Name: mrna interactome capture from plant protoplasts
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

Мы признаем лабораторию профессора Джориса Уиндикера, который предоставил УФ-сшивающее устройство, оснащенное обычной УФ-лампой. KG поддерживается исследовательским фондом KU Leuven и подтверждает поддержку гранта FWO G065713N.

1. Изоляция протопластов листьев Arabidopsis Leaf ПРИМЕЧАНИЕ. Протопласты листьев мезофилла листа Arabidopsis по существу изолированы, как описано Yoo et al ., 2007, с несколькими модификациями 40 . <ol><li> Рост растений <ol><li> Замачивайте приблизительно 200 с...

Мы успешно применили захват мРНК-взаимодействий, разработанный для дрожжей и человеческих клеток, для протопластов листьев мезофилла. Листовые мезофильные клетки являются основным типом молочной ткани листьев растений. Основным преимуществом этого метода является то, что он использ...

Эукариоты используют множественные регуляторные пути биогенеза РНК для поддержания клеточных биологических процессов. Среди известных типов РНК мРНК очень разнообразна и обладает кодирующей способностью белков и их изоформ 1. Путь ПТРГ направляет судьбы пре-мРНК 2 , 3 . RBP из разных семейств генов контролируют регуляцию РНК, а в PTGR специфические mRBPs направляют мРНК через прямые физические взаимодействия, образуя функциональные mRNP. Таким образом, идентификация и характеристика mRBPs и их mRNPs имеет решающее значение для понимания регуляции метаболизма клеточной мРНК 2. За последние три десятилетия различные методы in vitro, включая анализ сдвига электрофоретической подвижности РНК (REMSA), систематическую эволюцию лигандов с помощью экспоненциальных анализов обогащения (SELEX), основанный на библиотечных конструкциях, RNA Bind-n-Seq (RBNS), радиоактивно меченых или количественныхФлуоресцентные анализы связывания РНК, рентгеновская кристаллография и ЯМР-спектроскопия 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 - широко применяются к исследованиям RBP, главным образом из клеток млекопитающих. Результаты этих исследований RBP млекопитающих можно искать через РНК-связывающую базу данных протеина (RBPDB), которая собирает опубликованные наблюдения 10 . Хотя эти подходы in vitro являются мощными инструментами, они определяют связанные мотивы РНК из заданного пула последовательностей РНК и поэтому ограничены в их способности обнаруживать новые целевые РНК. То же самое верно и для вычислительных стратегий для прогнозирования генома ОДП, которые основаны на сохранении белковой последовательности и структуры 15. Чтобы преодолеть это, новый экспериментальный метод haЧто позволяет идентифицировать мотивы РНК, с которыми взаимодействует RBP, а также для определения точного местоположения привязки. Этот метод, называемый «сшивка и иммунопреципитация» (CLIP), состоит из ультрафиолетового сшивания in vivo с последующим иммунопреципитацией 11 . Ранние исследования показали, что фотоактивация ДНК и РНК-нуклеотидов может происходить при длинах волн возбуждения УФ-лучей, превышающих 245 нм. Реакция через тимидин, по-видимому, благоприятствует (ранг в порядке уменьшения фотореактивности: dT ≥ dC&gt; rU&gt; rC, dA, dG) 12 . Используя УФ-излучение с длиной волны 254 нм (УФ-С), было обнаружено, что ковалентные связи между нуклеотидами РНК и остатками белка создаются в пределах лишь нескольких ангстрем (Å). Явление, таким образом, называется «нулевой длиной» сшивки РНК и RBP. За этим может следовать строгая процедура очистки<html> Dure с небольшим фоном 13 , 14 . Стратегия, дополняющая CLIP, заключается в том, чтобы объединить UV-сшивание in vivo с идентификацией белка для описания ландшафта RBP. Ряд таких геномных мРНК-связанных протеомов был выделен из дрожжевых клеток, эмбриональных стволовых клеток (ESCs) и клеточных линий человека ( т.е. HEK293 и HeLa) с использованием этого нового экспериментального подхода, называемого «захват мРНК-взаимодействием» 18 , 19 , 20 , 21 . Метод состоит из ультрафиолетового сшивки in vivo с последующей очисткой mRNP и протеомикой на основе MS. Применяя эту стратегию, было обнаружено много новых «лунных светящихся» RBP, содержащих неканонические RBD, и стало ясно, что больше белков обладает способностью связываться с РНК, чем предполагалось ранее«&gt; 15 , 16 , 17. Использование этого метода позволяет использовать новые приложения и возможность отвечать на новые биологические вопросы при исследовании RBP. Например, недавнее исследование исследовало сохранение связанного с мРНК протеомом (основной RBP Протеом) между клетками дрожжей и человека 22 . Было обнаружено, что RBP растений уже участвуют в росте и развитии ( например , в посттранскрипционной регуляции времени цветения, циркадных часов и экспрессии генов в митохондриях и хлоропластах) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , Кроме того, предполагается, что они выполняют функции в клеточных процессах, реагирующих на абиотические стрессы ( например, холод, засуха, sa(ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . В геноме Arabidopsis thaliana имеется более 200 предсказанных генов RBP, основанных на мотивах мотивов распознавания РНК (RRM) и K homology (KH); В рисе было отмечено около 250 35 , 36 . Примечательно, что многие предсказанные ОСП, по-видимому, уникальны для растений ( например, не ортологий метазоанов примерно до 50% предсказанных ОКРБ Arabidopsis, содержащих домен RRM) 35 , предполагая, что многие могут выполнять новые функции. Функции большинства прогнозируемых ОДП остаются нехарактерными 23 . Выделение мРНК-связанных протеомов из этиолированных проростков Arabidopsis , листовой ткани, культивируемых корневых клеток и протопластов листьев мезофилла посредством использованияНедавно был зарегистрирован захват мРНК-взаимодействием 38 , 39 . Эти исследования демонстрируют сильный потенциал систематической каталогизации функциональных RBP на заводах в ближайшем будущем. Здесь мы представляем протокол для захвата мРНК-захвата из протопластов растений ( т. Е. Клеток без клеточных стенок). Протопласты мезофилла листа Arabidopsis thaliana являются основным типом листовых клеток. Изолированные протопласты обеспечивают оптимальный доступ к ультрафиолетовому излучению. Этот тип клеток можно использовать в анализах, которые временно экспрессируют белки для функциональной характеристики 40 , 41 . Кроме того, протопластика была применена к нескольким другим типам растительных клеток и видам 42 , 43 , 44 ( например, Petersson et al ., 2009; Bargmann and Birnbaum, 2010; Hong и др ., 2012). &lt;P class = &quot;jove_content&quot;&gt; Метод включает в общей сложности 11 шагов ( рисунок 1A ). Сначала собирают протопласты листьев Arabidopsis (этап 1) и затем подвергают ультрафиолетовому облучению с образованием сшитых mRNP (стадия 2). Когда протопласты лизируют в условиях денатурации (этап 3), сшитые mRNPs высвобождаются в буфере для лизиса / связывания и вытягиваются бусинами олиго-d (T) 25 (этап 4). После нескольких раундов строгих промывок mRNP очищают и далее анализируют. Денатурированные пептиды mRBPs расщепляются протеиназой K до того, как сшитые мРНК очищаются и качество РНК проверяется qRT-PCR (этапы 5 и 6). После обработки РНКазой и концентрации белка (стадия 7) качество белка контролируется электрофорезом на основе полиакриламидного геля SDS (SDS-PAGE) и окрашиванием серебром (этап 8). Различие в структурах полос белка может быть легко визуализировано между сшитым образцом (CL) и несшитым образцом (не-CL;Отрицательный контрольный образец из протопластов, который не подвергается УФ-облучению). Идентификация белков достигается с помощью протеомики на основе MS. Белки из образца CL отделяют одномерным электрофорезом на полиакриламидном геле (1D-PAGE) для удаления возможного фонового загрязнения, «расщепляют в геле» в короткие пептиды с использованием трипсина и очищают (этап 9). Нано-фазовая жидкостная хроматография, связанная с масс-спектрометрией (нано-LC-MS), позволяет определять количество определенных белков в мРНК-связанном протеоме (этап 10). Наконец, идентифицированные mRBP характеризуются и каталогизируются с использованием биоинформационного анализа (этап 11).