Name: mrna interactome capture from plant protoplasts
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

Vi erkänner lab av prof Joris Winderickx, som tillhandahöll UV-tvärbindningsapparaten utrustad med den konventionella UV-lampan. KG stöds av KU Leuvens forskningsfond och bekräftar stöd från FWO-bidrag G065713N.

1. Arabidopsis Leaf Mesophyll Protoplast Isolation OBS: Arabidopsis blad mesofyll protoplaster är väsentligen isolerade såsom beskrivits av Yoo et al ., 2007, med flera modifieringar 40 . <ol><li> Tillväxt av växter <ol><li> Blöt ca 200 Arabidopsis thaliana Col-0 ekotypfrön i steriliserat vatten i 2 dagar vid 4 ° C i mörker för stratifiering. OBS: Detta antal frön är tillräckligt för ett icke-...

Vi tillämpade framgångsrikt mRNA interactome capture, utvecklad för jäst och mänskliga celler, till planta blad mesofyll protoplaster. Blad mesofyllceller är den huvudsakliga typen av markvävnad i växtblad. Den största fördelen med denna metod är att den använder in vivo tvärbindning för att upptäcka proteinerna från en fysiologisk miljö. I detta protokoll presenterar vi främst ett antal optimerade experimentella förhållanden (t ex antalet protoplaster s...

