Name: mrna interactome capture from plant protoplasts
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

אנו מכירים במעבדה של פרופ &#39;יוריס וינדריקס, שסיפק את המנגנון crosslinking UV מצויד מנורת UV קונבנציונאלי. KG נתמך על ידי קרן מחקר KU Leuven ומכיר תמיכה של FWO להעניק G065713N.

1. ארבידופסיס עלה Mesophyll Protoplast בידוד הערה: ארבידופסיס prooplasts mesophyll עלה מבודדים למעשה כפי שתואר על ידי Yoo et al ., 2007, עם מספר שינויים 40 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גידול של צמחים...

אנו בהצלחה להחיל mRNA אינטראקציה ללכוד, שפותח עבור שמרים ותאי אדם, לשתול protoplasts mesophyll עלה. תאים עלה mesophyll הם הסוג העיקרי של רקמת הקרקע עלים צמח. היתרון העיקרי של שיטה זו היא כי היא משתמשת vivo crosslinking לגלות את החלבונים מסביבה פיזיולוגית. <p class="jove_content" style=";text-align:right;directi...

Eukaryotes להשתמש RNA מספר ביוגנזה מסלולים רגולטוריים כדי לשמור על תהליכים ביולוגיים תאיים. בין סוגים ידועים של רנ&quot;א, mRNA הוא מגוון מאוד ונושא קיבולת קידוד של חלבונים ואת האיזופורמים שלהם 1. מסלול PTGR מכוון את גורלם של pre-mRNAs 2 , 3 . RBPs ממשפחות גנים שונים לשלוט על הרגולציה של RNA, ב PTGR, mRNAs ספציפיים mRNAs מדריך דרך אינטראקציות פיזיות ישירות, יצירת mRNPs תפקודית. לכן, זיהוי ואפיון mRBPs ו mRNPs שלהם הוא קריטי להבנת הרגולציה של חילוף החומרים mRNA נייד 2. מעל שלושת העשורים האחרונים, שונים בשיטות חוץ גופית - כולל מבחני ניידות RNASA ניידות (REMSA) מבחנים, אבולוציה שיטתית של ligands ידי מבחני העשרה מעריכי (SELEX) מבוסס על ספריות הנגזרות בונה, RNA Bind-N-Seq (RBNS), radiolabeled או כמותיפלואורסצנטי RNA מחייב מבחני, קריסטלוגרפיה רנטגן, ו ספקטרוסקופיה תמ&quot;ג 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 - יושמו באופן נרחב על מחקרים של RBPs, בעיקר תאים יונקים. התוצאות של מחקרים אלה של RBPs יונקים ניתן לחפש באמצעות RNA מחייב DataBase חלבון (RBPDB), אשר אוספת את התצפיות שפורסמו 10 . למרות אלה בגישות חוץ גופית הם כלים רבי עוצמה, הם קובעים את מוטיבים RNA קשורות מתוך מאגר RNA נתון רצפים ולכן מוגבלים ביכולתם לגלות RNAs היעד החדש. הדבר נכון גם לגבי אסטרטגיות חישוביות לחזות RBPs גנום רחב, אשר מבוססים על שימור רצף מבנה חלבון 15 . כדי להתגבר על זה, שיטה ניסיונית חדשה חהS שהוקם המאפשר זיהוי של מוטיבים RNA כי RBP של עניין אינטראקציה עם, כמו גם על קביעת המיקום המדויק של מחייב. שיטה זו, המכונה &quot;crosslinking ו immunoprecipitation&quot; (CLIP), מורכב ב crosslinking UV vivo ואחריו immunoprecipitation 11 . מחקרים מוקדמים הראו כי photactivation של DNA ו RNA נוקליאוטידים יכול להתרחש אורכי גל UV גדול מ 245 ננומטר. התגובה באמצעות thymidine נראה מועדף (דרגה של photoreactivity ירד: dT ≥ dC&gt; rU&gt; rC, dA, dG) 12 . באמצעות אור UV עם אורך גל של 254 ננומטר (UV-C), נצפתה כי קשרים קוולנטיים בין נוקליאוטידים RNA ו שאריות חלבון נוצרות כאשר בטווח של רק כמה אנגסטרומים (Å). התופעה נקראת אפוא &quot;crosslinking&quot; באורך אפס של RNA ו- RBP. זה יכול להיות ואחריו פרוטה טיהור מחמירים<html> Dure עם רקע קטן 13 , 14 . אסטרטגיה משלימה CLIP היא לשלב ב vivo UV crosslinking עם זיהוי חלבון כדי לתאר את הנוף של RBPs. מספר פרוטוקולים כאלה של גנום- mRNA, היו מבודדים מתאי שמרים, תאי גזע עובריים (ESCs) וקווים של תאים אנושיים ( כלומר, HEK293 ו- HeLa) תוך שימוש בגישה הניסויית החדשה, הנקראת &quot;mRNA אינטראקציה ללכוד&quot; 18 , 19 , 20 , 21 . השיטה מורכבת של vivo UV crosslinking ואחריו טיהור mRNP ו- MS מבוסס proteomics. על ידי יישום אסטרטגיה זו, רבים חדשים &quot;moonlighting&quot; RBPs המכילים RBDs שאינם קנוניים התגלו, וזה הפך ברור כי יותר חלבונים יש RNA מחייב קיבולת מאשר בעבר היה אמור להיות&quot;15 , 16 , 17. השימוש בשיטה זו מאפשר ליישומים חדשים וליכולת לענות על שאלות ביולוגיות חדשות בעת חקר RBPs לדוגמה, מחקר שנערך לאחרונה בחן את שימור של פרוטאומה ה- mRNA קשור (הליבה RBP פרוטאומה) בין שמרים לתאים אנושיים 22 . RBPs צמחים כבר נמצא להיות מעורב בצמיחה ופיתוח ( למשל , בתקנה שלאחר תעתיק של זמן הפריחה, השעון היממה, ביטוי גנים במיטוכונדריה ו chloroplasts) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . יתר על כן, הם חשבו לבצע פונקציות בתהליכים הסלולר להגיב על מדגיש abiotic ( למשל, קר, בצורת, saLines, וחומצה אבסיסית (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . ישנם יותר מ 200 גנים RBP החזוי בגנום ארבידופסיס thaliana , המבוססת על מוטיב הכרה RNA (RRM) ו K הומולוגיה (KH) מוטיבים רצף מושלם; באורז, כ -250 כבר ציינו 35 , 36 . יש לציין כי רבים חזו כי RBPs נראים ייחודיים לצמחים ( למשל, לא מטאזואנים אורתולוגים לכ 50% של ארבידופסיס RBPs החזוי המכיל תחום RRM) 35 , מה שמרמז כי רבים עשויים לשרת פונקציות חדשות. הפונקציות של רוב RBPs החזוי להישאר uncharacterized 23 . בידוד של proteomes mRNA קשורה מן שתילים ארבידופסיס etiolated, רקמת עלה, תאים שורש תרבותי, ו protoplasts mesophyll עלה באמצעות שימושלכידת mRNA אינטראקציה לאחרונה דווח 38 , 39 . מחקרים אלה מדגימים את הפוטנציאל החזק של קיטלוג שיטתי של RBPs פונקציונליים בצמחים בעתיד הקרוב. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכידת mRNA אינטראקציה מן protoplasts צמח ( כלומר, תאים ללא קירות התא). ארבידופסיס thaliana עלה prooplasts mesophyll הם הסוג העיקרי של תא עלה. Protoplasts מבודד לאפשר גישה אופטימלית של אור UV לתאים. סוג תא זה יכול לשמש מבחני כי transiently להביע חלבונים אפיון פונקציונלי 40 , 41 . יתר על כן, Protoplasting הוחל על סוגים אחרים של תאים צמחיים ומינים 42 , 43 , 44 ( למשל, Petersson et al ., 2009; Bargmann and Birnbaum, 2010, ו- Hong et al , 2012). &lt;P class = &quot;jove_content&quot;&gt; השיטה כוללת סך של 11 צעדים ( איור 1 א ). ארבידופסיס protoplasts mesophyll עלה מבודדים הראשון (שלב 1) והם לאחר מכן UV מוקרן ליצירת mRNPs crosslinked (שלב 2). כאשר protoplasts lysed תחת תנאי denaturing (שלב 3), mRNPs crosslinked משתחררים במאגר תמוגה / מחייב ומשוך למטה על ידי אוליגו d (T) 25 חרוזים (שלב 4). לאחר מספר סיבובים של שוטף מחמירים, mRNPs הם מטוהרים עוד ניתח. פפטידים denatured של mRBPs מתעכלים על ידי K proteinase לפני mRNAs crosslinked הם מטוהרים ואת איכות ה- RNA מאומת על ידי qRT-PCR (שלבים 5 ו -6). לאחר טיפול RNase וריכוז חלבון (שלב 7), איכות החלבון נשלטת על ידי SDS polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה (SDS-PAGE) ואת מכתים כסף (שלב 8). ההבדל בין דפוסי הלהקה חלבון יכול בקלות להיות דמיינו בין מדגם crosslinked (CL) ומדגם לא crosslinked (לא CL;מדגם השליטה השלילי מ protoplasts כי אינו חשוף קרינה UV). זיהוי החלבונים מושגת באמצעות proteomics MS מבוססי. החלבונים מן המדגם CL מופרדים על ידי חד מימדי polyacrylamide ג&#39;ל אלקטרופורזה (1D-PAGE) כדי להסיר זיהום רקע אפשרי, הם &quot;בתוך ג &#39;ל מתעכל&quot; לתוך פפטידים קצרים באמצעות טריפסין, והם מטוהרים (שלב 9). ננו בשלב ההפוך כרומטוגרפיה נוזלית מצמידים ספקטרומטריית מסה (ננו LC-MS) מאפשר קביעת כמות של חלבונים סופי של פרוטאומה כבול mRNA (שלב 10). לבסוף, mRBPs מזוהים מאופיינים וקטלג באמצעות ניתוח ביואינפורמאטי (שלב 11).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 M Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1902-500G</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Art. 4935</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M MES (pH 5.7) 
