Name: mrna interactome capture from plant protoplasts
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

Reconhecemos o laboratório do Prof. Joris Winderickx, que forneceu o aparelho de reticulação UV equipado com a lâmpada UV convencional. A KG é apoiada pelo fundo de pesquisa KU Leuven e reconhece o apoio da subvenção FWO G065713N.

1. Aislamento de Protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis NOTA: Os protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis são essencialmente isolados como descrito por Yoo et al ., 2007, com várias modificações 40 . <ol><li> Crescimento de plantas <ol><li> Mergulhe cerca de 200 sementes de etiópia Col-0 de Arabidopsis thaliana em água esterilizada durante 2 dias a 4 ° C na escuridão para estratificação...

Nós aplicamos com sucesso a captura de interome de mRNA, desenvolvida para leveduras e células humanas, para plantar protoplastos de mesofila foliar. As células do mesofílio da folha são o principal tipo de tecido moído nas folhas das plantas. A principal vantagem deste método é que ele usa reticulação in vivo para descobrir as proteínas de um ambiente fisiológico. Neste protocolo, apresentamos principalmente uma série de condições experimentais otimizadas ( por e...

Os eucariotas usam múltiplos caminhos regulatórios da biogênese do ARN para manter os processos biológicos celulares. Entre os tipos conhecidos de ARN, o ARNm é muito diverso e traz a capacidade de codificação das proteínas e suas isoformas 1. A via PTGR direciona o destino dos pré-mRNAs 2 , 3 . RBPs de diferentes famílias de genes controlam a regulação do RNA, e em PTGR, mRBPs específicos orientam os mRNAs através de interações físicas diretas, formando mRNPs funcionais. Portanto, identificar e caracterizar mRBPs e seus mRNPs é fundamental para a compreensão da regulação do metabolismo do mRNA celular 2. Nas últimas três décadas, vários métodos in vitro - incluindo ensaios de mudança de mobilidade eletroforética de RNA (REMSA), evolução sistemática de ligandos por ensaios exponenciais de enriquecimento (SELEX) com base em construções derivadas da biblioteca, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radiomarcados ou quantitativosEnsaios de ligação de ARN de fluorescência, cristalografia de raios X e espectroscopia de RMN 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 - foram amplamente aplicados a estudos de RBPs, principalmente de células de mamífero. Os resultados desses estudos de RBPs de mamíferos podem ser pesquisados ​​através da Base de Proteínas de Proteção de RNA (RBPDB), que coleta as observações publicadas 10 . Embora essas abordagens in vitro sejam ferramentas poderosas, elas determinam os motivos de RNA vinculados a partir de um conjunto de sequências de RNA dado e, portanto, são limitadas na capacidade de descobrir novos RNAs alvo. O mesmo é verdade para estratégias computacionais para prever RBPs em todo o genoma, que se baseiam na conservação da seqüência e estrutura da proteína 15 . Para superar isso, um novo método experimental haFoi estabelecido que permite a identificação dos motivos RNA de que um RBP de interesse interage, bem como para a determinação da localização precisa da ligação. Este método, denominado &quot;reticulação e imunoprecipitação&quot; (CLIP), é composto de reticulação UV in vivo seguida de imunoprecipitação 11 . Estudos iniciais mostraram que a fotoativação de nucleotídeos de DNA e RNA pode ocorrer em comprimentos de onda ultravioleta de excitação superiores a 245 nm. A reacção através da timidina parece ser favorecida (classificação por ordem de redução da fotoreactividade: dT ≥ dC&gt; rU&gt; rC, dA, dG) 12 . Usando luz UV com um comprimento de onda de 254 nm (UV-C), observou-se que as ligações covalentes entre os nucleotídeos de ARN e os resíduos de proteínas são criados quando na faixa de apenas alguns Angstroms (Å). O fenômeno é, portanto, chamado de reticulação &quot;zero-length&quot; de RNA e RBP. Isto pode ser seguido por um rigoroso processo de purificação<html> Com poucos antecedentes 13 , 14 . Uma estratégia complementar ao CLIP é combinar reticulação UV in vivo com identificação de proteína para descrever a paisagem de RBPs. Vários desses proteomas ligados a ARNm do genoma foram isolados a partir de células de levedura, células-tronco embrionárias (ESC) e linhas celulares humanas ( ou seja, HEK293 e HeLa) utilizando esta nova abordagem experimental, chamada &quot;captura de intercepto de mRNA&quot; 18 , 19 , 20 , 21 . O método é composto de reticulação ultravioleta in vivo seguido por purificação de mRNP e proteômica baseada em MS. Ao aplicar esta estratégia, descobriram-se muitas RBPs &quot;nítidas&quot; que contêm RBDs não-canônicas, e tornou-se claro que mais proteínas possuem capacidades de ligação ao ARN do que se supunha anteriormente&quot;&gt; 15 , 16 , 17. O uso deste método permite novas aplicações e a capacidade de responder a novas questões biológicas ao investigar RBPs. Por exemplo, um estudo recente investigou a conservação do proteoma vinculado ao mRNA (RBP do núcleo) Proteoma) entre leveduras e células humanas 22 . Os RBPs da planta já foram encontrados envolvidos no crescimento e no desenvolvimento ( por exemplo , na regulação pós-transcrição do tempo de floração, no relógio circadiano e na expressão gênica nas mitocôndrias e cloroplastos) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . Além disso, eles são pensados ​​para desempenhar funções nos processos celulares que respondem a estresses abióticos ( por exemplo, frio, seca, saLinidade e ácido abscísico (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . Existem mais de 200 genes de RBP previstos no genoma de Arabidopsis thaliana , com base em motivos de reconhecimento de RNA (RRM) e homologia de K (KH); Em arroz, aproximadamente 250 foram observados 35 , 36 . É notável que muitas RBPs preditas parecem ser únicas para as plantas ( por exemplo, nenhum orthologs metazoários para aproximadamente 50% das RBPs Arabidopsis previstas contendo um domínio RRM) 35 , sugerindo que muitos podem servir novas funções. As funções das RBPs mais preditas permanecem não caracterizadas 23 . O isolamento de proteomas ligados a mRNA de mudas etioladas de Arabidopsis , tecido foliar, células radiculares cultivadas e protoplastos de mesofila foliar através do uso deA captura de intercepto de mRNA foi recentemente relatada 38 , 39 . Esses estudos demonstram o forte potencial de catalogação sistemática de RBPs funcionais em plantas em um futuro próximo. Aqui, apresentamos um protocolo para captura de intereleto de mRNA a partir de protoplastos de plantas ( isto é, células sem paredes celulares). Os protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana são o principal tipo de célula foliar. Os protoplastos isolados permitem o acesso ideal da luz UV às células. Este tipo de célula pode ser usado em ensaios que expressam transitoriamente proteínas para caracterização funcional 40 , 41 . Além disso, o protoplasting foi aplicado a vários outros tipos de células vegetais e espécies 42 , 43 , 44 ( eg, Petersson et al ., 2009; Bargmann e Birnbaum, 2010; e Hong et al ., 2012). &lt;P class = &quot;jove_content&quot;&gt; O método abrange um total de 11 passos ( Figura 1A ). Os protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis são primeiro isolados (passo 1) e subsequentemente são irradiados com UV para formar mRNPs reticulados (passo 2). Quando os protoplastos são lisados ​​em condições de desnaturação (passo 3), as mRNP reticuladas são liberadas em tampão de lise / ligação e puxadas pelas pérolas oligo-d (T) 25 (passo 4). Após várias rodadas de lavagens rigorosas, os mRNPs são purificados