Eukaryoter använder flera RNA-biogenesreglerande vägar för att upprätthålla cellulära biologiska processer. Bland de kända typerna av RNA är mRNA väldigt varierande och bär kodningskapaciteten för proteiner och deras isoformer 1. PTGR-vägen ger upphov till förekomsten av pre-mRNAs 2 , 3 . RBP från olika genfamiljer kontrollerar reglering av RNA, och i PTGR styr specifika mRBPs mRNA genom direkta fysiska interaktioner och bildar funktionella mRNP. Identifiering och karakterisering av mRBP och deras mRNPs är därför avgörande för att förstå regleringen av cellulär mRNA-metabolism 2. Under de senaste tre decennierna har olika in vitro- metoder - inklusive RNA-elektroforetisk rörlighetskifte (REMSA) -analyser, systematisk utveckling av ligander genom exponentiella anrikningsanalyser (SELEX) baserat på bibliotek-härledda konstruktioner, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radiomärkta eller kvantitativaFluorescens-RNA-bindningsanalyser, röntgenkristallografi och NMR-spektroskopi 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 - har applicerats i stor utsträckning på studier av RBP, huvudsakligen från däggdjursceller. Resultaten av dessa studier av mammaliska RBP kan sökas via RNA-bindande Protein DataBase (RBPDB), som samlar de publicerade observationerna 10 . Även om dessa in vitro- metoder är kraftfulla verktyg, bestämmer de de bundna RNA-motiven från en given RNA-pool av sekvenser och är därför begränsade i deras förmåga att upptäcka nya mål-RNA. Detsamma gäller för beräkningsstrategier för att förutse genomomfattande RBP, vilka är baserade på bevarande av proteinsekvens och struktur 15 . För att övervinna detta har en ny experimentell metod haS har etablerats som möjliggör identifiering av RNA-motiv som en RBP av intresse interagerar med, liksom för bestämning av den exakta bindningsstället. Denna metod, kallad &quot;tvärbindning och immunutfällning&quot; (CLIP), består av in vivo UV-tvärbindning följt av immunutfällning 11 . Tidiga studier har visat att fotoaktivering av DNA- och RNA-nukleotider kan ske vid exciterings UV-våglängder större än 245 nm. Reaktionen genom tymidin verkar gynnas (rang i ordning med minskad fotoreaktivitet: dT&gt; dC&gt; rU&gt; rC, dA, dG) 12 . Med användning av UV-ljus med en våglängd på 254 nm (UV-C) observerades att kovalenta bindningar mellan RNA-nukleotider och proteinrester skapas när det gäller endast några Ångström (Å). Fenomenet kallas därför &quot;nolllängd&quot; tvärbindning av RNA och RBP. Detta kan följas av ett stringent reningsprocedur<html> Kosta med liten bakgrund 13 , 14 . En strategi som kompletterar CLIP är att kombinera in vivo UV-tvärbindning med proteinidentifiering för att beskriva landskapet av RBP. Ett antal sådana genombredda mRNA-bundna proteomer har isolerats från jästceller, embryonala stamceller (ESC) och humana cellinjer ( dvs HEK293 och HeLa) med användning av detta nya experimentella tillvägagångssätt, som kallas &quot;mRNA interactome capture&quot; 18 , 19 , 20 , 21 . Metoden består av in vivo UV-tvärbindning följt av mRNP-rening och MS-baserad proteomik. Genom att tillämpa denna strategi har många nya &quot;moonlighting&quot; RBPs innehållande icke-canoniska RBDs upptäckts, och det har blivit klart att fler proteiner har RNA-bindande förmåga än vad som tidigare antagits&quot;&gt; 15 , 16 , 17. Användningen av denna metod möjliggör nya applikationer och för förmågan att svara på nya biologiska frågor vid undersökning av RBP. Till exempel har en nyligen genomförd studie undersökt bevarande av det mRNA-bundna proteomet (kärn-RBP Proteom) mellan jäst och humana celler 22 . Planta RBP har redan visat sig vara involverade i tillväxt och utveckling (t ex i posttranskriptionsreglering av blomningstid, cirkadian klockan och genuttryck i mitokondrier och kloroplaster) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . Dessutom menas de att utföra funktioner i cellprocesserna som svarar mot abiotiska påfrestningar ( t.ex. kyla, torka, saLinitet och abscisinsyra (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34 . Det finns mer än 200 förutsagda RBP-gener i Arabidopsis thaliana genomet, baserat på RNA-igenkänningsmotiv (RRM) och K-homologi (KH) domänföljdsmotiv; I ris har cirka 250 noterats 35 , 36 . Det är anmärkningsvärt att många förutspådda RBP verkar vara unika för växter ( t.ex. ingen metazoan orthologs till cirka 50% av predikterade Arabidopsis RBPs som innehåller en RRM-domän) 35 , vilket tyder på att många kan tjäna nya funktioner. Funktionerna hos de flesta förutspådda RBP: erna kvarstår okarakteriserade 23 . Isoleringen av mRNA-bundna proteomer från Arabidopsis etiolerade plantor, lövvävnad, odlade rotceller och blad mesofyll protoplaster genom användning avMRNA interaktionsfångst har nyligen rapporterats 38 , 39 . Dessa studier visar den starka potentialen att systematiskt katalogisera funktionella RBP i växter inom en snar framtid. Här presenterar vi ett protokoll för mRNA-interaktionavskiljning från växtprotoplaster ( dvs. celler utan cellväggar). Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplaster är den huvudsakliga typen av bladcell. De isolerade protoplasterna möjliggör optimal åtkomst av UV-ljus till cellerna. Denna celltyp kan användas i analyser som transientt uttrycker proteiner för funktionell karakterisering 40 , 41 . Vidare har protoplaster applicerats på flera andra växtcellstyper och arter 42 , 43 , 44 ( t.ex. Petersson et al ., 2009; Bargmann och Birnbaum, 2010; och Hong et al ., 2012). &lt;P class = &quot;jove_content&quot;&gt; Metoden omfattar totalt 11 steg ( Figur 1A ). Arabidopsis leaf mesophyll protoplaster isoleras först (steg 1) och UV-bestrålas därefter för att bilda tvärbundna mRNPs (steg 2). När protoplaster lyseras under denatureringsbetingelser (steg 3) frisätts de tvärbundna mRNP: erna i lys / bindningsbuffert och dras ned av oligo-d (T) 25 pärlor (steg 4). Efter flera runda stränga tvättar renas mRNPs och analyseras ytterligare. De denaturerade peptiderna av mRBPs digereras av proteinas K innan de tvärbundna mRNA: ren renas och RNA-kvaliteten verifieras av qRT-PCR (steg 5 och 6). Efter RNas-behandling och proteinkoncentration (steg 7) styrs proteinkvaliteten genom SDS-polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE) och silverfärgning (steg 8). Skillnaden i proteinbandsmönster kan lätt visualiseras mellan ett tvärbundet prov (CL) och ett icke-tvärbundet prov (icke-CL;Det negativa kontrollprovet från protoplaster som inte utsätts för UV-bestrålning). Identifikationen av proteiner uppnås genom MS-baserad proteomik. Proteinerna från CL-provet separeras genom endimensionell polyakrylamidgelelektrofores (1D-PAGE) för att avlägsna eventuell bakgrundskontaminering, &quot;in-gel digereras&quot; till korta peptider med användning av trypsin och renas (steg 9). Nano reversfas vätskekromatografi kopplad till masspektrometri (nano-LC-MS) möjliggör bestämning av mängden av slutgiltiga proteiner i det mRNA-bundna proteomet (steg 10). Slutligen kännetecknas de identifierade mRBP: erna och katalogiseras med användning av bioinformatisk analys (steg 11).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 M Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1902-500G</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Art. 4935</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M MES (pH 5.7) 
			(4-morpholineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			MMg solution, 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>CELLULASE 
			&#8220;ONOZUKA&#8221; 
			R-10, 10 g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>MACEROZYME R-10, 10g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% (w/v) BSA 
			(Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Chem-Lab NV</td>
			<td>CL00.0317.1000</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td>W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiCl 
			(Lithium Chloride)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>199885000</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2 &#38; 
			Low salt buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% (w/v) LiDS 
			(Lithium Dodecyl Sulphate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4632-25G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M DTT 
			(Dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Wash buffer 2</td>
			<td>307866</td>
			<td>Lysis/binding buffer,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl))</td>
			<td>Acros &#38; 
			Fisher Chemical</td>
			<td>167620010 &#38; 
			H/1200/PB15</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>ED-500G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8.22184.0500</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M NaOH</td>
			<td>VWR PROLABO CHEMICALS</td>
			<td>28244.295</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (pH 7.4) 
			(Phosphate Buffered Saline) 
			containing 
			(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Chemical, MERCK, 
			Sigma-aldrich &#38; SAFC</td>
			<td>S/3160/60, 
			Art. 4935, 
			71640-250G &#38; 
			60230</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (2 &#956;g/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11789020</td>
			<td>Protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td>qRT-PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td>RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>322415</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>537020</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NH4HCO3 
			(Ammonium bicarbonate) 
			&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td>Gel hydration &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH3CN 
			(Acetonitrile)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>34851-100ML</td>
			<td>Gel dehydration &#38; 
			Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA 
			(Iodoacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I4386-10G</td>
			<td>Alkylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA 
			(Trifluoroacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>302031-10X1ML</td>
			<td>Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA 
			(Formic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>06554-5G</td>
			<td>Peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution (6 ng/&#956;L)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>Peltracom</td>
			<td>LP2D</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite 3</td>
			<td>Sibli AS</td>
			<td>05VERMICULIET</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150 x 20 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE2M229104</td>
			<td>Homogenization of final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T585</td>
			<td>Rosette leaf strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-75 &#956;m nylon mesh</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>74010</td>
			<td>Protoplast suspension filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL round bottom tubes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1918-10EA</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer 
			(B&#252;rker hemocytometer)</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td>Protoplast cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinking apparatus 
			(HL-2000 HybriLinker)</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>UVP95003101</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp 
			(Sankyo-Denki G8T5)</td>
			<td>SANKYO 
			DENKI</td>
			<td>SD G8T5</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL glass syringe</td>
			<td>FORTUNA Optima</td>
			<td>Z314560</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow needle (0.9 x 25 mm)</td>
			<td>Becton Dickinson microlance 3</td>
			<td>2021-04</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Model L26</td>
			<td>Labinco BV</td>
			<td>26110912</td>
			<td>Sample incubation by rotating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-d(T)25 magnetic beads 
			(5 mg/mL)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1419S</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units 
			(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>mRBP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td>Silver-staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit 
			(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)</td>
			<td>STRATEC Molecular</td>
			<td>1064100300</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR cycler 
			(StepOne Real-Time PCR cycler)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>cDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-C18 columns 
			(Millipore Zip Tip &#181;-C18 columns)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>720046-960EA</td>
			<td>Peptide purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer 
			(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column 
			(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES800</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 precolumn 
			(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for qRT-PCR assay</td>
			<td colspan="3">Sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBQ10 mRNA 
			(Li et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG 
			Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S rRNA 
			(Durut et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG 
			Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mrna interactome capture from plant protoplasts

