Name: mrna interactome capture from plant protoplasts
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00
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हम प्रोफेसर जोरीस वंडरिक्क्स की प्रयोगशाला को स्वीकार करते हैं, जिन्होंने पारंपरिक यूवी दीपक से लैस यूवी क्रॉसलिंकिंग उपकरण प्रदान किया था। केजी ल्यूवेन अनुसंधान फंड द्वारा समर्थित है और एफडब्ल्यूओ अनुदान G065713N से समर्थन स्वीकार करता है।

1. अरबिडोप्सिस लीफ मेसोफिल प्रोप्लेस्टास्ट अलगाव नोट: एयूबीडोपिस लीफ मेसोफिल प्रोटेप्लास्ट्स मूल रूप से अलग हैं जैसा कि यू एट अल ।, 2007 द्वारा वर्णित है, कई संशोधनों के साथ 40 ...

हमने सफलतापूर्वक एमआरएनए इंटरैक्टिम कैप्चर को लागू किया, जो कि खमीर और मानव कोशिकाओं के लिए विकसित किया गया था, पौधे पत्ती मेसोफिल प्रोटॉप्लेट्स। लीफ मेसोफिल कोशिका पौधे के पत्तों में प्रमुख प्रकार ?...

सेलुलर जैविक प्रक्रियाओं को बनाए रखने के लिए यूकेरियोट्स कई आरएनए जैवनेसिस नियामक रास्ते का उपयोग करते हैं। ज्ञात प्रकार के आरएनए में, एमआरएनए बहुत विविधतापूर्ण है और प्रोटीन की कोडिंग क्षमता और उनके आईसोफॉर्म 1 को लेता है। पीटीजीआर मार्ग पूर्व-एमआरएनए 2 , 3 के भाग्य को निर्देशित करता है। विभिन्न जीन परिवारों के आरबीपी आरएनए के नियमन को नियंत्रित करते हैं, और पीटीआरआर में, प्रत्यक्ष एमआरबीपीएस गाइड एमआरएनए प्रत्यक्ष शारीरिक बातचीत के माध्यम से, कार्यात्मक एमआरएनपी बनाने इसलिए, की पहचान करने और mRBPs की विशेषताओं और उनके mRNPs पिछले तीन दशकों .over सेलुलर mRNA चयापचय 2 के नियमन को समझने के लिए महत्वपूर्ण है, विभिन्न इन विट्रो तरीकों - आरएनए electrophoretic गतिशीलता पारी (REMSA) assays, घातीय संवर्धन संसाधनों द्वारा लाइगैंडों के व्यवस्थित विकास सहित (SELEX) लाइब्रेरी-व्युत्पन्न संरचनाओं, आरएनए बाइंड-एन-सैक (आरबीएनएस), रेडियोलैलेब्ड या मात्रात्मक पर आधारितप्रतिदीप्ति आरएनए बाध्यकारी assays, एक्सरे क्रिस्टलोग्राफी, और एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 - आरबीपी के अध्ययन के लिए व्यापक रूप से लागू किया गया है, मुख्य रूप से स्तनधारी कोशिकाओं से। स्तनधारी आरबीपी के इन अध्ययनों के परिणाम आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन डाटाबेस (आरबीपीडीबी) के माध्यम से खोजा जा सकते हैं, जो प्रकाशित टिप्पणियों 10 इकट्ठा करता है हालांकि इन इन विट्रो तरीकों में शक्तिशाली उपकरण हैं, वे अनुक्रमों के दिए गए आरएनए पूल से बाध्य आरएनए प्रारूपों का निर्धारण करते हैं और इसलिए उन्हें नए लक्ष्य आरएनए को खोजने की क्षमता में सीमित हैं। जीनोम चौड़ा आरबीपी की भविष्यवाणी करने के लिए कम्प्यूटेशनल रणनीतियों के लिए भी यही सच है, जो प्रोटीन अनुक्रम और संरचना 15 के संरक्षण पर आधारित हैं। इस पर काबू पाने के लिए, एक नया प्रयोगात्मक विधि हास्थापित किया गया है जो कि आरएनए के रूपांकनों की पहचान के लिए अनुमति देता है, जो कि आरबीपी की दिलचस्पी के साथ संपर्क करता है, साथ ही बाध्यकारी के सटीक स्थान के निर्धारण के लिए। &quot;क्रॉसलिंकिंग एंड इम्युनोपेरेग्रेशन&quot; (CLIP) नामक इस विधि को विवो यूवी क्रॉस्लिंकिंग में शामिल किया गया है, जिसके बाद इम्यूनोपेरेग्रेशन 11 प्रारंभिक अध्ययनों से पता चला है कि डीएनए और आरएनए न्यूक्लियोटाइड्स का फोटो एक्टिवेशन 245 एनएम से अधिक उत्तेजना यूवी तरंग दैर्ध्य पर हो सकता है। थिइमिडीन के माध्यम से प्रतिक्रिया को पसंद किया जा रहा है (कमी हुई फोटोरैक्टिविटी के क्रम में: डीटी ≥ डीसी&gt; आरयू&gt; आरसी, डीए, डीजी) 12 254 एनएम (यूवी-सी) की तरंग दैर्ध्य के साथ यूवी प्रकाश का उपयोग करना, यह पाया गया कि आरएनए न्यूक्लियोटाइड्स और प्रोटीन अवशेषों के बीच सहसंयोजक बंधन बनते हैं, जब केवल कुछ अंगस्ट्रम्स (ए) की सीमा में। इस घटना को आरएनए और आरबीपी की &quot;शून्य-लंबाई&quot; क्रॉस्लिंकिंग कहा जाता है। यह एक कड़े शुद्धि प्रक्रिया द्वारा पीछा किया जा सकता है<html> थोड़ा पृष्ठभूमि 13 , 14 के साथ सावधान। CLB के लिए पूरक एक रणनीति आरबीपी के परिदृश्य का वर्णन करने के लिए प्रोटीन की पहचान के साथ विवो यूवी क्रॉटलिंकिंग में संयोजित है। इस तरह के जीनोम चौड़ा एमआरएनए-बाध्य प्रोटीओम्स को खमीर कोशिकाओं, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) और मानव कोशिका लाइनों ( यानी, हेके 2 9 3 और हेला) से इस उपन्यास प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का उपयोग किया गया है, जिसे &quot;एमआरएनए इंटरैक्टिम कैप्चर&quot; कहा जाता है , 18 , 19 , 20 , 21 विधि vivo यूवी crosslinking में एमआरएनपी शुद्धि और एमएस आधारित प्रोटिओमिक्स के बाद से बना है। इस रणनीति को लागू करने से, कई उपन्यास &quot;चाँदनीकरण&quot; वाले आरबीपी जिनमें गैर-कैनोनिकल आरबीडी शामिल हैं, और यह स्पष्ट हो गया है कि अधिक प्रोटीन को आरएएन-बाध्यकारी क्षमता में पहले से माना जाता है&quot;&gt; 15 , 16 , 17. इस पद्धति का उपयोग आरबीपी की जांच करते समय नए अनुप्रयोगों और नए जैविक सवालों के जवाब देने की क्षमता के लिए देता है। उदाहरण के लिए, हाल ही के एक अध्ययन में एमआरएनए-बाईड प्रोटेम (कोर आरबीपी प्रोटीम) खमीर और मानव कोशिकाओं के बीच 22 संयंत्र आरबीपी पहले से ही विकास और विकास ( जैसे , फूलों के समय के बाद ट्रांसक्रिप्शनल नियमन में, सर्कडियन घड़ी, और मिटोकोंड्रिया और क्लोरोप्लास्ट में जीन की अभिव्यक्ति) में शामिल पाया गया है 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 । इसके अलावा, वे सेल्युलर प्रक्रियाओं में अबायटीक तनाव ( जैसे, ठंड, सूखा, साललिता, और