Name: mrna interactome capture from plant protoplasts
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

Nous reconnaissons le laboratoire du Prof. Joris Winderickx, qui a fourni l&#39;appareil de réticulation UV équipé de la lampe UV conventionnelle. KG est soutenu par le fonds de recherche KU Leuven et reconnaît le soutien de la subvention FWO G065713N.

1. Isolation du Protoplaste Mésophylle des feuilles d&#39; Arabidopsis NOTE: Les protoplastes de la mésophylle de la feuille d&#39; Arabidopsis sont essentiellement isolés comme décrit par Yoo et al ., 2007, avec plusieurs modifications 40 . <ol><li> Croissance des plantes <ol><li> Faire tremper environ 200 graines Arabydopsis thaliana Col-0 ecotype dans de l&#39;eau stérilisée pendant 2 jours à 4 ° C dans...

Nous avons réussi à appliquer une capture d&#39;interraction d&#39;ARNm, développée pour la levure et les cellules humaines, pour planter des protoplastes de mésophylle foliaire. Les cellules de la mésophylle des feuilles sont le type principal de tissu moulu dans les feuilles des plantes. L&#39;avantage majeur de cette méthode est qu&#39;il utilise une réticulation in vivo pour découvrir les protéines à partir d&#39;un environnement physiologique. Dans ce protoc...