			(4-morpholineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			MMg solution, 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>CELLULASE 
			&#8220;ONOZUKA&#8221; 
			R-10, 10 g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>MACEROZYME R-10, 10g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% (w/v) BSA 
			(Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Chem-Lab NV</td>
			<td>CL00.0317.1000</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td>W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiCl 
			(Lithium Chloride)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>199885000</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2 &#38; 
			Low salt buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% (w/v) LiDS 
			(Lithium Dodecyl Sulphate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4632-25G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M DTT 
			(Dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Wash buffer 2</td>
			<td>307866</td>
			<td>Lysis/binding buffer,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl))</td>
			<td>Acros &#38; 
			Fisher Chemical</td>
			<td>167620010 &#38; 
			H/1200/PB15</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>ED-500G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8.22184.0500</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M NaOH</td>
			<td>VWR PROLABO CHEMICALS</td>
			<td>28244.295</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (pH 7.4) 
			(Phosphate Buffered Saline) 
			containing 
			(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Chemical, MERCK, 
			Sigma-aldrich &#38; SAFC</td>
			<td>S/3160/60, 
			Art. 4935, 
			71640-250G &#38; 
			60230</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (2 &#956;g/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11789020</td>
			<td>Protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td>qRT-PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td>RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>322415</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>537020</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NH4HCO3 
			(Ammonium bicarbonate) 
			&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td>Gel hydration &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH3CN 
			(Acetonitrile)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>34851-100ML</td>
			<td>Gel dehydration &#38; 
			Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA 
			(Iodoacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I4386-10G</td>
			<td>Alkylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA 
			(Trifluoroacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>302031-10X1ML</td>
			<td>Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA 
			(Formic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>06554-5G</td>
			<td>Peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution (6 ng/&#956;L)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>Peltracom</td>
			<td>LP2D</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite 3</td>
			<td>Sibli AS</td>
			<td>05VERMICULIET</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150 x 20 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE2M229104</td>
			<td>Homogenization of final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T585</td>
			<td>Rosette leaf strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-75 &#956;m nylon mesh</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>74010</td>
			<td>Protoplast suspension filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL round bottom tubes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1918-10EA</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer 
			(B&#252;rker hemocytometer)</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td>Protoplast cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinking apparatus 
			(HL-2000 HybriLinker)</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>UVP95003101</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp 
			(Sankyo-Denki G8T5)</td>
			<td>SANKYO 
			DENKI</td>
			<td>SD G8T5</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL glass syringe</td>
			<td>FORTUNA Optima</td>
			<td>Z314560</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow needle (0.9 x 25 mm)</td>
			<td>Becton Dickinson microlance 3</td>
			<td>2021-04</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Model L26</td>
			<td>Labinco BV</td>
			<td>26110912</td>
			<td>Sample incubation by rotating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-d(T)25 magnetic beads 
			(5 mg/mL)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1419S</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units 
			(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>mRBP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td>Silver-staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit 
			(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)</td>
			<td>STRATEC Molecular</td>
			<td>1064100300</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR cycler 
			(StepOne Real-Time PCR cycler)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>cDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-C18 columns 
			(Millipore Zip Tip &#181;-C18 columns)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>720046-960EA</td>
			<td>Peptide purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer 
			(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column 
			(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES800</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 precolumn 
			(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for qRT-PCR assay</td>
			<td colspan="3">Sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBQ10 mRNA 
			(Li et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG 
			Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S rRNA 
			(Durut et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG 
			Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mrna interactome capture from plant protoplasts

