Name: mrna interactome capture from plant protoplasts
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

Wij erkennen het laboratorium van prof. Joris Winderickx, die de UV-verknopingsapparaat heeft voorzien van de conventionele UV-lamp. KG wordt ondersteund door het onderzoeksfonds KU Leuven en erkent steun van FWO-subsidie ​​G065713N.

1. Arabidopsis Blad Mesophyll Protoplast Isolatie OPMERKING: Arabidopsis blad mesofyl protoplasten zijn in hoofdzaak geïsoleerd, zoals beschreven door Yoo et al ., 2007, met verscheidene wijzigingen 40 . <ol><li> Groei van planten <ol><li> Week ongeveer 200 Arabidopsis thaliana Col-0 ecotype zaden in gesteriliseerd water gedurende 2 dagen bij 4 ° C in het donker voor stratificatie. OPMERKING: Dit aantal z...

We hebben succesvol mRNA interactome capture toegepast, ontwikkeld voor gist en menselijke cellen, om blad mesofyl protoplasten te planten. Bladmacofylcellen zijn de belangrijkste aardweefsel in plantenblaadjes. Het grote voordeel van deze methode is dat het in vivo verknoping gebruikt om de eiwitten uit een fysiologische omgeving te ontdekken. In dit protocol presenteren we voornamelijk een aantal geoptimaliseerde experimentele condities ( bijvoorbeeld het aantal protoplas...