Les eucaryotes utilisent plusieurs voies de régulation de la biogenèse de l&#39;ARN pour maintenir les processus biologiques cellulaires. Parmi les types connus d&#39;ARN, l&#39;ARNm est très diversifié et porte la capacité de codage des protéines et leurs isoformes 1. La voie PTGR dirige le sort des pré-ARNm 2 , 3 . Les RBP de différentes familles de gènes contrôlent la régulation de l&#39;ARN, et dans PTGR, les mRBP spécifiques guident les ARNm par des interactions physiques directes, formant des mRNP fonctionnels. Par conséquent, l&#39;identification et la caractérisation des mRBP et de leurs mRNP sont essentiels pour comprendre la régulation du métabolisme de l&#39;ARNm cellulaire 2. Au cours des trois dernières décennies, diverses méthodes in vitro - y compris les tests de changement de mobilité électrophorétique de l&#39;ARN (REMSA), l&#39;évolution systématique des ligands par des essais d&#39;enrichissement exponentiel (SELEX) basé sur des constructions dérivées de bibliothèque, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radiomarquées ou quantitativesLes essais de liaison à l&#39;ARN de fluorescence, la cristallographie aux rayons X et la spectroscopie RMN 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 - ont été largement appliqués aux études de RBP, principalement à partir de cellules de mammifères. Les résultats de ces études sur les RBP de mammifères peuvent être recherchés via la base de protéines de liaison à l&#39;ARN (RBPDB), qui collecte les observations publiées 10 . Bien que ces approches in vitro soient des outils puissants, elles déterminent les motifs d&#39;ARN liés à partir d&#39;un groupe d&#39;ARN donné de séquences et sont donc limitées dans leur capacité à découvrir de nouveaux ARN cible. Il en va de même pour les stratégies informatiques pour prédire les RBP à l&#39;échelle du génome, qui sont basées sur la conservation de la séquence et de la structure des protéines 15 . Pour remédier à cela, une nouvelle méthode expérimentale haA été établi qui permet d&#39;identifier les motifs d&#39;ARN auxquels une RBP d&#39;intérêt interagit, ainsi que pour déterminer l&#39;emplacement précis de la liaison. Cette méthode, appelée «réticulation et immunoprécipitation» (CLIP), est composée d&#39;une réticulation UV in vivo suivie d&#39;une immunoprécipitation 11 . Les premières études ont montré que la photoactivation des nucléotides d&#39;ADN et d&#39;ARN peut se produire à des longueurs d&#39;onde UV d&#39;excitation supérieures à 245 nm. La réaction à travers la thymidine semble être favorisée (classement par ordre de diminution de la photoréactivité: dT ≥ dC&gt; rU&gt; rC, dA, dG) 12 . En utilisant une lumière UV avec une longueur d&#39;onde de 254 nm (UV-C), on a observé que des liaisons covalentes entre des nucléotides d&#39;ARN et des résidus de protéines sont créées dans la gamme de seulement quelques Angstroms (Å). Le phénomène est donc appelé la réticulation &quot;nulle&quot; de l&#39;ARN et du RBP. Ceci peut être suivi d&#39;une procédure de purification rigoureuse<html> Dure peu de fond 13 , 14 . Une stratégie complémentaire de CLIP consiste à combiner la réticulation UV in vivo avec l&#39;identification des protéines pour décrire le paysage des RBP. Un certain nombre de protéome tels lié ARNm-pangénomiques ont été isolées à partir de cellules de levure, les cellules souches embryonnaires (CSE), et des lignées cellulaires humaines (c. -à- HEK293 et HeLa) en utilisant cette nouvelle approche expérimentale, appelée « ARNm interactome capture » 18, 19 , 20 , 21 . Le procédé est composé d&#39;une réticulation UV in vivo suivie d&#39;une purification de mRNP et d&#39;une protéomique à base de MS. En appliquant cette stratégie, on a découvert de nombreuses RBP romantiques &quot;Moonlighting&quot; contenant des RBD non canoniques, et il est devenu évident que plus de protéines ont des capacités de liaison à l&#39;ARN que précédemment supposées&quot;&gt; 15 , 16 , 17. L&#39;utilisation de cette méthode permet de nouvelles applications et la capacité de répondre à de nouvelles questions biologiques lors de l&#39;étude des RBP. Par exemple, une étude récente a étudié la conservation du protéome lié à l&#39;ARNm (RBP de base Protéome) entre la levure et les cellules humaines 22 . Les RBP des plantes ont déjà été impliquées dans la croissance et le développement ( p . Ex ., Dans la régulation post-transcriptionnelle du temps de floraison, de l&#39;horloge circadienne et de l&#39;expression des gènes dans les mitochondries et les chloroplastes) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . En outre, on pense qu&#39;ils exercent des fonctions dans les processus cellulaires répondant aux contraintes abiotiques ( p. Ex., Froid, sécheresse, saLinity et abscisic acid (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . Il existe plus de 200 gènes de RBP prédits dans le génome d&#39; Arabidopsis thaliana , basés sur des motifs de séquence de domaine de reconnaissance d&#39;ARN (RRM) et de K (HK) d&#39;homologie (KH); Dans le riz, environ 250 ont été notés 35 , 36 . Il est remarquable que de nombreuses RBP prédites semblent être uniques aux plantes ( p. Ex., Aucun orthologue métazoaire à environ 50% des RBP d&#39; Arabidopsis prédites contenant un domaine RRM) 35 , suggérant que beaucoup peuvent servir de nouvelles fonctions. Les fonctions de la plupart des RBP prédites restent non caractérisées 23 . L&#39;isolement des protéomes liés à l&#39;ARNm provenant des semis étiolés d&#39; Arabidopsis , des tissus foliaires, des cellules racines cultivées et des protoplastes de mésophylle foliaire par l&#39;utilisation deLa capture de l&#39;interaction de l&#39;ARNm a récemment été rapportée 38 , 39 . Ces études démontrent le fort potentiel de catalogage systématique de RBP fonctionnelles dans les plantes dans un proche avenir. Ici, nous présentons un protocole pour la capture de l&#39;interaction de l&#39;ARNm à partir de protoplastes végétaux ( c.-à-d. Cellules sans parois cellulaires). Les protoplastes de mésophylle de la feuille d&#39; Arabidopsis thaliana sont le principal type de cellule foliaire. Les protoplastes isolés permettent un accès optimal de la lumière UV aux cellules. Ce type de cellule peut être utilisé dans des analyses qui expriment de manière transitoire des protéines pour la caractérisation fonctionnelle 40 , 41 . En outre, le protoplage a été appliqué à plusieurs autres types de cellules végétales et aux espèces 42 , 43 , 44 ( p. Ex., Petersson et al ., 2009; Bargmann et Birnbaum, 2010; et Hong et al ., 2012). &lt;P class = &quot;jove_content&quot;&gt; La méthode englobe un total de 11 étapes ( Figure 1A ). Les protoplastes de mésophylle de la feuille d&#39; Arabidopsis sont d&#39;abord isolés (étape 1) et sont par la suite irradiés par UV pour former des mRNP réticulés (étape 2). Lorsque les protoplastes sont lysés dans des conditions de dénaturation (étape 3), les mRNP réticulés sont libérés dans un tampon de lyse / liaison et abattus par des billes oligo-d (T) 25 (étape 4). Après plusieurs cycles de lavages rigoureux, les mRNP sont purifiés et analysés plus avant. Les peptides dénaturés des mRBP sont digérés par la protéinase K avant que les ARNm réticulés ne soient purifiés et que la qualité de l&#39;ARN soit vérifiée par qRT-PCR (étapes 5 et 6). Après le traitement par RNase et la concentration de protéines (étape 7), la qualité de la protéine est contrôlée par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) et coloration à l&#39;argent (étape 8). La différence entre les bandes de protéines peut facilement être visualisée entre un échantillon réticulé (CL) et un échantillon non réticulé (non CL;L&#39;échantillon témoin négatif des protoplastes qui n&#39;est pas soumis à une irradiation UV). L&#39;identification des protéines est obtenue grâce à une protéomique à base de MS. Les protéines provenant de l&#39;échantillon CL sont séparées par une électrophorèse en gel de polyacrylamide unidimensionnel (1D-PAGE) pour éliminer la contamination potentielle du fond, sont &quot;digérées dans un gel&quot; en peptides courts en utilisant de la trypsine et sont purifiées (étape 9). La chromatographie liquide à phase inverse nano couplée à la spectrométrie de masse (nano-LC-MS) permet de déterminer la quantité de protéines définitives dans le protéome lié à l&#39;ARNm (étape 10). Enfin, les mRBP identifiés sont caractérisés et catalogués à l&#39;aide d&#39;une analyse bioinformatique (étape 11).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 M Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1902-500G</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Art. 4935</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M MES (pH 5.7) 
			(4-morpholineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			MMg solution, 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>CELLULASE 
			&#8220;ONOZUKA&#8221; 
			R-10, 10 g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>MACEROZYME R-10, 10g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% (w/v) BSA 
			(Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Chem-Lab NV</td>
			<td>CL00.0317.1000</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td>W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiCl 
			(Lithium Chloride)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>199885000</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2 &#38; 
			Low salt buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% (w/v) LiDS 
			(Lithium Dodecyl Sulphate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4632-25G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M DTT 
			(Dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Wash buffer 2</td>
			<td>307866</td>
			<td>Lysis/binding buffer,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl))</td>
			<td>Acros &#38; 
			Fisher Chemical</td>
			<td>167620010 &#38; 
			H/1200/PB15</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>ED-500G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8.22184.0500</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M NaOH</td>
			<td>VWR PROLABO CHEMICALS</td>
			<td>28244.295</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (pH 7.4) 
			(Phosphate Buffered Saline) 
			containing 
			(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Chemical, MERCK, 
			Sigma-aldrich &#38; SAFC</td>
			<td>S/3160/60, 
			Art. 4935, 
			71640-250G &#38; 
			60230</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (2 &#956;g/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11789020</td>
			<td>Protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td>qRT-PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td>RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>322415</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>537020</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NH4HCO3 
			(Ammonium bicarbonate) 
			&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td>Gel hydration &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH3CN 
			(Acetonitrile)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>34851-100ML</td>
			<td>Gel dehydration &#38; 
			Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA 
			(Iodoacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I4386-10G</td>
			<td>Alkylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA 
			(Trifluoroacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>302031-10X1ML</td>
			<td>Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA 
			(Formic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>06554-5G</td>
			<td>Peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution (6 ng/&#956;L)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>Peltracom</td>
			<td>LP2D</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite 3</td>
			<td>Sibli AS</td>
			<td>05VERMICULIET</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150 x 20 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE2M229104</td>
			<td>Homogenization of final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T585</td>
			<td>Rosette leaf strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-75 &#956;m nylon mesh</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>74010</td>
			<td>Protoplast suspension filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL round bottom tubes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1918-10EA</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer 
			(B&#252;rker hemocytometer)</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td>Protoplast cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinking apparatus 
			(HL-2000 HybriLinker)</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>UVP95003101</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp 
			(Sankyo-Denki G8T5)</td>
			<td>SANKYO 
			DENKI</td>
			<td>SD G8T5</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL glass syringe</td>
			<td>FORTUNA Optima</td>
			<td>Z314560</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow needle (0.9 x 25 mm)</td>
			<td>Becton Dickinson microlance 3</td>
			<td>2021-04</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Model L26</td>
			<td>Labinco BV</td>
			<td>26110912</td>
			<td>Sample incubation by rotating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-d(T)25 magnetic beads 
			(5 mg/mL)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1419S</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units 
			(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>mRBP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td>Silver-staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit 
			(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)</td>
			<td>STRATEC Molecular</td>
			<td>1064100300</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR cycler 
			(StepOne Real-Time PCR cycler)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>cDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-C18 columns 
			(Millipore Zip Tip &#181;-C18 columns)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>720046-960EA</td>
			<td>Peptide purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer 
			(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column 
			(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES800</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 precolumn 
			(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for qRT-PCR assay</td>
			<td colspan="3">Sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBQ10 mRNA 
			(Li et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG 
			Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S rRNA 
			(Durut et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG 
			Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mrna interactome capture from plant protoplasts