RNA מחייב חלבונים (RBPs) לקבוע את גורלם של RNAs. הם משתתפים בכל המסלולים ביוגנזה רנ&quot;א ובמיוחד לתרום שלאחר תקנת גנים תקנה (PTGR) של RNAs השליח (mRNAs). בשנים האחרונות, מספר mRNA-proteomes כבול מן השמרים שורות תאים יונקים היו מבודדים בהצלחה באמצעות שיטה חדשנית בשם &quot;mRNA אינטראקציה ללכוד&quot;, המאפשר זיהוי של mRNA מחייב חלבונים (mRBPs) ישירות מתוך סביבה פיזיולוגית. השיטה מורכבת מ - vivo אולטרה סגול (UV) crosslinking, משוך מטה וטיהור של מסנג &#39;ר ribonucleoprotein קומפלקסים (mRNPs) על ידי חרוזים אוליגו (DT), ואת זיהוי שלאחר מכן של חלבונים crosslinked על ידי ספקטרומטריית מסה (MS). לאחרונה, על ידי יישום שיטה זהה, כמה צמחים mRNA כבול חלבונים דווחו בו זמנית ממקורות רקמה שונים ארבידופסיס : שתילים etiolated, רקמת עלה,עלה prooplasts mesophyll, ותאי שורש תרבותי. כאן, אנו מציגים את אופטימיזציה mRNA אינטראקציה ללכוד שיטת ארבידופסיס thaliana protoplasts mesophyll עלה, סוג התא המשמש כלי רב תכליתי עבור ניסויים הכוללים מבחני הסלולר השונים. התנאים התשואה חלבון אופטימלי כוללים את כמות הרקמות החל ואת משך קרינה UV. ב- mRNA-proteome שהתקבל בניסוי בקנה מידה בינוני (10 7 תאים), RBPs ציינו כי קיבולת ה- RNA מחייב נמצאו לייצג יתר על המידה, ורבים RBPs מזוהים זוהו. הניסוי יכול להיות scaled up (10 9 תאים), ואת השיטה אופטימיזציה ניתן להחיל על סוגי תאים צמחיים אחרים מינים כדי לבודד באופן רחב, קטלוג, ולהשוות proteomes mRNA- קשורה בצמחים.