Eukaryoten gebruiken meerdere RNA biogenese regulerende pathways om cellulaire biologische processen te behouden. Onder de bekende typen RNA is mRNA zeer divers en draagt ​​de coderingscapaciteit van eiwitten en hun isoformes 1. De PTGR-weg leidt de fatsussen van pre-mRNAs 2 , 3 . RBP&#39;s uit verschillende genfamilies regelen de regulering van RNA, en in PTGR leiden specifieke mRBPs mRNAs door directe fysieke interacties, die functionele mRNP&#39;s vormen. Daarom is het identificeren en karakteriseren van mRBP&#39;s en hun mRNP&#39;s van cruciaal belang om de regulering van cellulaire mRNA-metabolisme 2 te begrijpen. In de afgelopen drie decennia zijn diverse in vitro methoden - waaronder RNA-elektroforetische mobiliteitsverschuiving (REMSA) -assays, systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijkingstests (SELEX) gebaseerd op bibliotheek-afgeleide constructen, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radioactief gemerk of kwantitatiefFluorescentie-RNA-bindingsbepalingen, röntgenkristallografie en NMR-spectroscopie 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 - zijn op grote schaal toegepast op studies van RBP&#39;s, voornamelijk uit zoogdiercellen. De resultaten van deze studies van zoogdieren RBP&#39;s kunnen worden gezocht via de RNA-bindende Protein DataBase (RBPDB), die de gepubliceerde waarnemingen 10 verzamelt . Hoewel deze in vitro benaderingen krachtige tools zijn, bepalen ze de gebonden RNA-motieven uit een bepaald RNA-pool van sequenties en zijn daarom beperkt in hun vermogen om nieuwe doel RNA&#39;s te ontdekken. Hetzelfde geldt voor berekeningsstrategieën om genoom-brede RBP&#39;s te voorspellen, die zijn gebaseerd op het behoud van eiwitsequentie en structuur 15 . Om dit te overwinnen is een nieuwe experimentele methode haS is vastgesteld die het mogelijk maakt om de RNA-motieven te identificeren die een RBP van belang heeft, alsmede voor de bepaling van de precieze plaats van binding. Deze methode, genaamd &quot;verknoping en immunoprecipitatie&quot; (CLIP), bestaat uit in vivo UV-verknoping gevolgd door immunoprecipitatie 11 . Vroege studies hebben aangetoond dat fotoactivering van DNA- en RNA-nucleotiden kan optreden bij excitatie UV-golflengten groter dan 245 nm. De reactie door thymidine lijkt gunstig te zijn (rang in volgorde van verminderde fotoreactiviteit: dT&gt; dC&gt; rU&gt; rC, dA, dG) 12 . Door gebruik te maken van UV-licht met een golflengte van 254 nm (UV-C) werd geconstateerd dat covalente bindingen tussen RNA-nucleotiden en eiwitresiduen worden gecreëerd bij slechts enkele Astromen (Å). Het fenomeen wordt dus de &quot;nul-lengte&quot; verknoping van RNA en RBP genoemd. Dit kan gevolgd worden door een strikte zuivering procedure<html> Duur met weinig achtergrond 13 , 14 . Een complementaire strategie voor CLIP is het combineren van in vivo UV-verknoping met eiwitidentificatie om het landschap van RBP&#39;s te beschrijven. Een aantal van dergelijke genoomwijdte mRNA gebonden proteomen zijn geïsoleerd uit gistcellen, embryonale stamcellen (ESC&#39;s) en menselijke cellijnen ( dwz HEK293 en HeLa) met behulp van deze nieuwe experimentele aanpak, genaamd &quot;mRNA interactome capture&quot; 18 , 19 , 20 , 21 . De methode bestaat uit in vivo UV-verknoping gevolgd door mRNP zuivering en MS-gebaseerde proteomics. Door deze strategie toe te passen, zijn veel nieuwe &quot;maanlichtende&quot; RBP&#39;s die niet-kanonieke RBD&#39;s bevatten, ontdekt en is het duidelijk geworden dat meer eiwitten RNA-bindende capaciteiten hebben dan eerder werd verondersteld&quot;&gt; 15 , 16 , 17. Het gebruik van deze methode zorgt voor nieuwe toepassingen en voor de mogelijkheid om nieuwe biologische vragen te beantwoorden bij het onderzoeken van RBP&#39;s. Bijvoorbeeld, heeft een recente studie het behoud van het mRNA gebonden proteome onderzocht (de kern RBP Proteome) tussen gist en menselijke cellen 22 . Plant RBP&#39;s zijn al gebleken betrokken te zijn bij groei en ontwikkeling ( bijv . In de posttranscriptie regulatie van bloeitijd, de circadiaanse klok en genuitdrukking in mitochondriën en chloroplasten) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . Bovendien worden ze gedacht aan functies in de cellulaire processen die reageren op abiotische stressen ( bijvoorbeeld koud, droogte, saLinheid en absciszuur (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . Er zijn meer dan 200 voorspelde RBP genen in het Arabidopsis thaliana genoom, gebaseerd op RNA herkenningsmotief (RRM) en K homologie (KH) domein sequentie motieven; In rijst zijn ongeveer 250 genoteerd 35 , 36 . Het is opmerkelijk dat veel voorspelde RBP&#39;s uniek zijn voor planten ( bijv. Geen metazoan-orthologen tot ongeveer 50% van de voorspelde Arabidopsis- RBP&#39;s die een RRM-domein bevatten) 35 , wat suggereert dat veel nieuwe functies kunnen dienen. De functies van de meeste voorspelde RBP&#39;s blijven uncharacterized 23 . De isolatie van mRNA gebonden proteomen uit Arabidopsis geëtolideerde zaailingen, bladweefsel, gekweekte wortelcellen en bladmemofyl protoplasten door het gebruik vanMRNA interactome capture is recentelijk gerapporteerd 38 , 39 . Deze studies tonen het sterke potentieel om in de nabije toekomst systematisch de functionele RBP&#39;s in planten te catalogeren. Hier presenteren we een protocol voor mRNA interactome capture van plant protoplasten (dat wil zeggen cellen zonder celwanden). Arabidopsis thaliana blad mesofyl protoplasten zijn het belangrijkste type bladcel. De geïsoleerde protoplasten zorgen voor optimale toegang van UV licht aan de cellen. Dit celtype kan gebruikt worden in analyses die transient eiwitten voor functionele karakterisering 40 , 41 uitdrukken. Bovendien is protoplasting toegepast op verscheidene andere plantencelsoorten en soorten 42 , 43 , 44 ( bijv. Petersson et al ., 2009; Bargmann en Birnbaum, 2010; en Hong et al ., 2012). &lt;P class = &quot;jove_content&quot;&gt; De methode omvat in totaal 11 stappen ( figuur 1A ). Arabidopsis blad mesofyl protoplasten worden eerst geïsoleerd (stap 1) en worden vervolgens UV bestraald om verknoopte mRNPs (stap 2) te vormen. Wanneer protoplasten worden gelicht onder denatureringsomstandigheden (stap 3), worden de verknoopte mRNP&#39;s in lysis / bindingsbuffer vrijgegeven en door oligo-d (T) 25 kralen (stap 4) getrokken. Na verscheidene ronden strengende wassen worden de mRNP&#39;s gezuiverd en verder geanalyseerd. De gedenatureerde peptiden van mRBPs worden verteerd door eiwitase K voordat de verknoopte mRNA&#39;s worden gezuiverd en de RNA-kwaliteit wordt geverifieerd door qRT-PCR (stappen 5 en 6). Na behandeling met RNase en eiwitconcentratie (stap 7) wordt de proteïnekwaliteit geregeld door SDS polyacrylamide gelelektroforese (SDS-PAGE) en zilverkleuring (stap 8). Het verschil in eiwitbandpatronen kan gemakkelijk worden geïllustreerd tussen een verknoopt monster (CL) en een niet-verknoopt monster (niet-CL;Het negatieve controle monster van protoplasten die niet aan UV-bestraling worden blootgesteld). De identificatie van eiwitten wordt bereikt door middel van MS-gebaseerde proteomics. De eiwitten uit het CL-monster worden gescheiden door eendimensionale polyacrylamidegelelektroforese (1D-PAGE) om mogelijke achtergrondverontreiniging te verwijderen, &quot;in-gel gedigereerd&quot; in korte peptiden met behulp van trypsine, en worden gezuiverd (stap 9). Nano reverse-phase vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (nano-LC-MS) maakt het mogelijk de hoeveelheid definitieve eiwitten in het mRNA gebonden proteome te bepalen (stap 10). Tenslotte worden de geïdentificeerde mRBP&#39;s gekenmerkt en gecatalogiseerd met behulp van bioinformatische analyse (stap 11).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 M Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1902-500G</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Art. 4935</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M MES (pH 5.7) 
			(4-morpholineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			MMg solution, 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>CELLULASE 
			&#8220;ONOZUKA&#8221; 
			R-10, 10 g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>MACEROZYME R-10, 10g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% (w/v) BSA 
			(Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Chem-Lab NV</td>
			<td>CL00.0317.1000</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td>W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiCl 
			(Lithium Chloride)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>199885000</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2 &#38; 
			Low salt buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% (w/v) LiDS 
			(Lithium Dodecyl Sulphate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4632-25G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M DTT 
			(Dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Wash buffer 2</td>
			<td>307866</td>
			<td>Lysis/binding buffer,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl))</td>
			<td>Acros &#38; 
			Fisher Chemical</td>
			<td>167620010 &#38; 
			H/1200/PB15</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>ED-500G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8.22184.0500</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M NaOH</td>
			<td>VWR PROLABO CHEMICALS</td>
			<td>28244.295</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (pH 7.4) 
			(Phosphate Buffered Saline) 
			containing 
			(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Chemical, MERCK, 
			Sigma-aldrich &#38; SAFC</td>
			<td>S/3160/60, 
			Art. 4935, 
			71640-250G &#38; 
			60230</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (2 &#956;g/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11789020</td>
			<td>Protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td>qRT-PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td>RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>322415</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>537020</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NH4HCO3 
			(Ammonium bicarbonate) 
			&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td>Gel hydration &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH3CN 
			(Acetonitrile)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>34851-100ML</td>
			<td>Gel dehydration &#38; 
			Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA 
			(Iodoacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I4386-10G</td>
			<td>Alkylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA 
			(Trifluoroacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>302031-10X1ML</td>
			<td>Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA 
			(Formic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>06554-5G</td>
			<td>Peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution (6 ng/&#956;L)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>Peltracom</td>
			<td>LP2D</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite 3</td>
			<td>Sibli AS</td>
			<td>05VERMICULIET</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150 x 20 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE2M229104</td>
			<td>Homogenization of final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T585</td>
			<td>Rosette leaf strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-75 &#956;m nylon mesh</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>74010</td>
			<td>Protoplast suspension filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL round bottom tubes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1918-10EA</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer 
			(B&#252;rker hemocytometer)</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td>Protoplast cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinking apparatus 
			(HL-2000 HybriLinker)</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>UVP95003101</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp 
			(Sankyo-Denki G8T5)</td>
			<td>SANKYO 
			DENKI</td>
			<td>SD G8T5</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL glass syringe</td>
			<td>FORTUNA Optima</td>
			<td>Z314560</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow needle (0.9 x 25 mm)</td>
			<td>Becton Dickinson microlance 3</td>
			<td>2021-04</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Model L26</td>
			<td>Labinco BV</td>
			<td>26110912</td>
			<td>Sample incubation by rotating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-d(T)25 magnetic beads 
			(5 mg/mL)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1419S</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units 
			(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>mRBP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td>Silver-staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit 
			(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)</td>
			<td>STRATEC Molecular</td>
			<td>1064100300</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR cycler 
			(StepOne Real-Time PCR cycler)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>cDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-C18 columns 
			(Millipore Zip Tip &#181;-C18 columns)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>720046-960EA</td>
			<td>Peptide purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer 
			(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column 
			(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES800</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 precolumn 
			(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for qRT-PCR assay</td>
			<td colspan="3">Sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBQ10 mRNA 
			(Li et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG 
			Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S rRNA 
			(Durut et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG 
			Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mrna interactome capture from plant protoplasts