फरसीक एसिड (एबीए)) 31 , 32 , 33 , 34 आरएएनए मान्यता मोटीफ (आरआरएम) और के समरूपता (केएच) डोमेन अनुक्रम रूपांकनों पर आधारित अरबीडॉप्सिस थेलियाना जीनोम में 200 से अधिक पूर्वानुमानित आरबीपी जीन हैं; चावल में, लगभग 250 को नोट किया गया 35 , 36 यह उल्लेखनीय है कि कई भविष्यवाणियां आरबीपी पौधों के लिए अद्वितीय लगती हैं ( उदाहरण के लिए आरआरएम डोमेन वाले 50% पूर्वानुमानित अरबिडोप्सिस आरबीपी के लिए मेटाजोन ऑर्थोलॉजीज नहीं) 35 , यह सुझाव देते हुए कि कई नए फ़ंक्शन बना सकते हैं सबसे अनुमानित आरबीपी के कार्यों में 23 वर्णों का अभाव है। अरबीपोप्सिस से युक्त बीआरएनए-बाध्य प्रोटीओमों का अलगाव, पर्ण ऊतक, सुसंस्कृत जड़ कोशिकाओं, और पत्ती मेसोफिल प्रोटॉप्लेट्स के उपयोग के माध्यम सेएमआरएनए इंटरैक्टिम कैप्चर हाल ही में 38 , 39 की सूचना मिली है। ये अध्ययन निकट भविष्य में पौधों में कार्यात्मक आरबीपी व्यवस्थित रूप से सूचीबद्ध करने की मजबूत क्षमता का प्रदर्शन करते हैं। यहां, हम पौधे के प्रोटॉप्लेट्स से एमआरएनए इंटरैक्टिम कैप्चर के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं ( यानी सेल की दीवारों के बिना कोशिकाएं)। अरबिडोप्सिस थलियाना लीफ मेसोफिल प्रोटॉप्लेट्स लीफ सेल का मुख्य प्रकार है। पृथक प्रोटॉप्लास्ट्स कोशिकाओं को यूवी प्रकाश की इष्टतम पहुंच प्रदान करते हैं। इस सेल प्रकार का उपयोग एनासन में किया जा सकता है जो कि क्रियाशील लक्षण वर्णन 40 , 41 के लिए ट्रांजिस्टर प्रोटीन व्यक्त करता है। इसके अलावा, कई अन्य वनस्पति कोशिका प्रकारों और प्रजातियों 42 , 43 , 44 ( उदाहरण के लिए, पीटरसन एट अल ।, 200 9, बर्गमैन और बिरनबाम, 2010 और हांग एट अल ।, 2012) के लिए प्रोटोप्पन लागू किया गया है। &lt;P वर्ग = &quot;jove_content&quot;&gt; इस पद्धति में कुल 11 चरणों ( चित्रा 1 ए ) शामिल हैं। अरबिडोप्सिस लीफ मेसोफिल प्रोटॉप्लेट्स पहले पृथक (चरण 1) हैं और बाद में यूवी को क्रॉस्लेन्क्ड एमआरएनपी (चरण 2) बनाने के लिए विकिरण किया गया है। जब प्रोटोप्लास्ट्स को झुकाने वाली स्थिति (चरण 3) के तहत लिपिक किया जाता है, तो क्रॉस्लेन्क्क्ड एमआरएनपी को लिसन / बाइंडिंग बफर में रिलीज़ किया जाता है और ओलिगो-डी (टी) 25 मोती (चरण 4) से नीचे खींच लिया जाता है। कठोर washes के कई दौर के बाद, एमआरएनपी शुद्ध कर रहे हैं और आगे का विश्लेषण किया। एमआरबीपी के विकृत पेप्टाइड्स को प्रोटीनेस के द्वारा पचाने से पहले क्रॉर्लिंक किए गए एमआरएनए शुद्ध होते हैं और आरआरए की गुणवत्ता QRT-PCR (चरण 5 और 6) द्वारा सत्यापित की जाती है। आरएनज उपचार और प्रोटीन एकाग्रता (चरण 7) के बाद, प्रोटीन की गुणवत्ता को एसडीएस पॉलीएक्लाइमाइड जेल वैद्युतोसोरिसिस (एसडीएस पृष्ठ) और चांदी की धुंधला (चरण 8) द्वारा नियंत्रित किया जाता है। प्रोटीन बैंड पैटर्न में अंतर आसानी से एक क्रॉस-लिंक्ड नमूना (सीएल) और एक गैर-क्रॉस्लेन्क्स्क्ड नमूना (गैर-सीएल;प्रोटॉप्लेट्स से नकारात्मक नियंत्रण नमूना जो कि यूवी विकिरण के अधीन नहीं है)। प्रोटीन की पहचान एमएस आधारित प्रोटिओमिक्स के माध्यम से प्राप्त की जाती है। सीएल के नमूने से प्रोटीन एक-आयामी polyacrylamide जेल वैद्युतकणसंचलन (1 डी पृष्ठ) से संभव पृष्ठभूमि प्रदूषण को दूर करने के लिए अलग-अलग पेप्टाइड्स में ट्रिप्सिन का उपयोग कर &quot;इन-जेल पचास्ट&quot; होते हैं, और शुद्ध (चरण 9) हैं। माइन स्पेक्ट्रोमेट्री (नैनो-एलसी-एमएस) के साथ मिलकर नैनो रिवर्स-चरण तरल क्रोमैटोग्राफी, एमआरएनए-बाईड प्रोटीम (चरण 10) में निश्चित प्रोटीन की मात्रा के निर्धारण के लिए अनुमति देता है। अंत में, पहचान की गई एमआरबीपी को जैवइन्फोर्मेटिक विश्लेषण (चरण 11) का उपयोग करके वर्णित किया गया है।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 M Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1902-500G</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Art. 4935</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M MES (pH 5.7) 
			(4-morpholineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			MMg solution, 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>CELLULASE 
			&#8220;ONOZUKA&#8221; 
			R-10, 10 g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>MACEROZYME R-10, 10g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% (w/v) BSA 
			(Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Chem-Lab NV</td>
			<td>CL00.0317.1000</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td>W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiCl 
			(Lithium Chloride)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>199885000</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2 &#38; 
			Low salt buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% (w/v) LiDS 
			(Lithium Dodecyl Sulphate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4632-25G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M DTT 
			(Dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Wash buffer 2</td>
			<td>307866</td>
			<td>Lysis/binding buffer,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl))</td>
			<td>Acros &#38; 
			Fisher Chemical</td>
			<td>167620010 &#38; 
			H/1200/PB15</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>ED-500G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8.22184.0500</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M NaOH</td>
