Name: mrna interactome capture from plant protoplasts
Uploaded: 2017-07-28T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

Geleneksel UV lamba ile donatılmış UV çapraz bağlama cihazını sağlayan Prof. Joris Winderickx&#39;in laboratuvarını kabul ediyoruz. KG, KU Leuven araştırma fonu tarafından desteklenmekte ve FWO hibe G065713N&#39;den destek aldığını onaylamaktadır.

1. Arabidopsis Yaprak Mezofil Protoplast İzolasyonu NOT: Arabidopsis yaprak mezofil protoplastları, Yoo ve diğerleri , 2007 tarafından çeşitli dönüşümleri 40 ile tarif edildiği gibi temel olarak izole edilir. <ol><li> Bitkilerde büyüme <ol><li> Tabakalaşma için yaklaşık 200 Arabidopsis thaliana Col-0 ekotip tohumlarını sterilize edilmiş suda 4 ° C&#39;de karanlıkta 2 gün süreyle bekletin. <...

Mayalar ve insan hücreleri için geliştirilmiş mRNA etkileşim yakalamasını yaprak mezofil protoplastlarına başarılı bir şekilde uyguladık. Yaprak yapraklarındaki başlıca zımpara türü mezofil hücreleridir. Bu yöntemin en büyük avantajı, fizyolojik bir ortamdan proteinleri keşfetmek için in vivo çapraz bağlamayı kullanmasıdır. Bu protokolde, esas olarak birtakım optimize edilmiş deneysel koşulları ( örn., Başlangıç ​​materyali olarak ...

