Name: mrna interactome capture from plant protoplasts
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

Vi anerkjenner laboratoriet av prof. Joris Winderickx, som ga UV-tverrbindingsapparatet utstyrt med den konvensjonelle UV-lampen. KG støttes av KU Leuvens forskningsfond og anerkjenner støtte fra FWO-stipend G065713N.

1. Arabidopsis Leaf Mesophyll Protoplast Isolasjon MERK: Arabidopsis leaf mesophyll protoplaster er i det vesentlige isolert som beskrevet av Yoo et al ., 2007, med flere modifikasjoner 40 . <ol><li> Vekst av planter <ol><li> Soak ca 200 Arabidopsis thaliana Col-0 økotype frø i sterilisert vann i 2 dager ved 4 ° C i mørket for stratifisering. MERK: Dette antallet frø er nok for en ikke-CL-prøve og en ...

Vi har med suksess anvendt mRNA interactome capture, utviklet for gjær og humane celler, til planteblad mesofyll protoplaster. Blad mesofyllceller er den viktigste typen bakkevev i plantebladene. Den største fordelen med denne metoden er at den bruker in vivo tverrbinding for å oppdage proteiner fra et fysiologisk miljø. I denne protokollen presenterer vi hovedsakelig en rekke optimerte eksperimentelle forhold ( f.eks. Antall protoplaster som skal brukes som utgangsmate...