RNA-bindande proteiner (RBP) bestämmer skeden av RNA. De deltar i alla RNA-biogenesvägar och bidrar särskilt till post-transkriptionell genreglering (PTGR) av messenger-RNA (mRNA). Under de senaste åren har ett antal mRNA-bundna proteomer från jäst- och däggdjurscellinjer isolerats framgångsrikt genom användning av en ny metod som kallas &quot;mRNA-interaktionsupptagning&quot;, vilket möjliggör identifiering av mRNA-bindande proteiner (mRBPs) Direkt från en fysiologisk miljö. Metoden består av in vivo ultraviolett (UV) tvärbindning, neddragning och rening av messenger ribonukleoproteinkomplex (mRNP) med oligo (dT) pärlor och den efterföljande identifieringen av de tvärbundna proteinerna med masspektrometri (MS). Mycket nyligen har flera plant-mRNA-bundna proteomer rapporterats samtidigt från olika Arabidopsis- vävnadskällor: etiolerade plantor, bladvävnad,Blad mesofyll protoplaster och odlade rotceller. Här presenterar vi den optimerade mRNA interaktionsfångningsmetoden för Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplaster, en celltyp som fungerar som ett mångsidigt verktyg för experiment som innefattar olika cellanalyser. Villkoren för optimal proteinutbyte inkluderar mängden startvävnad och varaktigheten av UV-bestrålning. I mRNA bundna proteomet erhållits från ett medium-skala experimentet (10 7-celler), RBP-anordningama noteras att ha RNA-bindningskapacitet befanns vara överrepresenterade, och många nya RBP-anordningama identifierades. Experimentet kan skalas upp (10 9 celler) och den optimerade metoden kan appliceras på andra växtcellstyper och arter för att i stor utsträckning isolera, katalogera och jämföra mRNA-bundna proteomer i växter.