Ökaryotlar, hücresel biyolojik süreçleri korumak için çoklu RNA biyogenez düzenleyici yollarını kullanır. Bilinen RNA türleri arasında mRNA çok çeşitlidir ve proteinlerin ve izoformlarının kodlama kapasitesini taşır 1. PTGR yolu, pre-mRNA&#39;ların 2 , 3&#39;ün kaderini yönlendirir. Farklı gen ailelerinden RBP&#39;ler RNA regülasyonunu kontrol eder ve PTGR&#39;da spesifik mRBPler mRNA&#39;ları doğrudan fiziksel etkileşimler yoluyla yönlendirerek fonksiyonel mRNA&#39;ları oluştururlar. Bu nedenle, tanımlanması ve mRBPs karakterize ve mRNPs son üç yıl .Over hücresel mRNA metabolizması 2 düzenleme anlamak için kritiktir, çeşitli in vitro yöntemler - RNA elektroforetik mobilite kayma (Remsa) analizleri, üstel zenginleştirme deneyleri ile ligandların sistematik evrimi dahil olmak üzere (SELEX), kütüphane türevli yapılara, RNA Bind-n-Seq (RBNS), radyoaktif işaretlenmiş veya nicelikselFloresan RNA bağlama deneyleri, X-ışını kristalografisi ve NMR spektroskopisi 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 - esas olarak memeli hücrelerinden RBP çalışmalarına uygulanmıştır. Bu memeli RBP çalışmalarının sonuçları, yayınlanmış gözlemleri toplayan RNA-bağlayıcı Protein Veri Tabanı (RBPDB) vasıtasıyla aranabilir ( 10) . Bu in vitro yaklaşımlar güçlü araçlar olmasına rağmen, belirli bir RNA dizisi havuzundan bağlı RNA motiflerini belirler ve bu nedenle yeni hedef RNA&#39;ları keşfetme yetenekleri sınırlıdır. Aynı şey, protein dizisinin ve yapısının 15 korunmasına dayanan genom çapında RBP&#39;leri öngörmek için hesaplama stratejileri için de geçerlidir. Bunun üstesinden gelmek için, yeni bir deneysel yöntem haBir RBP&#39;nin etkileşime girdiği RNA motiflerinin tanımlanmasına ve bağlanmanın tam yerinin belirlenmesine izin veren bir dizi kurulmuştur. &quot;Çapraz bağlama ve immüno çökeltme&quot; (CLIP) adı verilen bu yöntem, in vivo UV çapraz bağlanma ve ardından immüno çökeltme 11&#39;den oluşur . Erken yapılan çalışmalar, DNA ve RNA nükleotidlerinin fotoaktifleşmesinin, 245 nm&#39;den daha yüksek uyaran UV dalga boylarında oluşabileceğini göstermiştir. 12: timidin ile reaksiyonu (dT ≥ dC&gt; rU&gt; Re, dA, dG azalma photoreactivity sırasına göre sıralama) tercih görünüyor. 254 nm dalga boyunda (UV-C) UV ışığı kullanarak RNA nükleotidleri ve protein kalıntıları arasındaki kovalent bağların sadece birkaç Angstrom (Å) aralığında oluştuğu gözlemlendi. Dolayısıyla fenomen, RNA ve RBP&#39;nin &quot;sıfır uzunluklu&quot; çapraz bağlanması olarak adlandırılır. Bunu takiben katı bir arındırma işlemi izlenebilir<html> Az arka planla dür 13 , 14 . CLIP&#39;i tamamlayan bir strateji, RBP&#39;lerin manzarasını tanımlamak için protein tanımlaması ile in vivo UV çapraz bağlamayı birleştirmektir. &quot;MRNA etkileşimli yakalama&quot; adı verilen bu yeni deneysel yaklaşımı kullanarak maya hücrelerinden, embriyonik kök hücrelerden (ESC&#39;ler) ve insan hücre çizgilerinden ( örn., HEK293 ve HeLa) izole edilmiş bu tür genom çapında mRNA&#39;ya bağlı proteomlar 18 , 19 , 20 , 21 . Yöntem in vivo UV çapraz bağlanma, ardından mRNP saflaştırması ve MS tabanlı proteomiklerden oluşur. Bu stratejiyi uygulayarak, kanonik olmayan RBD&#39;ler içeren birçok yeni &quot;ay ışığı alan&quot; RBP keşfedildi ve daha fazla proteininin önceden tahmin edildiğinden daha fazla RNA bağlama kapasitesine sahip olduğu netleşti.&quot;&gt; 15 , 16 , 17. Bu yöntemin kullanılması yeni başvurulara ve RBP&#39;leri araştırırken yeni biyolojik soruları cevaplama yeteneğine izin verir Örneğin son zamanlarda yapılan bir araştırma mRNA&#39;ya bağlı proteomun (ana RBP) korunmasını araştırmıştır Proteom) maya ve insan hücreleri arasında 22 . Bitki RBP&#39;leri, büyümede ve gelişmede ( örneğin , çiçeklenme zamanının transkripsiyon sonrası düzenlenmesinde, sirkadyere ait saatte ve mitokondriyum ve kloroplastlarda gen ifadesi gibi) 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 . Dahası, abiyotik streslere ( örn. Soğuk, kuraklık, sönümlenme) yanıt veren hücresel süreçlerde işlevleri yerine getirdiği düşünülmektedirLinity ve absisik asit (ABA)) 31 , 32 , 33 , 34&#39;tür . Arabidopsis thaliana genomunda RNA tanıma motifi (RRM) ve K homoloji (KH) alan dizisi motiflerine dayanan 200&#39;den fazla tahmini RBP geni vardır; Pirinçte yaklaşık 250, 35 , 36 olarak kaydedildi. Birçok tahmin RBPS birçok yeni fonksiyonlara hizmet verdiği düşündüren 35 (RRM alanını içeren tahmin Arabidopsis RBPS yaklaşık% 50&#39;ye örneğin hiçbir metazoan ortologlarıyla) bitkilere özgü olduğu söylenemez dikkat çekicidir. Tahmini RBP&#39;lerin çoğu işlevleri tanımlanmamış halde kalır 23 . Arabidopsis etiylü fidelerden, yaprak dokusundan, kültür kök hücrelerinden ve yaprak mezofil protoplastlarından mRNA&#39;ya bağlı proteomların izolasyonu,mRNA interaktom yakalama geçenlerde, 39 38 bildirilmiştir. Bu çalışmalar, yakın gelecekte bitkilerde fonksiyonel RBP&#39;lerin sistematik olarak kataloglanmasının güçlü potansiyelini ortaya koymaktadır. Burada, bitki protoplastlarından ( yani, hücre duvarları olmayan hücrelerden) mRNA interaksiyonu yakalamak için bir protokol sunuyoruz. Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastları, en önemli yaprak hücresi türüdür. İzole edilmiş protoplastlar, UV ışığının hücrelere en iyi şekilde erişilmesine izin verir. Bu hücre tipi, fonksiyonel karakterizasyon için proteinleri geçici olarak ifade eden tahlillerde kullanılabilir 40 , 41 . Ayrıca protoplast, birkaç diğer bitki hücre türüne ve tür 42 , 43 , 44&#39;e uygulanmıştır ( örneğin, Petersson ve diğerleri , 2009; Bargmann ve Birnbaum, 2010; ve Hong ve ark ., 2012). &lt;P class = &quot;jove_content&quot;&gt; Yöntem toplam 11 basamağı kapsamaktadır ( Şekil 1A ). Arabidopsis yaprak mezofil protoplastları önce izole edilir (aşama 1) ve sonra çapraz bağlanmış mRNP&#39;leri oluşturmak için UV ışınlarına maruz bırakılır (aşama 2). Protoplastlar denatüre edici şartlar altında parçalandığında (basamak 3), çapraz bağlanmış mRNPler liziz / bağlama tamponunda serbest bırakılır ve oligo-d (T) 25 boncuklar tarafından çekilir (adım 4). Sıkı yıkamalar birkaç tur sonra, mRNPs saflaştırılmış ve daha da analiz edilir. MRBP&#39;lerin denatüre peptitleri, çapraz bağlı mRNA&#39;lar saflaştırılmadan ve RNA kalitesi qRT-PCR ile doğrulanmadan önce proteinaz K ile sindirilir (adımlar 5 ve 6). RNaz işlemi ve protein konsantrasyonundan (7. adım) sonra, protein kalitesi SDS poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve gümüş boyama (adım 8) ile kontrol edilir. Protein band örüntülerindeki fark, çapraz bağlı bir numune (CL) ile çapraz bağlanmamış bir numune (CL olmayan;UV ışınlamasına tabi tutulmayan protoplastlardan gelen negatif kontrol örneği). Proteinlerin tanımlanması, MS tabanlı proteomikler aracılığıyla gerçekleştirilir. CL örneğinden gelen proteinler olası arka plan kontaminasyonunu gidermek için tek boyutlu poliakrilamid jel elektroforezi (1D-PAGE) ile ayrılır, tripsin kullanılarak kısa peptidlere &quot;in-jel ile sindirilir&quot; ve saflaştırılır (adım 9). Nano ters faz sıvı kromatografisi, kütle spektrometrisine (nano-LC-MS) bağlı olarak, mRNA&#39;ya bağlı proteomdaki kesin protein miktarının belirlenmesine olanak tanır (basamak 10). Son olarak tanımlanan mRNA&#39;lar, biyoenformatik analiz (adım 11) kullanılarak karakterize edilir ve kataloglanır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.8 M Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1902-500G</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M KCl</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>Art. 4935</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution &#38; 
			W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 M MES (pH 5.7) 
			(4-morpholineethanesulfonic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>M2933</td>
			<td>Primary isotonic Enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			MMg solution, 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellulase R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>CELLULASE 
			&#8220;ONOZUKA&#8221; 
			R-10, 10 g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Macerozyme R10</td>