Eukaryoter bruker flere RNA biogenese regulatoriske veier for å opprettholde cellulære biologiske prosesser. Blant de kjente typene RNA er mRNA meget variert og bærer kodingskapasiteten til proteiner og deres isoformer 1. PTGR-banen styrer skjebnen til pre-mRNAs 2 , 3 . RBP fra forskjellige genfamilier styrer reguleringen av RNA, og i PTGR styrer bestemte mRBPs mRNA gjennom direkte fysiske interaksjoner, og danner funksjonelle mRNP&#39;er. Derfor er identifisering og karakterisering av mRBP og deres mRNPs avgjørende for å forstå reguleringen av cellulær mRNA-metabolisme 2. I de siste tre tiårene har ulike in vitro- metoder - inkludert RNA-elektroforetisk mobilitetsforskyvning (REMSA) -analyser, systematisk utvikling av ligander ved eksponensielle anrikningsanalyser (SELEX) basert på bibliotek-avledede konstruksjoner, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radioaktivt merket eller kvantitativtFluorescens-RNA-bindingsanalyser, røntgenkrystallografi og NMR-spektroskopi 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 - har blitt anvendt mye på studier av RBP, hovedsakelig fra pattedyrceller. Resultatene av disse studiene av pattedyr-RBP kan søges via den RNA-bindende Protein DataBase (RBPDB), som samler de publiserte observasjonene 10 . Selv om disse in vitro- tilnærmingene er kraftige verktøy, bestemmer de de bundne RNA-motivene fra et gitt RNA-basseng av sekvenser og er derfor begrenset i deres evne til å oppdage nye mål-RNAer. Det samme gjelder for beregningsstrategier for å forutsi genomgående RBP, som er basert på bevaring av proteinsekvens og struktur 15 . For å overvinne dette, har en ny eksperimentell metode haS er etablert som muliggjør identifisering av RNA-motivene som en RBP av interesse interagerer med, samt for bestemmelsen av den nøyaktige bindingsstedet. Denne metoden, kalt &quot;tverrbinding og immunutfelling&quot; (CLIP), består av in vivo UV-kryssbinding etterfulgt av immunutfelling 11 . Tidlige studier har vist at fotoaktivering av DNA- og RNA-nukleotider kan forekomme ved eksitasjon UV-bølgelengder større enn 245 nm. Reaksjonen gjennom tymidin synes å være favorisert (rang i rekkefølge av redusert fotoreaktivitet: dT&gt; dC&gt; rU&gt; rC, dA, dG) 12 . Ved bruk av UV-lys med en bølgelengde på 254 nm (UV-C) ble det observert at kovalente bindinger mellom RNA-nukleotider og proteinrester opprettes når det er bare noen få Ångstrømmer (Å). Fenomenet kalles derfor &quot;nellengde&quot; tverrbinding av RNA og RBP. Dette kan følges av en streng rensingsprosedyre<html> Kostbar med liten bakgrunn 13 , 14 . En strategi som er komplementær til CLIP, er å kombinere in vivo UV-kryssbinding med proteinidentifikasjon for å beskrive landskapet av RBP. Et antall slike genome-brede mRNA-bundet proteomer er blitt isolert fra gjærceller, embryonale stamceller (ESC&#39;er) og humane cellelinjer ( dvs. HEK293 og HeLa) ved hjelp av denne nye eksperimentelle tilnærming, kalt &quot;mRNA interactome capture&quot; 18 , 19 , 20 , 21 . Metoden består av in vivo UV-kryssbinding etterfulgt av mRNP-rensing og MS-basert proteomikk. Ved å anvende denne strategien har mange nye &quot;måneskinnende&quot; RBP som inneholder ikke-kanoniske RBDer blitt oppdaget, og det har blitt klart at flere proteiner har RNA-bindende kapasiteter enn tidligere antatt&quot;&gt; 15 , 16 , 17. Bruken av denne metoden tillater nye applikasjoner og muligheten til å svare på nye biologiske spørsmål ved undersøkelse av RBP. For eksempel har en nylig studie undersøkt bevaring av det mRNA-bundet proteomet (kjernen RBP Proteom) mellom gjær og humane celler 22 . Plant RBP har allerede blitt funnet å være involvert i vekst og utvikling ( f.eks . I post-transkripsjonell regulering av blomstringstid, sirkadisk klokke og genuttrykk i mitokondrier og kloroplaster) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . Videre antas de å utføre funksjoner i de cellulære prosessene som reagerer på abiotiske påkjenninger ( f.eks. Kaldt, tørke, saLinity og abscisic acid (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . Det er mer enn 200 forutsagte RBP-gener i Arabidopsis thaliana- genomet, basert på RNA-anerkjennelsesmotiv (RRM) og K homologi (KH) domenesekvensmotiv; I ris har omtrent 250 blitt notert 35 , 36 . Det er bemerkelsesverdig at flere forutsagte RBPs synes å være unik for planter (f.eks ingen metazo ortologer til omtrent 50% av forventet Arabidopsis RBPs inneholdende et domene RRM) 35, hvilket antyder at mange kan tjene til nye funksjoner. Funksjonene til de fleste spådde RBP er fortsatt ukarakterisert 23 . Isoleringen av mRNA-bundet proteomer fra Arabidopsis- etiolerte frøplanter, bladvev, dyrkede rotceller og blad mesofyllprotoplaster ved bruk avMRNA interactome capture er nylig rapportert 38 , 39 . Disse studiene viser det sterke potensialet for systematisk katalogisering av funksjonelle RBP i planter i nær fremtid. Her presenterer vi en protokoll for mRNA interaktiv fangst fra planteprotoplaster ( dvs. celler uten cellevegger). Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplaster er den viktigste typen av bladcelle. De isolerte protoplastene tillater optimal tilgang av UV-lys til cellene. Denne celletypen kan brukes i analyser som forbigående uttrykker proteiner for funksjonell karakterisering 40 , 41 . Videre har protoplasting blitt anvendt på flere andre plantecelletyper og arter 42 , 43 , 44 ( f.eks. Petersson et al ., 2009; Bargmann og Birnbaum, 2010; og Hong et al ., 2012). &lt;P class = &quot;jove_content&quot;&gt; Metoden omfatter totalt 11 trinn ( Figur 1A ). Arabidopsis leaf mesophyll protoplaster isoleres først (trinn 1) og blir deretter UV-bestrålet for å danne tverrbundne mRNP&#39;er (trinn 2). Når protoplaster lyseres under denatureringsbetingelser (trinn 3), frigjøres de tverrbundne mRNPene i lys / bindingsbuffer og trekkes ned av oligo-d (T) 25 perler (trinn 4). Etter flere runder med strenge vasker renses mRNPene og analyseres videre. De denaturerte peptider av mRBPs fordøyes av proteinase K før de tverrbundne mRNAene renses og RNA-kvaliteten er verifisert av qRT-PCR (trinn 5 og 6). Etter RNase-behandling og proteinkonsentrasjon (trinn 7) styres proteinkvaliteten ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og sølvfarging (trinn 8). Forskjellen i proteinbåndsmønstre kan enkelt visualiseres mellom en tverrbundet prøve (CL) og en ikke-tverrbundet prøve (ikke-CL;Den negative kontrollprøven fra protoplaster som ikke er utsatt for UV-bestråling). Identifikasjonen av proteiner oppnås gjennom MS-basert proteomikk. Proteinene fra CL-prøven separeres ved endimensjonal polyakrylamidgelelektroforese (1D-PAGE) for å fjerne mulig bakgrunnsforurensning, &quot;in-gel digereres&quot; til korte peptider ved anvendelse av trypsin og renses (trinn 9). Nano reversfase væskekromatografi koblet til massespektrometri (nano-LC-MS) tillater bestemmelse av mengden av endelige proteiner i det mRNA-bundne proteomet (trinn 10). Til slutt karakteriseres de identifiserte mRBPene og katalogiseres ved hjelp av bioinformatisk analyse (trinn 11).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 M Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1902-500G</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Art. 4935</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M MES (pH 5.7) 
			(4-morpholineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			MMg solution, 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>CELLULASE 
			&#8220;ONOZUKA&#8221; 
			R-10, 10 g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>MACEROZYME R-10, 10g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% (w/v) BSA 
			(Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Chem-Lab NV</td>
			<td>CL00.0317.1000</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td>W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiCl 
			(Lithium Chloride)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>199885000</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2 &#38; 
			Low salt buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% (w/v) LiDS 
			(Lithium Dodecyl Sulphate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4632-25G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M DTT 
			(Dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Wash buffer 2</td>
			<td>307866</td>
			<td>Lysis/binding buffer,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl))</td>
			<td>Acros &#38; 
			Fisher Chemical</td>
			<td>167620010 &#38; 
			H/1200/PB15</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>ED-500G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8.22184.0500</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M NaOH</td>
			<td>VWR PROLABO CHEMICALS</td>
			<td>28244.295</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (pH 7.4) 
			(Phosphate Buffered Saline) 
			containing 
			(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Chemical, MERCK, 
			Sigma-aldrich &#38; SAFC</td>
			<td>S/3160/60, 
			Art. 4935, 
			71640-250G &#38; 
			60230</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (2 &#956;g/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11789020</td>
			<td>Protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td>qRT-PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td>RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>322415</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>537020</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NH4HCO3 
			(Ammonium bicarbonate) 
			&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td>Gel hydration &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH3CN 
			(Acetonitrile)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>34851-100ML</td>
			<td>Gel dehydration &#38; 
			Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA 
			(Iodoacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I4386-10G</td>
			<td>Alkylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA 
			(Trifluoroacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>302031-10X1ML</td>
			<td>Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA 
			(Formic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>06554-5G</td>
			<td>Peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution (6 ng/&#956;L)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>Peltracom</td>
			<td>LP2D</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite 3</td>
			<td>Sibli AS</td>
			<td>05VERMICULIET</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150 x 20 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE2M229104</td>
			<td>Homogenization of final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T585</td>
			<td>Rosette leaf strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-75 &#956;m nylon mesh</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>74010</td>
			<td>Protoplast suspension filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL round bottom tubes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1918-10EA</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer 
			(B&#252;rker hemocytometer)</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td>Protoplast cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinking apparatus 
			(HL-2000 HybriLinker)</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>UVP95003101</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp 
			(Sankyo-Denki G8T5)</td>
			<td>SANKYO 
			DENKI</td>
			<td>SD G8T5</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL glass syringe</td>
			<td>FORTUNA Optima</td>
			<td>Z314560</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow needle (0.9 x 25 mm)</td>
			<td>Becton Dickinson microlance 3</td>
			<td>2021-04</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Model L26</td>
			<td>Labinco BV</td>
			<td>26110912</td>
			<td>Sample incubation by rotating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-d(T)25 magnetic beads 
			(5 mg/mL)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1419S</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units 
			(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>mRBP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td>Silver-staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit 
			(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)</td>
			<td>STRATEC Molecular</td>
			<td>1064100300</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR cycler 
			(StepOne Real-Time PCR cycler)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>cDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-C18 columns 
			(Millipore Zip Tip &#181;-C18 columns)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>720046-960EA</td>
			<td>Peptide purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer 
			(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column 
			(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES800</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 precolumn 
			(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for qRT-PCR assay</td>
			<td colspan="3">Sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBQ10 mRNA 
			(Li et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG 
			Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S rRNA 
			(Durut et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG 
			Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mrna interactome capture from plant protoplasts

