Name: a filtration-based method of preparing high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle for chromatin immunoprecipitation
Uploaded: 2017-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation at JoVE.com

نشكر كارين إسر، نوبويا كويكي و نوهيون بارك للحصول على المشورة المفيدة. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة / نيغمس (R01GM114424) ل S.-هي، ومؤسسة روبرت A. ويلش (أو-1731) و نيه / نيا (R01AG045828) إلى زك

تم تنفيذ رعاية الحيوان بموجب المبادئ التوجيهية المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام اللجنة (إاكوك)، وأجريت الإجراءات وفقا لبروتوكول الحيوان التي وافق عليها مركز العلوم الصحية جامعة تكساس في هيوستن. 1. عزل النوى من الصليب-- مرتبطة العض?...

<ol>
	<li>Bouzakri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA-based+gene+silencing+reveals+specialized+roles+of+IRS-1/Akt2+and+IRS-2/Akt1+in+glucose+and+lipid+metabolism+in+human+skeletal+muscle.">siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle.</a> Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).</li><li>Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+receptor+signaling+in+normal+and+insulin-resistant+states.">Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).</li><li>Green, C. B., Takahashi, J. S., Bass, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+meter+of+metabolism.">The meter of metabolism.</a> Cell. 134 (5), 728-742 (2008).</li><li>Liu, A. C., Lewis, W. G., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+circadian+signaling+networks+and+therapeutic+targets.">Mammalian circadian signaling networks and therapeutic targets.</a> Nat Chem Biol. 3 (10), 630-639 (2007).</li><li>Harfmann, B. D., Schroder, E. A., Esser, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+rhythms,+the+molecular+clock,+and+skeletal+muscle.">Circadian rhythms, the molecular clock, and skeletal muscle.</a> J Biol Rhythms. 30 (2), 84-94 (2015).</li><li>Nohara, K., Yoo, S. H., Chen, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulating+the+circadian+and+sleep+cycles+to+protect+against+metabolic+disease.">Manipulating the circadian and sleep cycles to protect against metabolic disease.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 6, 35 (2015).</li><li>Harfmann, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscle-specific+loss+of+Bmal1+leads+to+disrupted+tissue+glucose+metabolism+and+systemic+glucose+homeostasis.">Muscle-specific loss of Bmal1 leads to disrupted tissue glucose metabolism and systemic glucose homeostasis.</a> Skelet Muscle. 6, 12 (2016).</li><li>Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscles,+exercise+and+obesity:+skeletal+muscle+as+a+secretory+organ.">Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ.</a> Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).</li><li>Solomon, M. J., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde-mediated+DNA-protein+crosslinking:+a+probe+for+in+vivo+chromatin+structures.">Formaldehyde-mediated DNA-protein crosslinking: a probe for in vivo chromatin structures.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (19), 6470-6474 (1985).</li><li>Jackson, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+on+histone+organization+in+the+nucleosome+using+formaldehyde+as+a+reversible+cross-linking+agent.">Studies on histone organization in the nucleosome using formaldehyde as a reversible cross-linking agent.</a> Cell. 15 (3), 945-954 (1978).</li><li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo:+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes.">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li><li>Takahashi, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+RNA-seq+methods+to+study+circadian+control+of+transcription+in+mammals.">ChIP-seq and RNA-seq methods to study circadian control of transcription in mammals.</a> Methods Enzymol. 551, 285-321 (2015).</li><li>Kuo, M. H., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cross-linking+and+immunoprecipitation+for+studying+dynamic+Protein:DNA+associations+in+a+chromatin+environment.">In vivo cross-linking and immunoprecipitation for studying dynamic Protein:DNA associations in a chromatin environment.</a> Methods. 19 (3), 425-433 (1999).</li><li>Chen, Z., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core+promoter+elements+and+TAFs+contribute+to+the+diversity+of+transcriptional+activation+in+vertebrates.">Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates.</a> Mol Cell Biol. 23 (20), 7350-7362 (2003).