			<td>VWR PROLABO CHEMICALS</td>
			<td>28244.295</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (pH 7.4) 
			(Phosphate Buffered Saline) 
			containing 
			(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Chemical, MERCK, 
			Sigma-aldrich &#38; SAFC</td>
			<td>S/3160/60, 
			Art. 4935, 
			71640-250G &#38; 
			60230</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (2 &#956;g/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11789020</td>
			<td>Protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td>qRT-PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td>RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>322415</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>537020</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NH4HCO3 
			(Ammonium bicarbonate) 
			&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td>Gel hydration &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH3CN 
			(Acetonitrile)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>34851-100ML</td>
			<td>Gel dehydration &#38; 
			Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA 
			(Iodoacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I4386-10G</td>
			<td>Alkylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA 
			(Trifluoroacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>302031-10X1ML</td>
			<td>Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA 
			(Formic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>06554-5G</td>
			<td>Peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution (6 ng/&#956;L)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>Peltracom</td>
			<td>LP2D</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite 3</td>
			<td>Sibli AS</td>
			<td>05VERMICULIET</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150 x 20 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE2M229104</td>
			<td>Homogenization of final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T585</td>
			<td>Rosette leaf strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-75 &#956;m nylon mesh</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>74010</td>
			<td>Protoplast suspension filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL round bottom tubes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1918-10EA</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer 
			(B&#252;rker hemocytometer)</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td>Protoplast cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinking apparatus 
			(HL-2000 HybriLinker)</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>UVP95003101</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp 
			(Sankyo-Denki G8T5)</td>
			<td>SANKYO 
			DENKI</td>
			<td>SD G8T5</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL glass syringe</td>
			<td>FORTUNA Optima</td>
			<td>Z314560</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow needle (0.9 x 25 mm)</td>
			<td>Becton Dickinson microlance 3</td>
			<td>2021-04</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Model L26</td>
			<td>Labinco BV</td>
			<td>26110912</td>
			<td>Sample incubation by rotating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-d(T)25 magnetic beads 
			(5 mg/mL)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1419S</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units 
			(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>mRBP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td>Silver-staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit 
			(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)</td>
			<td>STRATEC Molecular</td>
			<td>1064100300</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR cycler 
			(StepOne Real-Time PCR cycler)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>cDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-C18 columns 
			(Millipore Zip Tip &#181;-C18 columns)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>720046-960EA</td>
			<td>Peptide purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer 
			(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column 
			(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES800</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 precolumn 
			(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for qRT-PCR assay</td>
			<td colspan="3">Sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBQ10 mRNA 
			(Li et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG 
			Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S rRNA 
			(Durut et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG 
			Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mrna interactome capture from plant protoplasts