			<td>Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.</td>
			<td>MACEROZYME R-10, 10g</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% (w/v) BSA 
			(Bovine Serum Albumin)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>A7906-100G</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M CaCl2</td>
			<td>Chem-Lab NV</td>
			<td>CL00.0317.1000</td>
			<td>Final isotonic enzyme solution, 
			W5 buffer &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NaCl</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>S/3160/60</td>
			<td>W5 buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2M MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>MMg solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M LiCl 
			(Lithium Chloride)</td>
			<td>Acros</td>
			<td>199885000</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2 &#38; 
			Low salt buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5% (w/v) LiDS 
			(Lithium Dodecyl Sulphate)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>L4632-25G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Filtration sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M DTT 
			(Dithiothreitol)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific 
			Wash buffer 1 &#38; 
			Wash buffer 2</td>
			<td>307866</td>
			<td>Lysis/binding buffer,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl))</td>
			<td>Acros &#38; 
			Fisher Chemical</td>
			<td>167620010 &#38; 
			H/1200/PB15</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>ED-500G</td>
			<td>Lysis/binding buffer, 
			Wash buffer 1, 
			Wash buffer 2, 
			Low salt buffer &#38; 
			Elution buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>8.22184.0500</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1 M NaOH</td>
			<td>VWR PROLABO CHEMICALS</td>
			<td>28244.295</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS (pH 7.4) 
			(Phosphate Buffered Saline) 
			containing 
			(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)</td>
			<td>Fisher Chemical, MERCK, 
			Sigma-aldrich &#38; SAFC</td>
			<td>S/3160/60, 
			Art. 4935, 
			71640-250G &#38; 
			60230</td>
			<td>Regeneration of oligo-d(T)25 beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K solution (2 &#956;g/&#956;L)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>11789020</td>
			<td>Protein digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading dye</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC5925</td>
			<td>SDS-PAGE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>qPCR master mix</td>
			<td>Promega</td>
			<td>A6001</td>
			<td>qRT-PCR assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase Cocktail</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>AM2286</td>
			<td>RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>322415</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>537020</td>
			<td>Gel fixation and gel destaining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>20278</td>
			<td>Gel staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M NH4HCO3 
			(Ammonium bicarbonate) 
			&#160;</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>09830-500G</td>
			<td>Gel hydration &#38; 
			Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CH3CN 
			(Acetonitrile)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>34851-100ML</td>
			<td>Gel dehydration &#38; 
			Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IAA 
			(Iodoacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>I4386-10G</td>
			<td>Alkylating agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TFA 
			(Trifluoroacetic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>302031-10X1ML</td>
			<td>Peptide dissolving solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FA 
			(Formic acid)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>06554-5G</td>
			<td>Peptide extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin solution (6 ng/&#956;L)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5280</td>
			<td>Digestion buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soil</td>
			<td>Peltracom</td>
			<td>LP2D</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vermiculite 3</td>
			<td>Sibli AS</td>
			<td>05VERMICULIET</td>
			<td>Plant growth</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish (150 x 20 mm)</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SE2M229104</td>
			<td>Homogenization of final isotonic enzyme solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razorblade</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>T585</td>
			<td>Rosette leaf strips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-75 &#956;m nylon mesh</td>
			<td>SEFAR NITEX</td>
			<td>74010</td>
			<td>Protoplast suspension filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL round bottom tubes</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T1918-10EA</td>
			<td>Carrier for protoplast suspension</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer 
			(B&#252;rker hemocytometer)</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td>650030</td>
			<td>Protoplast cell counting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV crosslinking apparatus 
			(HL-2000 HybriLinker)</td>
			<td>UVP, LLC</td>
			<td>UVP95003101</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp 
			(Sankyo-Denki G8T5)</td>
			<td>SANKYO 
			DENKI</td>
			<td>SD G8T5</td>
			<td>in vivo UV crosslinking</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL glass syringe</td>
			<td>FORTUNA Optima</td>
			<td>Z314560</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Narrow needle (0.9 x 25 mm)</td>
			<td>Becton Dickinson microlance 3</td>
			<td>2021-04</td>
			<td>Homogenization of protoplast lysate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Model L26</td>
			<td>Labinco BV</td>
			<td>26110912</td>
			<td>Sample incubation by rotating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oligo-d(T)25 magnetic beads 
			(5 mg/mL)</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>S1419S</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>CS15000</td>
			<td>mRNPs and mRNAs binding and pull-down</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal filter units 
			(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>UFC800308</td>
			<td>mRBP concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td>Silver-staining assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA purification kit 
			(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)</td>
			<td>STRATEC Molecular</td>
			<td>1064100300</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td>RNA quality and quantity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR cycler 
			(StepOne Real-Time PCR cycler)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4376600</td>
			<td>cDNA quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-C18 columns 
			(Millipore Zip Tip &#181;-C18 columns)</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>720046-960EA</td>
			<td>Peptide purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spectrometer 
			(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMAZR</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ULTIM3000RSLCNANO</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 column 
			(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>ES800</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C18 precolumn 
			(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>160321</td>
			<td>Mass spectrometry-based proteomics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers for qRT-PCR assay</td>
			<td colspan="3">Sequences</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UBQ10 mRNA 
			(Li et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG 
			Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18S rRNA 
			(Durut et al., 2014)</td>
			<td colspan="3">Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG 
			Rv: CACGACCCGGCCAATTA</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mrna interactome capture from plant protoplasts