Vi observerade en karakteristisk halo som omger pärlpelleten i CL-provet, i tvättsteg 4.3 med tvättbuffert 2 ( Figur 1B ). Fastän det inte har undersökts kan detta fenomen förmodligen förklaras av interferensen av tvärbundna mRNP-komplex med pärlaaggregation under magnetisk infångning, vilket orsakar ett mer diffust aggregat att bilda. Det indikerar att oligo-d (T) 25- pärlinfångningen var effektiv 14 . <p c...

Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Här presenterar vi ett interaktivt fångstprotokoll applicerat på Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplaster. Denna metod beror kritiskt på in vivo UV-tvärbindning och möjliggör isolering och identifiering av växt-mRNA-bindande proteiner från en fysiologisk miljö.

MRNA-interaktomfångst från plant protoplaster

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Proteinkomplex Affinity Capture från Cryomilled däggdjursceller

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Experimentell design för Laser Microdissection RNA-Seq: Lektionerna från en analys av majs Leaf utveckling

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraktionerad extraktionsmetod för den omfattande analysen av metaboliter, lipider och proteiner från en enda prov

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolering och respiratoriska mätningar av mitokondrier från Arabidopsis thaliana.

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Leaf Spray masspektrometri: En snabb omgivande jonisering teknik för att direkt bedöma metaboliter från växt vävnader

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein utvinning, enzymaktivitet och genuttryck av koffein syntas från växten cellsuspensioner

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Studera Protein Import till kloroplaster som använder Protoplasts

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Fånga och identifiering av RNA-bindande proteiner med hjälp av klick kemi-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) strategi

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Använda i Vitro fluorescens resonans energiöverföring att studera dynamiken i proteinkomplex på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Label-fri immunoprecipitation masspektrometri arbetsflöde för storskalig nukleär Interactome profilering

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...