आरएनए बाध्यकारी प्रोटीन (आरबीपी) आरएनए के भाग्य का निर्धारण करते हैं। वे सभी आरएनए जैवनेसिस रास्ते में भाग लेते हैं और विशेष रूप से मैसेंजर आरएनए (एमआरएनए) के पोस्ट ट्रांसक्रिप्शनल जीन विनियमन (पीटीआरआर) में योगदान करते हैं। पिछले कुछ सालों में, खमीर और स्तनधारी सेल लाइनों से कई एमआरएनए-बाध्य प्रोटीओम को &quot;एमआरएनए इंटरैक्टिम कैप्चर&quot; नामक एक उपन्यास विधि के उपयोग से सफलतापूर्वक अलग किया गया है, जो एमआरएनए बाध्यकारी प्रोटीन (एमआरबीपी) की पहचान के लिए अनुमति देता है सीधे एक शारीरिक पर्यावरण से विधि ओलिगो (डीटी) मोती द्वारा विवो अल्ट्रावियोलेट (यूवी) क्रॉस लिंकींग, पुल डाउन और मैसेंजर रिबन्यूक्लोप्रोटीन कॉम्प्लेक्स (एमआरएनपी) की शुद्धि में बनायी गयी है, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) द्वारा क्रॉस्लेन्क्क्ड प्रोटीन की बाद की पहचान। बहुत हाल ही में, एक ही विधि लागू करने से, कई पौधे एमआरएनए-बाध्य प्रोट्योम को विभिन्न अरबिडोप्सिस ऊतक स्रोतों से एक साथ सूचित किया गया है: एटिलाटेड रोपाई, पत्ती के ऊतक,पत्ती मेसोफिल प्रोटॉप्लेट्स, और सुसंस्कृत रूट कोशिकाएं। यहां, हम अरबीडोपिस थेलियाना पत्ती मेसोफिल प्रोटॉप्लेट्स के लिए अनुकूलित मॉरेनेट इंटरैक्टिम कैप्चर विधि पेश करते हैं, एक सेल प्रकार जो प्रयोगों के लिए बहुमुखी उपकरण के रूप में कार्य करता है जिसमें विभिन्न सेलुलर एशेज शामिल हैं। इष्टतम प्रोटीन उपज के लिए स्थितियों में ऊतक शुरू करने की मात्रा और यूवी विकिरण की अवधि शामिल है। एक माध्यम-स्तरीय प्रयोग (10 7 कोशिकाओं) से प्राप्त एमआरएनए-बाध्य प्रोटीम में, आरबीपी ने आरएनए बाध्यकारी क्षमता को अधिक से अधिक प्रतिनिधित्व किया है, और कई उपन्यास आरबीपी की पहचान की गई थी। प्रयोग को बढ़ाया जा सकता है (10 9 कोशिका), और पौधों में एमआरएनए-बाध्य प्रोटीयोम को मोटे तौर पर अलग, कैटलॉग और तुलना करने के लिए अन्य पौधों के प्रकार और प्रजातियों के लिए अनुकूलित विधि लागू की जा सकती है।