RNA bağlayıcı proteinler (RBPler) RNA&#39;ların kaderini belirler. Bütün RNA biyogenez yollarına katılırlar ve özellikle haberci RNA&#39;ların (mRNA&#39;lar) post-transkripsiyonel gen regülasyonuna (PTGR) katkıda bulunurlar. Son birkaç yılda, maya ve memeli hücresi soylarından elde edilen bir dizi mRNA&#39;ya bağlı proteom, &quot;mRNA etkileşimli yakalama&quot; adı verilen ve mRNA&#39;ya bağlanan proteinlerin (mRBP&#39;lerin) tanımlanmasına izin veren yeni bir yöntem kullanılarak başarıyla izole edilmiştir. Doğrudan bir fizyolojik ortamdan. Yöntem in vivo ultraviyole (UV) çapraz bağlama, oligon (dT) boncuklar ile haberci ribonükleoprotein komplekslerinin (mRNPs) aşağı çekilmesi ve saflaştırılması ve ardından kütle spektrometresi (MS) ile çapraz bağlanmış proteinlerin tanımlanmasından oluşur. Çok yakın bir tarihte, aynı yöntemi uygulayarak, çeşitli Arabidopsis doku kaynaklarına eşzamanlı olarak birkaç bitki mRNA&#39;ya bağlı proteom rapor edilmiştir: etiyole edilmiş fideler, yaprak dokusu,Yaprak mezofil protoplastları ve kültür kökü hücreleri. Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastları için optimize edilmiş mRNA etkileşimli yakalama yöntemini sunuyoruz. Bu hücre türü, çeşitli hücresel tahliller içeren deneyler için çok yönlü bir araç olarak hizmet etmektedir. Optimum protein verimi için koşullar, başlangıç ​​dokusu miktarını ve UV ışınlama süresini içerir. Orta ölçekli bir deneyden (10 7 hücre) elde edilen mRNA&#39;ya bağlı proteomda, RNA bağlama kapasitesine sahip olduğu kaydedilen RBP&#39;lerin aşırı temsil edildiği bulundu ve birçok yeni RBP tespit edildi. Deney ölçeklenebilir (10 9 hücre) ve optimize yöntem, bitkilerdeki mRNA bağlı proteomları geniş ölçüde izole etmek, kataloglamak ve karşılaştırmak için diğer bitki hücre tiplerine ve türüne uygulanabilir.

