoplaster lyseres under denatureringsbetingelser (trin 3), frigives de tværbundne mRNP&#39;er i lysis / bindingsbuffer og trækkes ned ved oligo-d (T) 25 perler (trin 4). Efter flere runder af strenge vasker renses mRNP&#39;erne og analyseres yderligere. De denaturerede peptider af mRBP&#39;er fordøjes af proteinase K, før de tværbundne mRNA&#39;er renses, og RNA-kvaliteten verificeres ved hjælp af qRT-PCR (trin 5 og 6). Efter RNase-behandling og proteinkoncentration (trin 7) styres proteinkvaliteten ved SDS-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og sølvfarvning (trin 8). Forskellen i proteinbåndsmønstre kan let visualiseres mellem en tværbundet prøve (CL) og en ikke-tværbundet prøve (ikke-CL;Den negative kontrolprøve fra protoplaster, der ikke udsættes for UV-bestråling). Identifikationen af ​​proteiner opnås gennem MS-baseret proteomik. Proteinerne fra CL-prøven adskilles ved endimensionel polyacrylamidgelelektroforese (1D-PAGE) for at fjerne mulig baggrundsforurening, &quot;in-gel fordøjes&quot; til korte peptider under anvendelse af trypsin og renses (trin 9). Nano omvendt fase væskekromatografi koblet til massespektrometri (nano-LC-MS) tillader bestemmelse af mængden af ​​endelige proteiner i det mRNA-bundne proteom (trin 10). Endelig karakteriseres og identificeres de identificerede mRBP&#39;er ved anvendelse af bioinformatisk analyse (trin 11).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 M Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1902-500G</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Art. 4935</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M MES (pH 5.7) 
			(4-morpholineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			MMg solution, 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>CELLULASE 
			&#8220;ONOZUKA&#8221; 
			R-10, 10 g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>MACEROZYME R-10, 10g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% (w/v) BSA 
			(Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Chem-Lab NV</td>
			<td>CL00.0317.1000</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td>W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiCl 
			(Lithium Chloride)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>199885000</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2 &#38; 
			Low salt buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% (w/v) LiDS 
			(Lithium Dodecyl Sulphate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4632-25G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M DTT 
			(Dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Wash buffer 2</td>
			<td>307866</td>
			<td>Lysis/binding buffer,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl))</td>
			<td>Acros &#38; 
			Fisher Chemical</td>
			<td>167620010 &#38; 
			H/1200/PB15</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>ED-500G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8.22184.0500</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M NaOH</td>
			<td>VWR PROLABO CHEMICALS</td>
			<td>28244.295</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (pH 7.4) 
			(Phosphate Buffered Saline) 
			containing 
			(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Chemical, MERCK, 
			Sigma-aldrich &#38; SAFC</td>
			<td>S/3160/60, 
			Art. 4935, 
			71640-250G &#38; 
			60230</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (2 &#956;g/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11789020</td>
			<td>Protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td>qRT-PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td>RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>322415</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>537020</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NH4HCO3 
			(Ammonium bicarbonate) 
			&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td>Gel hydration &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH3CN 
			(Acetonitrile)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>34851-100ML</td>
			<td>Gel dehydration &#38; 
			Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA 
			(Iodoacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I4386-10G</td>
			<td>Alkylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA 
			(Trifluoroacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>302031-10X1ML</td>
			<td>Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA 
			(Formic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>06554-5G</td>
			<td>Peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution (6 ng/&#956;L)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>Peltracom</td>
			<td>LP2D</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite 3</td>
			<td>Sibli AS</td>
			<td>05VERMICULIET</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150 x 20 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE2M229104</td>
			<td>Homogenization of final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T585</td>
			<td>Rosette leaf strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-75 &#956;m nylon mesh</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>74010</td>
			<td>Protoplast suspension filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL round bottom tubes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1918-10EA</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer 
			(B&#252;rker hemocytometer)</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td>Protoplast cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinking apparatus 
			(HL-2000 HybriLinker)</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>UVP95003101</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp 
			(Sankyo-Denki G8T5)</td>
			<td>SANKYO 
			DENKI</td>
			<td>SD G8T5</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL glass syringe</td>
			<td>FORTUNA Optima</td>
			<td>Z314560</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow needle (0.9 x 25 mm)</td>
			<td>Becton Dickinson microlance 3</td>
			<td>2021-04</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Model L26</td>
			<td>Labinco BV</td>
			<td>26110912</td>
			<td>Sample incubation by rotating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-d(T)25 magnetic beads 
			(5 mg/mL)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1419S</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units 
			(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>mRBP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td>Silver-staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit 
			(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)</td>
			<td>STRATEC Molecular</td>
			<td>1064100300</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR cycler 
			(StepOne Real-Time PCR cycler)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>cDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-C18 columns 
			(Millipore Zip Tip &#181;-C18 columns)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>720046-960EA</td>
			<td>Peptide purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer 
			(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column 
			(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES800</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 precolumn 
			(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for qRT-PCR assay</td>
			<td colspan="3">Sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBQ10 mRNA 
			(Li et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG 
			Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S rRNA 
			(Durut et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG 
			Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mrna interactome capture from plant protoplasts