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 M Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1902-500G</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Art. 4935</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M MES (pH 5.7) 
			(4-morpholineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			MMg solution, 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>CELLULASE 
			&#8220;ONOZUKA&#8221; 
			R-10, 10 g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>MACEROZYME R-10, 10g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% (w/v) BSA 
			(Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Chem-Lab NV</td>
			<td>CL00.0317.1000</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td>W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiCl 
			(Lithium Chloride)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>199885000</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2 &#38; 
			Low salt buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% (w/v) LiDS 
			(Lithium Dodecyl Sulphate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4632-25G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M DTT 
			(Dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Wash buffer 2</td>
			<td>307866</td>
			<td>Lysis/binding buffer,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl))</td>
			<td>Acros &#38; 
			Fisher Chemical</td>
			<td>167620010 &#38; 
			H/1200/PB15</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>ED-500G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8.22184.0500</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M NaOH</td>
			<td>VWR PROLABO CHEMICALS</td>
			<td>28244.295</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (pH 7.4) 
			(Phosphate Buffered Saline) 
			containing 
			(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Chemical, MERCK, 
			Sigma-aldrich &#38; SAFC</td>
			<td>S/3160/60, 
			Art. 4935, 
			71640-250G &#38; 
			60230</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (2 &#956;g/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11789020</td>
			<td>Protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td>qRT-PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td>RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>322415</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>537020</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NH4HCO3 
			(Ammonium bicarbonate) 
			&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td>Gel hydration &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH3CN 
			(Acetonitrile)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>34851-100ML</td>
			<td>Gel dehydration &#38; 
			Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA 
			(Iodoacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I4386-10G</td>
			<td>Alkylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA 
			(Trifluoroacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>302031-10X1ML</td>
			<td>Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA 
			(Formic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>06554-5G</td>
			<td>Peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution (6 ng/&#956;L)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>Peltracom</td>
			<td>LP2D</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite 3</td>
			<td>Sibli AS</td>
			<td>05VERMICULIET</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150 x 20 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE2M229104</td>
			<td>Homogenization of final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T585</td>
			<td>Rosette leaf strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-75 &#956;m nylon mesh</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>74010</td>
			<td>Protoplast suspension filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL round bottom tubes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1918-10EA</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer 
			(B&#252;rker hemocytometer)</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td>Protoplast cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinking apparatus 
			(HL-2000 HybriLinker)</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>UVP95003101</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp 
			(Sankyo-Denki G8T5)</td>
			<td>SANKYO 
			DENKI</td>
			<td>SD G8T5</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL glass syringe</td>
			<td>FORTUNA Optima</td>
			<td>Z314560</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow needle (0.9 x 25 mm)</td>
			<td>Becton Dickinson microlance 3</td>
			<td>2021-04</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Model L26</td>
			<td>Labinco BV</td>
			<td>26110912</td>
			<td>Sample incubation by rotating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-d(T)25 magnetic beads 
			(5 mg/mL)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1419S</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units 
			(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>mRBP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td>Silver-staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit 
			(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)</td>
			<td>STRATEC Molecular</td>
			<td>1064100300</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR cycler 
			(StepOne Real-Time PCR cycler)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>cDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-C18 columns 
			(Millipore Zip Tip &#181;-C18 columns)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>720046-960EA</td>
			<td>Peptide purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer 
			(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column 
			(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES800</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 precolumn 
			(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for qRT-PCR assay</td>
			<td colspan="3">Sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBQ10 mRNA 
			(Li et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG 
			Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S rRNA 
			(Durut et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG 
			Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mrna interactome capture from plant protoplasts

