Name: mrna interactome capture from plant protoplasts
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

Riconosciamo il laboratorio del Prof. Joris Winderickx, che ha fornito l&#39;apparecchio di reticolazione UV equipaggiato con la lampada UV convenzionale. KG è supportato dal fondo di ricerca KU Leuven e riconosce il sostegno della sovvenzione FWO G065713N.

1. Arabidopsis Leaf Mesophyll Protoplast Isolamento NOTA: I protoplasti della mesopilita delle foglie Arabidopsis sono essenzialmente isolati come descritto da Yoo et al ., 2007, con diverse modifiche 40 . <ol><li> Crescita delle piante <ol><li> Immergere circa 200 Arabidopsis thaliana Col-0 semi di ecotipo in acqua sterilizzata per 2 giorni a 4 ° C nell&#39;oscurità per la stratificazione. NOTA: Questo n...

Abbiamo applicato con successo la cattura di interazione di mRNA, sviluppata per le cellule di lievito e umano, per protoplasti di mesofila a foglia vegetale. Le cellule mezofiliche dei fogli sono il principale tipo di tessuto a base di foglie vegetali. Il principale vantaggio di questo metodo è che utilizza in-vivo incrociando per scoprire le proteine ​​da un ambiente fisiologico. In questo protocollo, abbiamo principalmente presentiamo una serie di condizioni sperimentali ott...