RNA-bindende proteiner (RBP) bestemmer skjebnen til RNA. De deltar i alle RNA-biogenesebaner og bidrar spesielt til post-transkriptionell genregulering (PTGR) av messenger-RNA (mRNA). I de siste årene har en rekke mRNA-bundne proteomer fra gjær og pattedyrcellelinjer blitt isolert med suksess ved bruk av en ny metode kalt &quot;mRNA interaktiv fangst&quot;, som muliggjør identifisering av mRNA-bindende proteiner (mRBPs) Direkte fra et fysiologisk miljø. Metoden består av in vivo ultraviolett (UV) tverrbinding, nedtrekking og rensing av messenger ribonukleoproteinkomplekser (mRNPs) ved oligo (dT) perler, og den påfølgende identifikasjon av de tverrbundne proteiner ved massespektrometri (MS). Svært nylig, ved å anvende den samme metoden, har flere plante-mRNA-bundet proteomer blitt rapportert samtidig fra forskjellige Arabidopsis- vevskilder: etiolerte frøplanter, bladvev,Blad mesofyll protoplaster og dyrkede rotceller. Her presenterer vi den optimaliserte mRNA interaktive oppsamlingsmetoden for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplaster, en celletype som tjener som et allsidig verktøy for eksperimenter som inkluderer ulike cellulære analyser. Betingelsene for optimal proteinutbytte inkluderer mengden av startvev og varigheten av UV-bestråling. I det mRNA-bundne proteomet som er oppnådd fra et mediumskalaforsøk (10 7 celler), ble RBPer som var kjent for å ha RNA-bindingsevne, funnet å være overrepresentert, og mange nye RBP ble identifisert. Eksperimentet kan skaleres opp (10 9 celler), og den optimaliserte metoden kan brukes på andre plantecelletyper og arter for å isolere, katalogisere og sammenligne mRNA-bundet proteomer i planter.