РНК-связывающие белки (RBPs) определяют судьбы РНК. Они участвуют во всех путях биогенеза РНК и особенно вносят свой вклад в посттранскрипционную регуляцию генов (ПГРР) мессианных РНК (мРНК). В последние несколько лет ряд связанных с мРНК протеомами из клеточных линий дрожжей и млекопитающих успешно изолировали с помощью нового метода, называемого «захват млекопитающих мРНК», который позволяет идентифицировать мРНК-связывающие белки (mRBP) Непосредственно из физиологической среды. Метод состоит из ультрафиолетового (УФ) сшивки in vivo , вытягивания и очистки комплексов рибонуклеопротеинов мессенджера (mRNPs) гранулами олиго (dT) и последующей идентификации сшитых белков с помощью масс-спектрометрии (MS). Совсем недавно, применяя тот же метод, сообщалось о нескольких растительных мРНК-связанных протеомах из разных источников ткани Arabidopsis : этиолированные проростки, ткань листьев,Протопласты листьев мезофилла и культивируемые корневые клетки. Здесь мы представляем оптимизированный метод захвата мРНК-методом для протопластов листьев Arabidopsis thaliana leafes, тип клеток, который служит универсальным инструментом для экспериментов, которые включают в себя различные клеточные анализы. Условия для оптимального выхода белка включают количество исходной ткани и продолжительность УФ-облучения. В мРНК-связанном протеоме, полученном из среднемасштабного эксперимента (10 7 клеток), обнаружены RBP, отмеченные наличием РНК-связывающей способности, и были идентифицированы многие новые RBP. Эксперимент может быть увеличен (10 9 клеток), и оптимизированный метод может быть применен к другим типам растительных клеток и видам, чтобы широко изолировать, каталогизировать и сравнивать связанные с мРНК протеомы в растениях.