CL örneğinde boncuk taneciklerini çevreleyen, yıkama basamağı 4.3&#39;de yıkama tamponu 2 ile ( Şekil 1B ) karakteristik bir halo gözlemledik. Araştırılmamış olmasına rağmen, bu fenomen manyetik yakalama esnasında boncuk agregasyonu ile çapraz bağlanmış mRNP komplekslerinin etkileşimi ile muhtemelen açıklanabilir ve daha yaygın bir agreganın oluşmasına neden olur. Oligo-d (T) 25 boncuk yakalama etkisinin <sup class="xre...

Watch this Scientific Journal Video about mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts at JoVE.com

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA&#39;ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells

Cryomilled memeli hücrelerinden protein kompleksi olan ele geçirme kapasitesini

Affinity capture is an effective technique for isolating endogenous protein complexes for further study. When used in conjunction with an antibody, this ...

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Lazer Diseksiyon RNA Sek için Deneysel Tasarım: Mısır Yaprak Kalkınma bir Analiz Dersler

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Tek Bir Numuneden Metabolitlerin, Lipidlerin ve Proteinlerin Kapsamlı Analizi için Basit Fraksiyonlu Ekstraksiyon Metodu

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Yalıtım ve solunum ölçümleri mitokondri Arabidopsis thaliana üzerinden

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Yaprak sprey kütle spektrometresi: Doğrudan metabolitleri bitki doku üzerinden değerlendirmek için bir hızlı ortam iyonlaşma tekniği

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Kafein ayıklama, enzimatik aktivite ve kafein Synthase bitki hücre kullanılamaz hale gelen gen ifadesi

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Studying Protein Import into Chloroplasts Using Protoplasts

Önceki kullanarak kloroplast eğitim Protein içe aktarma işlemi

The chloroplast is an essential organelle that is responsible for various cellular processes in plants, such as photosynthesis and the production of many ...

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture (CARIC) Strategy

Capture and Identification of RNA-binding Proteins by Using Click Chemistry-assisted RNA-interactome Capture CARIC Strategy

Yakalama ve tıklama Kimya destekli RNA-interactome kullanarak RNA bağlanıcı proteinler tanımlaması (CARIC) strateji yakalama

A comprehensive identification of RNA-binding proteins (RBPs) is key to understanding the posttranscriptional regulatory network in cells. A widely used ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

Label-Free Immunoprecipitation Mass Spectrometry Workflow for Large-scale Nuclear Interactome Profiling

Büyük Ölçekli Nükleer Etkileşimom Profilleme için Etiketsiz İmmünoprekütle Spektrometresi İş Akışı

Immunoaffinity purification mass spectrometry (IP-MS) has emerged as a robust quantitative method of identifying protein-protein interactions. This ...