RNA-bindende proteiner (RBP&#39;er) bestemmer skæbne for RNA&#39;er. De deltager i alle RNA biogeneseveje og bidrager især til post-transkriptionel genregulering (PTGR) af messenger-RNA&#39;er (mRNA&#39;er). I de sidste par år er en række mRNA-bundne proteomer fra gær- og pattedyrcellelinier isoleret isoleret ved anvendelse af en ny metode kaldet &quot;mRNA interactome capture&quot;, hvilket muliggør identifikation af mRNA-bindende proteiner (mRBP&#39;er) Direkte fra et fysiologisk miljø. Fremgangsmåden består af in vivo ultraviolet (UV) tværbinding, nedtrængning og oprensning af messenger ribonucleoproteinkomplekser (mRNP&#39;er) ved oligo (dT) perler og den efterfølgende identifikation af de tværbundne proteiner ved massespektrometri (MS). For nylig er der ved hjælp af samme metode blevet rapporteret flere plante mRNA-bundne proteomer samtidigt fra forskellige Arabidopsis vævskilder: ætiolerede frøplanter, bladvæv,Blad mesophyll protoplaster og dyrkede rodceller. Her præsenterer vi den optimerede mRNA interaktionsoptagelsesmetode til Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplaster, en celletype, der tjener som et alsidigt værktøj til forsøg, der omfatter forskellige cellulære analyser. Betingelserne for optimalt proteinudbytte indbefatter mængden af ​​startvæv og varigheden af ​​UV-bestråling. I det mRNA-bundne proteom opnået ud fra et middelforsøgsforsøg (10 7 celler) viste RBP&#39;er at have RNA-bindingsevne sig at være overrepræsenteret, og mange nye RBP&#39;er blev identificeret. Forsøget kan opskaleres (10 9 celler), og den optimerede metode kan anvendes til andre plantecelletyper og arter til at isolere, katalogisere og sammenligne mRNA-bundne proteomer i planter.

Vi observerede en karakteristisk halo, der omgiver perlepellet i CL-prøven, i vaske trin 4.3 med vaskebuffer 2 ( Figur 1B ). Selvom det ikke er blevet undersøgt, kan dette fænomen sandsynligvis forklares ved interferensen af ​​tværbundne mRNP-komplekser med perleaggregering under magnetfangst, hvilket forårsager et mere diffust aggregat at danne. Det indikerer, at oligo-d (T) 25- perlefangsten var effektiv 14 . </p...

Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Her præsenterer vi en interaktiv fangstprotokol anvendt på Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplaster. Denne metode afhænger kritisk af in vivo UV-tværbinding og muliggør isolering og identifikation af plante-mRNA-bindende proteiner fra et fysiologisk miljø.

MRNA Interactome Capture fra Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrsceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Eksperimentel Design for Laser mikrodissektions RNA-Seq: Erfaringer fra en analyse af Maize Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraktioneret ekstraktionsmetode til den omfattende analyse af metabolitter, lipider og proteiner fra en enkelt prøve

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation og respiratoriske målinger af mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Leaf Spray massespektrometri: En hurtig omgivende ionisering teknik til direkte vurdere metabolitter fra plantevæv

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein udvinding, enzymatisk aktivitet og genekspression af koffein syntase fra plante celle suspensioner

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

At studere Protein Import til grønkorn ved hjælp af Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Opsamling og identifikation af RNA-bindende proteiner ved hjælp af klik kemi-assisteret RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-fri Immunoprecipitation massespektrometri workflow for storstilet nuklear Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...