e analisados ​​posteriormente. Os péptidos desnaturados de mRBPs são digeridos pela proteinase K antes dos mRNAs reticulados serem purificados e a qualidade do RNA é verificada por qRT-PCR (passos 5 e 6). Após o tratamento com RNase e a concentração de proteína (passo 7), a qualidade da proteína é controlada por electroforese em gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) e coloração com prata (passo 8). A diferença nos padrões de banda proteica pode ser facilmente visualizada entre uma amostra reticulada (CL) e uma amostra não reticulada (não CL;A amostra de controle negativo de protoplastos que não está sujeita a irradiação UV). A identificação de proteínas é conseguida através de proteômica baseada em MS. As proteínas da amostra de CL são separadas por electroforese em gel de poliacrilamida unidimensional (1D-PAGE) para remover a possível contaminação de fundo, são &quot;digeridas em gel&quot; em péptidos curtos usando tripsina e são purificadas (passo 9). A cromatografia líquida nano de fase inversa acoplada à espectrometria de massa (nano-LC-MS) permite a determinação da quantidade de proteínas definitivas no proteoma ligado ao mRNA (passo 10). Finalmente, os mRBP identificados são caracterizados e catalogados usando a análise bioinformática (etapa 11).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 M Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1902-500G</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Art. 4935</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M MES (pH 5.7) 
			(4-morpholineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			MMg solution, 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>CELLULASE 
			&#8220;ONOZUKA&#8221; 
			R-10, 10 g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>MACEROZYME R-10, 10g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% (w/v) BSA 
			(Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Chem-Lab NV</td>
			<td>CL00.0317.1000</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td>W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiCl 
			(Lithium Chloride)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>199885000</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2 &#38; 
			Low salt buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% (w/v) LiDS 
			(Lithium Dodecyl Sulphate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4632-25G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M DTT 
			(Dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Wash buffer 2</td>
			<td>307866</td>
			<td>Lysis/binding buffer,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl))</td>
			<td>Acros &#38; 
			Fisher Chemical</td>
			<td>167620010 &#38; 
			H/1200/PB15</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>ED-500G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8.22184.0500</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M NaOH</td>
			<td>VWR PROLABO CHEMICALS</td>
			<td>28244.295</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (pH 7.4) 
			(Phosphate Buffered Saline) 
			containing 
			(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Chemical, MERCK, 
			Sigma-aldrich &#38; SAFC</td>
			<td>S/3160/60, 
			Art. 4935, 
			71640-250G &#38; 
			60230</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (2 &#956;g/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11789020</td>
			<td>Protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td>qRT-PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td>RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>322415</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>537020</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NH4HCO3 
			(Ammonium bicarbonate) 
			&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td>Gel hydration &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH3CN 
			(Acetonitrile)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>34851-100ML</td>
			<td>Gel dehydration &#38; 
			Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA 
			(Iodoacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I4386-10G</td>
			<td>Alkylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA 
			(Trifluoroacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>302031-10X1ML</td>
			<td>Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA 
			(Formic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>06554-5G</td>
			<td>Peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution (6 ng/&#956;L)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>Peltracom</td>
			<td>LP2D</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite 3</td>
			<td>Sibli AS</td>
			<td>05VERMICULIET</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150 x 20 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE2M229104</td>
			<td>Homogenization of final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T585</td>
			<td>Rosette leaf strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-75 &#956;m nylon mesh</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>74010</td>
			<td>Protoplast suspension filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL round bottom tubes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1918-10EA</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer 
			(B&#252;rker hemocytometer)</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td>Protoplast cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinking apparatus 
			(HL-2000 HybriLinker)</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>UVP95003101</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp 
			(Sankyo-Denki G8T5)</td>
			<td>SANKYO 
			DENKI</td>
			<td>SD G8T5</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL glass syringe</td>
			<td>FORTUNA Optima</td>
			<td>Z314560</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow needle (0.9 x 25 mm)</td>
			<td>Becton Dickinson microlance 3</td>
			<td>2021-04</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Model L26</td>
			<td>Labinco BV</td>
			<td>26110912</td>
			<td>Sample incubation by rotating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-d(T)25 magnetic beads 
			(5 mg/mL)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1419S</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units 
			(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>mRBP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td>Silver-staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit 
			(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)</td>
			<td>STRATEC Molecular</td>
			<td>1064100300</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR cycler 
			(StepOne Real-Time PCR cycler)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>cDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-C18 columns 
			(Millipore Zip Tip &#181;-C18 columns)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>720046-960EA</td>
			<td>Peptide purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer 
			(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column 
			(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES800</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 precolumn 
			(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for qRT-PCR assay</td>
			<td colspan="3">Sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBQ10 mRNA 
			(Li et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG 
			Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S rRNA 
			(Durut et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG 
			Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mrna interactome capture from plant protoplasts