RNA-bindende eiwitten (RBP&#39;s) bepalen de fates van RNA&#39;s. Zij nemen deel aan alle RNA biogenese pathways en dragen bij tot post-transcriptie gene regulatie (PTGR) van messenger RNAs (mRNAs). In de afgelopen jaren zijn een aantal mRNA gebonden proteomen uit gist- en zoogdiercellijnen succesvol geïsoleerd door gebruik te maken van een nieuwe methode genaamd &quot;mRNA interactome capture&quot;, die het mogelijk maakt om mRNA-bindende eiwitten (mRBP&#39;s) te identificeren. Direct vanuit een fysiologische omgeving. De werkwijze bestaat uit in vivo ultraviolette (UV) verknoping, aftrek en zuivering van messenger ribonucleoproteïne complexen (mRNPs) door oligo (dT) kralen, en de daaropvolgende identificatie van de verknoopte eiwitten door middel van massaspectrometrie (MS). Heel recent, door dezelfde methode toe te passen, zijn verschillende planten mRNA gebonden proteomen gelijktijdig gerapporteerd uit verschillende Arabidopsis weefsel bronnen: geëtolideerde zaailingen, bladweefsel,Blad mesofyl protoplasten, en gekweekte wortelcellen. Hier presenteren wij de geoptimaliseerde mRNA interactome capture methode voor Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten, een celtype dat dient als een veelzijdig hulpmiddel voor experimenten die diverse cellulaire assays omvatten. De voorwaarden voor optimale eiwitopbrengst omvatten de hoeveelheid startweefsel en de duur van UV-bestraling. In het mRNA gebonden proteoom verkregen uit een middelgrote experiment (10 7 cellen) bleek dat RBP&#39;s die op RNA-bindende capaciteit beschikten, te oververtegenwoordigd waren en veel nieuwe RBP&#39;s werden geïdentificeerd. Het experiment kan opgeschaald worden (10 9 cellen), en de geoptimaliseerde methode kan toegepast worden op andere plantencel typen en soorten om in grote mate te isoleren, te catalogeren en mRNA-gebonden proteomen te vergelijken.