Les protéines de liaison à l&#39;ARN (RBP) déterminent le sort des ARN. Ils participent à toutes les voies de la biogenèse de l&#39;ARN et contribuent en particulier à la régulation post-transcriptionnelle des gènes (PTGR) des ARN messagers (mRNA). Au cours des dernières années, un certain nombre de protéomes liés à l&#39;ARNm provenant de lignées de levure et de cellules de mammifères ont été isolés avec succès en utilisant une nouvelle méthode appelée &quot;capture d&#39;interconnexion d&#39;ARNm&quot;, qui permet l&#39;identification de protéines de liaison d&#39;ARNm (mRBP) Directement à partir d&#39;un environnement physiologique. Le procédé se compose de in vivo perles ultraviolet (UV) réticulation, pull-down et une purification des complexes de ribonucléoprotéine messager (les mRNP) par oligo (dT), et l&#39;identification ultérieure des protéines réticulées par spectrométrie de masse (MS). Très récemment, en appliquant la même méthode, plusieurs protéomes liés à l&#39;ARNm de plantes ont été signalés simultanément à partir de différentes sources de tissus d&#39; Arabidopsis : semis étiolés, tissu de feuilles,Les protoplastes de mésophylle des feuilles et les cellules racines cultivées. Ici, nous présentons la méthode optimisée de capture de l&#39;interaction de l&#39;ARNm pour les protoplastes de la mésophylle de la feuille d&#39; Arabidopsis thaliana , un type de cellule qui sert d&#39;outil polyvalent aux expériences qui incluent divers essais cellulaires. Les conditions pour un rendement optimal en protéines comprennent la quantité de tissu de départ et la durée de l&#39;irradiation UV. Dans le protéome lié à l&#39;ARNm obtenu à partir d&#39;une expérience à moyenne échelle (10 7 cellules), les RBP ont constaté que la capacité de liaison à l&#39;ARN était surreprésentée et de nombreuses RBP nouvelles ont été identifiées. L&#39;expérience peut être mise à l&#39;échelle (10 9 cellules), et la méthode optimisée peut être appliquée à d&#39;autres types et espèces de cellules végétales pour isoler, cataloguer et comparer les protéomes liés aux ARNm dans les plantes.