As proteínas de ligação ao ARN (RBPs) determinam o destino dos ARNs. Eles participam de todas as vias de biogênese de RNA e contribuem especialmente para a regulação de genes pós-transcrição (PTGR) de ARNs mensageiros (mRNAs). Nos últimos anos, uma série de proteomas ligados a mRNA de leveduras e linhas de células de mamíferos foram isoladas com sucesso através do uso de um novo método chamado &quot;captura de intercepto de ARNm&quot;, que permite a identificação de proteínas de ligação de mRNA (mRBPs) Diretamente de um ambiente fisiológico. O método é composto de reticulação ultravioleta (UV) in vivo , pull-down e purificação de complexos de ribonucleoproteína messenger (mRNPs) por esferas de oligo (dT) e a posterior identificação das proteínas reticuladas por espectrometria de massa (MS). Muito recentemente, ao aplicar o mesmo método, vários proteomas ligados a mRNA de plantas foram relatados simultaneamente em diferentes fontes de tecido de Arabidopsis : mudas etioladas, tecido foliar,Protoplastos de mesofila foliar e células de raízes cultivadas. Aqui, apresentamos o método otimizado de captura de interome de mRNA para protoplastos de mesofila de folha de Arabidopsis thaliana , um tipo de célula que serve como uma ferramenta versátil para experiências que incluem vários ensaios celulares. As condições para o rendimento proteico ideal incluem a quantidade de tecido inicial e a duração da irradiação UV. No proteoma ligado a mRNA obtido a partir de uma experiência de média escala (10 células 7 ), as RBPs observaram que a capacidade de ligação de RNA foi representada de forma exagerada e foram identificadas várias novas RBPs. O experimento pode ser ampliado (10 9 células), e o método otimizado pode ser aplicado a outros tipos e espécies de células vegetais para isolar, catalogar e comparar geneticamente proteinas de mRNA nas plantas.