ראינו הילה אופיינית, המקיפה את גלולה חרוז במדגם CL, לשטוף שלב 4.3 עם חיץ לשטוף 2 ( איור 1 ב ). למרות שזה לא נחקר, התופעה הזאת כנראה ניתן להסביר על ידי הפרעה של מתחמי mRNP crosslinked עם צבירה חרוז במהלך לכידת מגנטי, גרימת צבירה מפוזר יותר להיווצר. זה...

Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

כאן, אנו מציגים פרוטוקול האינטראקציה ללכוד להחיל על Arabopopsis thaliana עלה mesophyll protoplasts. שיטה זו מסתמכת באופן קריטי על vivo UV crosslinking ומאפשר בידוד וזיהוי של חלבונים mRNA מחייב הצמח מסביבה פיזיולוגית.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

לכידת חלבון זיקה מורכבת מ בתאי יונקי Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

עיצוב ניסיוני עבור לייזר Microdissection RNA-seq: לקחים מניתוח התפתחות תירס ליף

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

שיטה פשוטה הפיצול מופץ לניתוח מקיף של מטבוליטים, שומנים וחלבונים מדגם יחיד

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

בידוד, מדידות הנשימה של המיטוכונדריה מ תודרנית לבנה

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

ספקטרומטר מסה של ספריי עלה: טכניקה מהירה יינון אמביינט להעריך ישירות מטבוליטים רקמות הצמח

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

מיצוי קפאין, פעילות אנזימטיות, ביטוי גנים של קפאין סינתאז מ המתלים תא צמח

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

לומד חלבון לייבא לתוך מהכלורופלסט באמצעות Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

לכידת וזיהוי של RNA-מחייב חלבונים באמצעות לחץ בסיוע כימיה RNA-interactome ללכוד אסטרטגיה (CARIC)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Immunoprecipitation ללא תווית של זרימת עבודה בהיקפים גדולים של החברה ליצירת פרופיל רב-ממדי של Interactome גרעינית

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...