Мы наблюдали характерный ореол, который окружает гранулу шарика в образце CL, на этапе 4 промывки промывным буфером 2 ( фиг.1В ). Хотя это и не исследовалось, это явление, вероятно, можно объяснить интерференцией сшитых комплексов mRNP с агрегацией шариков во...

Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Здесь мы представляем протокол захвата сигналов, примененный к протопластам листьев Arabidopsis thaliana leaf mesophyll. Этот метод критически полагается на ультрафиолетовое сшивание in vivo и позволяет изолировать и идентифицировать растительные мРНК-связывающие белки из физиологической среды.

Взаимодействие с мРНК из протопластов растений

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Белковый комплекс Affinity Capture от Cryomilled клеток млекопитающих

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Экспериментальный дизайн для лазерных микродиссекция РНК-Seq: уроки из анализа развития листьев кукурузы

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Простой фракционированный метод экстракции для комплексного анализа метаболитов, липидов и белков из одного образца

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Изоляция и дыхательных измерения митохондрий от Резуховидка Таля

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Масс-спектрометрия спрей лист: Быстрое окружающего ионизации техника непосредственно оценить метаболитов из растительных тканей

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Экстракции кофеина, ферментативной активности и экспрессии генов синтетазы кофеин из суспензий клеток растений

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Изучая белка импорта в хлоропластов, используя протопластов

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Захват и идентификации RNA-связывая протеинов с помощью щелчка при содействии химия РНК interactome захвата (ЦАРСКОЕ) стратегии

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Без этикетки Иммунопрецитис Масса Спектромтертрия Рабочий процесс для крупномасштабного ядерного взаимодействия Профилирование

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...