Observamos um halo característico, que envolve o grânulo do talão na amostra CL, no passo de lavagem 4.3 com o tampão de lavagem 2 ( Figura 1B ). Embora não tenha sido investigado, esse fenômeno provavelmente pode ser explicado pela interferência de complexos de mRNP reticulados com agregação de grânulos durante a captura magnética, fazendo com que um agregado mais difuso se forme. Isso indica que a captura de pérolas oligo-d (T) 25 fo...

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mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Aqui, apresentamos um protocolo de captura interativo aplicado aos protoplastos de mesofila da folha de Arabidopsis thaliana . Este método baseia-se criticamente na reticulação UV in vivo e permite o isolamento e identificação de proteínas de ligação a mRNA de plantas a partir de um ambiente fisiológico.

Capacidade de interactomo do mRNA a partir de protoplastos de plantas

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Bioquímica

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Projeto Experimental de Laser Microdissecção RNA-Seq: Lições de uma análise do desenvolvimento foliar do milho

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Um Método de Extração Fracionada Simples para a Análise Abrangente de Metabolitos, Lípidos e Proteínas de uma única amostra

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolamento e medições respiratória de mitocôndrias de Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

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Extração de cafeína, atividade enzimática e expressão gênica de cafeína sintase de suspensões celulares de planta

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Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Captura e identificação de proteínas de ligação de RNA usando clique química assistida RNA-interactome capturam estratégia (CARIC)

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

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Usando na transferência de energia de ressonância de fluorescência de Vitro para estudar a dinâmica dos complexos de proteínas em uma escala de tempo de milissegundo

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Fluxo de trabalho de espectrometria de massa de imunoprecipitação sem rótulos para perfis de interactom nuclear em larga escala

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...