Vi observerte en karakteristisk halo som omgir perlepellet i CL-prøven, i vaske trinn 4.3 med vaskebuffer 2 ( figur 1B ). Selv om det ikke er blitt undersøkt, kan dette fenomenet sannsynligvis forklares av forstyrrelsen av tverrbundne mRNP-komplekser med perleaggregering under magnetisk fangst, hvilket forårsaker et mer diffust aggregat å danne. Det indikerer at oligo-d (T) 25 perlefangst var effektiv 14 . <p class=...

Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Her presenterer vi en interaktiv fangstprotokoll anvendt på Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplaster. Denne metoden baserer seg kritisk på in vivo UV-kryssbinding og muliggjør isolering og identifisering av plante-mRNA-bindende proteiner fra et fysiologisk miljø.

MRNA Interactome Capture fra Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Experimental Design for Laser mikrodisseksjon RNA-Seq: Lærdommer fra en analyse av Mais Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraksjonert ekstraksjonsmetode for den omfattende analysen av metabolitter, lipider og proteiner fra en enkelt prøve

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolasjon og respiratoriske målinger av mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Blad Spray massespektrometri: En rask Ambient ionisering teknikk å vurdere direkte metabolitter fra anlegget vev

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein utvinning, enzymatisk aktivitet og genuttrykk av koffein syntase fra anlegget celle suspensjoner

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Studere Protein Import i Chloroplasts bruker Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Fangst og identifikasjon av RNA-bindende proteiner ved hjelp av Klikk kjemi-assistert RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-fri Immunutfelling masse massespektrometri arbeidsflyt for stor skala kjernefysisk Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...