We hebben een karakteristieke halo waargenomen die de kralenpelletje in het CL-monster omsluit, in wasstap 4.3 met wasbuffer 2 ( Figuur 1B ). Hoewel het niet is onderzocht, kan dit fenomeen waarschijnlijk worden verklaard door de interferentie van verknoopte mRNP complexen met kraal aggregatie tijdens de magnetische opname waardoor een meer diffuus aggregaat wordt gevormd. Het geeft aan dat de oligo-d (T) 25 kraalvangst effectief was <sup class="x...

Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Hier presenteren wij een interactief capture protocol toegepast op Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasten. Deze methode berust op in vivo UV-verknoping en staat voor isolatie en identificatie van plantaardige mRNA-bindende eiwitten uit een fysiologische omgeving.

MRNA Interactome Capture van Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Eiwitcomplex Affiniteit Capture uit Cryomilled zoogdiercellen

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessen uit een analyse van maïs Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Een eenvoudige gefractieerde extractie methode voor de uitgebreide analyse van metabolieten, lipiden en proteïnen uit een enkele monster

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolatie en respiratoire metingen van Mitochondria van Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blad Spray massaspectrometrie: Een snelle Ambient ionisatie techniek om te beoordelen direct metabolieten van plantaardige weefsels

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Cafeïne-extractie, enzymatische activiteit en genexpressie van cafeïne Synthase uit plantaardige cel schorsingen

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Eiwit invoer in chloroplasten met behulp van protoplasten studeren

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Vastleggen en identificatie van RNA-bindende proteÃ¯nen met behulp van klik chemie-bijgewoonde RNA-interactome vangen (CARIC) strategie

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-vrije Immunoprecipitation massaspectrometrie workflow voor grootschalige nucleaire interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...