Gli eukarioti utilizzano percorsi di regolazione della biogenesi multipla di RNA per mantenere i processi biologici cellulari. Tra i tipi noti di RNA, l&#39;mRNA è molto diversificato e porta la capacità di codifica delle proteine ​​e delle loro isoforme. 1. Il percorso PTGR indirizza le sorti dei pre-mRNA 2 , 3 . I RBP di diverse famiglie geniche controllano la regolazione dell&#39;RNA, e in PTGR, mRBP specifici guidano mRNA attraverso interazioni fisiche dirette, formando mRNP funzionali. Di conseguenza, l&#39;identificazione e la caratterizzazione dei mRBPs e dei loro mRNPs è fondamentale per la comprensione della regolazione del metabolismo cellulare mRNA 2. Negli ultimi tre decenni, i vari metodi in vitro , inclusi i REMSA (REMSA), l&#39;evoluzione sistematica dei ligandi mediante esami di arricchimento esponenziale (SELEX) basato su costruzioni derivate dalla biblioteca, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radiomarcato o quantitativoI campioni di RNA di fluorescenza, la cristallografia a raggi X e la spettroscopia NMR 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 sono stati ampiamente applicati agli studi di RBP, principalmente da cellule di mammiferi. I risultati di questi studi su RBP mammiferi possono essere ricercati tramite la RNA-binding Protein DataBase (RBPDB), che raccoglie le osservazioni pubblicate 10 . Anche se questi approcci in vitro sono strumenti potenti, determinano i motivi di RNA vincolati da un dato pool di sequenze di RNA e quindi sono limitate nella loro capacità di scoprire nuovi target RNA. Lo stesso vale per le strategie di calcolo per prevedere RBP a livello genomico, che si basano sulla conservazione della sequenza e della struttura proteica 15 . Per superare questo, un nuovo metodo sperimentale haÈ stato stabilito che consente l&#39;identificazione dei motivi RNA che interviene un RBP di interesse, nonché per la determinazione della posizione precisa di legame. Questo metodo, chiamato &quot;crosslinking e immunoprecipitazione&quot; (CLIP), è composto da in-vivo reticolazione UV seguito da immunoprecipitazione 11 . Studi iniziali hanno dimostrato che la fotoattivazione di nucleotidi di DNA e RNA può verificarsi a lunghezze d&#39;onda UV di eccitazione maggiore di 245 nm. La reazione attraverso la timidina sembra essere favorita (rango in ordine di diminuzione della fotoreattività: dT ≥ dC&gt; rU&gt; rC, dA, dG) 12 . Utilizzando la luce UV con una lunghezza d&#39;onda di 254 nm (UV-C), è stato osservato che i legami covalenti tra nucleotidi RNA e residui di proteine ​​sono creati quando nell&#39;ambito di pochi Angstroms (Å). Il fenomeno è dunque chiamato &quot;crosslinking&quot; a zero lunghezza di RNA e RBP. Questo può essere seguito da una procedura di purificazione rigorosa<html> Dura con poco sfondo 13 , 14 . Una strategia complementare al CLIP è quella di combinare in vivo la reticolazione UV con l&#39;identificazione delle proteine ​​per descrivere il paesaggio dei RBP. Un certo numero di tali proteomi legati al mRNA a livello genomico sono stati isolati da cellule staminali embrionali (ESCs) e linee cellulari umane ( cioè HEK293 e HeLa) utilizzando questo nuovo approccio sperimentale, chiamato &quot;capture intercommunicazione mRNA&quot; 18 , 19 , 20 , 21 . Il metodo è composto da in-vivo reticolazione UV seguita da purificazione mRNP e proteomica basata su MS. Applicando questa strategia, sono stati scoperti molti nuovi RBP &quot;moonlighting&quot; contenenti RBD non canonici, e è risultato chiaro che più proteine ​​hanno capacità di legame RNA rispetto a quanto precedentemente supposto&quot;&gt; 15 , 16 , 17. L&#39;uso di questo metodo consente di nuove applicazioni e di capacità di rispondere a nuove domande biologiche durante l&#39;analisi di RBP. Ad esempio, uno studio recente ha indagato sulla conservazione del proteome legato all&#39;RNA (il nucleo RBP Proteome) tra il lievito e le cellule umane 22 . I RBP vegetali sono già stati trovati coinvolti nella crescita e nello sviluppo ( ad esempio nella regolazione post-trascrizionale del tempo di fioritura, dell&#39;orologio circadiano e dell&#39;espressione genica in mitocondri e cloroplasti) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . Inoltre, si pensa di svolgere funzioni nei processi cellulari che rispondono a sollecitazioni abiotiche ( ad esempio, freddo, siccità, sLinità e acido abscisico (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . Ci sono più di 200 geni RBP previsti nel genoma Arabidopsis thaliana , basato su motivi di sequenza di dominio RNA (RRM) e K homology (KH); Nel riso, circa 250 sono stati notati 35 , 36 . È notevole che molti RBP previsti sembrano essere unici per le piante ( ad esempio, nessun ortologo metazoico a circa il 50% dei RBP di Arabidopsis previsti contenenti un dominio RRM) 35 , suggerendo che molti potrebbero servire nuove funzioni. Le funzioni dei RBP più previste rimangono inarcabili 23 . L&#39;isolamento dei proteomi legati al mRNA da Arabidopsis piantine etiolate, tessuti a foglia, cellule radicate coltivate e protoplasti di mezofosina di foglie attraverso l&#39;uso diRecentemente è stata segnalata la cattura di interagenti mRNA 38 , 39 . Questi studi dimostrano il forte potenziale di catalogare sistematicamente i RBP funzionali nelle piante nel prossimo futuro. Qui presentiamo un protocollo per la cattura di intero mRNA da protoplasti vegetali ( cioè cellule senza pareti cellulari). I protoplasti di mezophyll delle foglie Arabidopsis thaliana sono il tipo principale di cellule di foglie. I protoplasti isolati consentono l&#39;accesso ottimale della luce UV alle cellule. Questo tipo di cellula può essere utilizzato in saggi che esprimono transitoriamente proteine ​​per la caratterizzazione funzionale 40 , 41 . Inoltre, la protoplastica è stata applicata a diversi altri tipi di cellule vegetali e specie 42 , 43 , 44 ( es. Petersson et al ., 2009; Bargmann e Birnbaum, 2010; Hong et al ., 2012). &lt;P class = &quot;jove_content&quot;&gt; Il metodo comprende un totale di 11 passaggi ( Figura 1A ). I protoplasti di mezophyll a foglia Arabidopsis vengono prima isolati (fase 1) e successivamente irradiati UV per formare mRNPs reticolati (fase 2). Quando i protoplasti vengono lisati in condizioni di denaturazione (fase 3), i mRNP reticolati vengono rilasciati in tampone di lisi / legame e tirati da oligo-d (T) 25 brani (fase 4). Dopo diversi cicli di lavaggi rigorosi, i mRNPs vengono purificati e analizzati ulteriormente. I peptidi denaturati di mRBPs vengono digeriti mediante proteinasi K prima che i mRNA reticolati siano purificati e la qualità RNA è verificata da qRT-PCR (passaggi 5 e 6). Dopo la terapia con RNase e la concentrazione di proteine ​​(fase 7), la qualità della proteina è controllata mediante elettroforesi in poliacrilammide SDS (SDS-PAGE) e colorazione in argento (fase 8). La differenza di pattern di banda proteica può essere facilmente visualizzata tra un campione reticolato (CL) e un campione non reticolato (non CL;Il campione di controllo negativo da protoplasti che non è sottoposto ad irraggiamento UV). L&#39;identificazione delle proteine ​​è ottenuta tramite proteomica basata su MS. Le proteine ​​del campione CL sono separate da un&#39;elettroforesi a gel di poliacrilammide (1D-PAGE) unidimensionale per rimuovere eventuali contaminazioni di fondo, sono &quot;in-gel digerite&quot; in peptidi corti utilizzando la tripsina e vengono purificati (fase 9). La cromatografia liquida a fase inversa di fase nano accoppiata alla spettrometria di massa (nano-LC-MS) permette di determinare la quantità di proteine ​​definitive nel proteome legato al mRNA (fase 10). Infine, i mRBP identificati sono caratterizzati e catalogati utilizzando analisi bioinformatica (fase 11).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 M Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1902-500G</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Art. 4935</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M MES (pH 5.7) 