हमने एक विशेषता हेलो, जो कि सैल नमूने में मनका गोली से चारों ओर, वॉश बफर 2 ( चित्रा 1 बी ) के साथ धोने के चरण 4.3 में देखा। यद्यपि इसकी जांच नहीं हुई है, इस घटना को संभवतः चुंबकीय कैप्चर क?...

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mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

यहां, हम अरबिडोप्सिस थलियाना के पत्थरों मेसोफिल प्रोटॉप्लेट्स के लिए एक इंटरैक्टिम कैप्चर प्रोटोकॉल पेश करते हैं। यह विधि गंभीर रूप से विवो यूवी क्रॉटलिंकिंग में निर्भर करती है और एक शारीरिक वातावरण से संयंत्र एमआरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन की अलगाव और पहचान की अनुमति देती है।

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Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

लेजर Microdissection शाही सेना seq के लिए प्रायोगिक डिजाइन: मक्का पत्तियों के विकास के एक विश्लेषण से सबक

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

एक नमूना से मेटाबोलाइट्स, लिपिड्स और प्रोटीन्स के व्यापक विश्लेषण के लिए एक सरल भिन्नात्मक निष्कर्षण विधि

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

अलगाव और Arabidopsis थालियाना से Mitochondria की श्वसन माप

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

पत्ती स्प्रे मास स्पेक्ट्रोमेट्री: एक तेजी से परिवेश Ionization तकनीक सीधे संयंत्र के ऊतकों से चयापचयों का आकलन करने के लिए

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

कैफीन निष्कर्षण, एंजाइमी गतिविधि और संयंत्र सेल सस्पेंशन से कैफीन सिंथेस की जीन अभिव्यक्ति

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Protoplasts का उपयोग Chloroplasts में प्रोटीन आयात का अध्ययन

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

पर कब्जा और क्लिक करें रसायन-सहायता प्राप्त आरएनए-interactome कैप्चर (CARIC) रणनीति का उपयोग करके आरएनए बाइंडिंग प्रोटीन की पहचान

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

एक मिलीसेकंड समय स्केल पर प्रोटीन परिसरों की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विट्रो प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण में उपयोग करना

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

बड़े पैमाने पर परमाणु इंटरैक्टूम प्रोफाइलिंग के लिए लेबल-फ्री इम्यूनोप्रिसिप्रिशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री वर्कफ्लो

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...