Nous avons observé un halo caractéristique, qui entoure la pastille de perles dans l&#39;échantillon CL, dans l&#39;étape de lavage 4.3 avec le tampon de lavage 2 ( Figure 1B ). Bien qu&#39;il n&#39;ait pas été étudié, ce phénomène s&#39;explique probablement par l&#39;interférence des complexes de mRNP réticulés avec l&#39;agrégation des talons pendant la capture magnétique, ce qui provoque l&#39;apparition d&#39;un agrégat plus diffus. Il i...

Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Ici, nous présentons un protocole de capture interactif appliqué aux protoplastes de mésophylle de la feuille d&#39; Arabidopsis thaliana . Cette méthode repose de manière critique sur la réticulation UV in vivo et permet l&#39;isolement et l&#39;identification des protéines de liaison de l&#39;ARNm de la plante à partir d&#39;un environnement physiologique.

Capture interactine d&#39;ARNm à partir de protoplastes végétaux

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture à partir de cellules de mammifères Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Recherche

Biochimie

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Conception expérimentale pour Laser Microdissection ARN-Seq: Leçons tirées d&#39;une analyse du développement du maïs Feuille

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Une méthode simple d&#39;extraction fractionnée pour l&#39;analyse complète des métabolites, des lipides et des protéines à partir d&#39;un seul échantillon

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolement et mesures respiratoire des mitochondries d’Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Spectrométrie de masse de pulvérisation foliaire : Une Technique d’ionisation ambiant rapide pour évaluer directement les métabolites de tissus végétaux

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Extraction de la caféine, l’activité enzymatique et l’Expression génique de caféine Synthase de Suspensions de cellules végétales

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Étudier l’Import des protéines dans des chloroplastes à l’aide de protoplastes

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Capture et Identification des protéines de liaison à l’ARN à l’aide de Click chimie assistée par ARN-interactome Capture stratégie (CARIC)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

À l’aide au transfert d’énergie Fluorescence in Vitro pour étudier la dynamique des protéines Complexes à une échelle de temps de milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Flux de spectrométrie de masse d'immunoprécipitation sans étiquette pour le profilage de l'interaction nucléaire à grande échelle

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...