			(4-morpholineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			MMg solution, 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>CELLULASE 
			&#8220;ONOZUKA&#8221; 
			R-10, 10 g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>MACEROZYME R-10, 10g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% (w/v) BSA 
			(Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Chem-Lab NV</td>
			<td>CL00.0317.1000</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td>W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiCl 
			(Lithium Chloride)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>199885000</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2 &#38; 
			Low salt buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% (w/v) LiDS 
			(Lithium Dodecyl Sulphate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4632-25G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M DTT 
			(Dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Wash buffer 2</td>
			<td>307866</td>
			<td>Lysis/binding buffer,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl))</td>
			<td>Acros &#38; 
			Fisher Chemical</td>
			<td>167620010 &#38; 
			H/1200/PB15</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>ED-500G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8.22184.0500</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M NaOH</td>
			<td>VWR PROLABO CHEMICALS</td>
			<td>28244.295</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (pH 7.4) 
			(Phosphate Buffered Saline) 
			containing 
			(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Chemical, MERCK, 
			Sigma-aldrich &#38; SAFC</td>
			<td>S/3160/60, 
			Art. 4935, 
			71640-250G &#38; 
			60230</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (2 &#956;g/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11789020</td>
			<td>Protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td>qRT-PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td>RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>322415</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>537020</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NH4HCO3 
			(Ammonium bicarbonate) 
			&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td>Gel hydration &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH3CN 
			(Acetonitrile)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>34851-100ML</td>
			<td>Gel dehydration &#38; 
			Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA 
			(Iodoacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I4386-10G</td>
			<td>Alkylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA 
			(Trifluoroacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>302031-10X1ML</td>
			<td>Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA 
			(Formic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>06554-5G</td>
			<td>Peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution (6 ng/&#956;L)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>Peltracom</td>
			<td>LP2D</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite 3</td>
			<td>Sibli AS</td>
			<td>05VERMICULIET</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150 x 20 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE2M229104</td>
			<td>Homogenization of final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T585</td>
			<td>Rosette leaf strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-75 &#956;m nylon mesh</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>74010</td>
			<td>Protoplast suspension filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL round bottom tubes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1918-10EA</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer 
			(B&#252;rker hemocytometer)</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td>Protoplast cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinking apparatus 
			(HL-2000 HybriLinker)</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>UVP95003101</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp 
			(Sankyo-Denki G8T5)</td>
			<td>SANKYO 
			DENKI</td>
			<td>SD G8T5</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL glass syringe</td>
			<td>FORTUNA Optima</td>
			<td>Z314560</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow needle (0.9 x 25 mm)</td>
			<td>Becton Dickinson microlance 3</td>
			<td>2021-04</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Model L26</td>
			<td>Labinco BV</td>
			<td>26110912</td>
			<td>Sample incubation by rotating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-d(T)25 magnetic beads 
			(5 mg/mL)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1419S</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units 
			(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>mRBP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td>Silver-staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit 
			(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)</td>
			<td>STRATEC Molecular</td>
			<td>1064100300</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR cycler 
			(StepOne Real-Time PCR cycler)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>cDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-C18 columns 
			(Millipore Zip Tip &#181;-C18 columns)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>720046-960EA</td>
			<td>Peptide purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer 
			(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column 
			(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES800</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 precolumn 
			(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for qRT-PCR assay</td>
			<td colspan="3">Sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBQ10 mRNA 
			(Li et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG 
			Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S rRNA 
			(Durut et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG 
			Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mrna interactome capture from plant protoplasts

Le proteine ​​legate all&#39;RNA (RBPs) determinano le sorti degli RNA. Essi partecipano a tutte le vie di biogenesi dell&#39;RNA e contribuiscono in particolare alla regolazione del gene post-trascrizionale (PTGR) di messaggeri RNA (mRNA). Negli ultimi anni, un certo numero di proteomi legati al mRNA da linee di cellule di lieviti e mammiferi sono stati isolati con l&#39;utilizzo di un nuovo metodo chiamato &quot;capture di intercommunicazione mRNA&quot;, che consente l&#39;identificazione di proteine ​​legate alla mRNA (mRBPs) Direttamente da un ambiente fisiologico. Il metodo è composto da in-vivo ultravioletto (UV) reticolazione, abbattimento e purificazione di complessi ribonucleoproteine ​​messicani (mRNPs) da brani oligo (dT) e successiva identificazione delle proteine ​​reticolate mediante spettrometria di massa (MS). Molto recentemente, applicando lo stesso metodo, sono stati riportati simultaneamente diversi proteomi legati al mRNA vegetale provenienti da diverse origini tessutali di Arabidopsis : piantine etiolate, tessuti fogliari,Protoplasse della mesofila della foglia e cellule radicate coltivate. Qui presentiamo il metodo ottimizzato per la cattura di interoomi di mRNA per i protoplasti di mezophyll a foglia Arabidopsis thaliana , un tipo di cellule che serve come uno strumento versatile per esperimenti che comprendono diversi dosaggi cellulari. Le condizioni per la resa proteica ottimale includono la quantità di tessuto di partenza e la durata dell&#39;irradiazione UV. Nel proteome legato al mRNA ottenuto da un esperimento di media scala (10 7 cellule), i RBP notati per avere capacità di legame di RNA sono stati sovrapresentati e sono stati identificati molti nuovi RBP. L&#39;esperimento può essere scalato (10 9 cellule) e il metodo ottimizzato può essere applicato ad altri tipi di cellule vegetali e specie per isolare, catalogare e confrontare generalmente proteomi legati alle mRNA nelle piante.

Abbiamo osservato un aureo caratteristico che circonda il pellet di perle nel campione CL, nel punto di lavaggio 4.3 con il tampone di lavaggio 2 ( figura 1B ). Anche se non è stato studiato, questo fenomeno può probabilmente essere spiegato dall&#39;interferenza dei complessi mRNP reticolati con l&#39;aggregazione del branco durante la cattura magnetica, causando un aggregato più diffuso. Indica che la cattura di bead di oligo-d (T) 25 è stat...

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mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Qui presentiamo un protocollo di cattura di interazione applicato ai protoplasti a foglia di Arabidopsis thaliana . Questo metodo si basa fondamentalmente sulla creazione di reticolazione UV in vivo e consente l&#39;isolamento e l&#39;identificazione delle proteine ​​legate alla mRNA da un ambiente fisiologico.

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