</li><li>Menet, J. S., Abruzzi, K. C., Desrochers, J., Rodriguez, J., Rosbash, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+PER+repression+mechanisms+in+the+Drosophila+circadian+clock:+from+on-DNA+to+off-DNA.">Dynamic PER repression mechanisms in the Drosophila circadian clock: from on-DNA to off-DNA.</a> Genes Dev. 24 (4), 358-367 (2010).</li><li>Miki, T., Matsumoto, T., Zhao, Z., Lee, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+regulates+Period2+expression+and+the+circadian+clock.">p53 regulates Period2 expression and the circadian clock.</a> Nat Commun. 4, 2444 (2013).</li><li>Furey, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+and+beyond:+new+and+improved+methodologies+to+detect+and+characterize+protein-DNA+interactions.">ChIP-seq and beyond: new and improved methodologies to detect and characterize protein-DNA interactions.</a> Nat Rev Genet. 13 (12), 840-852 (2012).</li><li>Koike, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+architecture+and+chromatin+landscape+of+the+core+circadian+clock+in+mammals.">Transcriptional architecture and chromatin landscape of the core circadian clock in mammals.</a> Science. 338 (6105), 349-354 (2012).</li><li>Zhou, J., Yu, W., Hardin, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIPping+away+at+the+Drosophila+clock.">ChIPping away at the Drosophila clock.</a> Methods Enzymol. 551, 323-347 (2015).</li><li>Takahashi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+architecture+of+the+mammalian+circadian+clock.">Transcriptional architecture of the mammalian circadian clock.</a> Nat Rev Genet. , (2016).</li><li>Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+skeletal+muscle+nuclei.">Isolation of skeletal muscle nuclei.</a> J Cell Biol. 27 (2), 365-377 (1965).</li><li>Ohkawa, Y., Mallappa, C., Vallaster, C. S., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+nuclei+from+skeletal+muscle+satellite+cells+and+myofibers+for+use+in+chromatin+immunoprecipitation+assays.">Isolation of nuclei from skeletal muscle satellite cells and myofibers for use in chromatin immunoprecipitation assays.</a> Methods Mol Biol. 798, 517-530 (2012).</li><li>Wilkie, G. S., Schirmer, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+nuclei+and+preparation+of+nuclear+envelopes+from+skeletal+muscle.">Purification of nuclei and preparation of nuclear envelopes from skeletal muscle.</a> Methods Mol Biol. 463, 23-41 (2008).</li><li>Hahn, C. G., Covault, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+transcriptionally+active+nuclei+from+striated+muscle+using+Percoll+density+gradients.">Isolation of transcriptionally active nuclei from striated muscle using Percoll density gradients.</a> Anal Biochem. 190 (2), 193-197 (1990).</li><li>Jeong, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+attenuation+of+proteasomal+and+autophagic+BMAL1+degradation+in+Clock+Delta19/++mice+contributes+to+improved+glucose+homeostasis.">Dual attenuation of proteasomal and autophagic BMAL1 degradation in Clock Delta19/+ mice contributes to improved glucose homeostasis.</a> Scientific reports. 5, 12801 (2015).</li><li>Nohara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ammonia-lowering+activities+and+carbamoyl+phosphate+synthetase+1+(Cps1)+induction+mechanism+of+a+natural+flavonoid.">Ammonia-lowering activities and carbamoyl phosphate synthetase 1 (Cps1) induction mechanism of a natural flavonoid.</a> Nutrition &amp; metabolism. 12, 23 (2015).</li><li>Zhang, L., Rubins, N. E., Ahima, R. S., Greenbaum, L. E., Kaestner, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Foxa2+integrates+the+transcriptional+response+of+the+hepatocyte+to+fasting.">Foxa2 integrates the transcriptional response of the hepatocyte to fasting.</a> Cell Metab. 2 (2), 141-148 (2005).</li><li>Gade, P., Kalvakolanu, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+assay+as+a+tool+for+analyzing+transcription+factor+activity.">Chromatin immunoprecipitation assay as a tool for analyzing transcription factor activity.</a> Methods Mol Biol. 809, 85-104 (2012).</li><li>Kondratov, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BMAL1-dependent+circadian+oscillation+of+nuclear+CLOCK:+posttranslational+events+induced+by+dimerization+of+transcriptional+activators+of+the+mammalian+clock+system.">BMAL1-dependent circadian oscillation of nuclear CLOCK: posttranslational events induced by dimerization of transcriptional activators of the mammalian clock system.</a> Genes Dev. 17 (15), 1921-1932 (2003).</li><li>Ripperger, J. A., Schibler, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rhythmic+CLOCK-BMAL1+binding+to+multiple+E-box+motifs+drives+circadian+Dbp+transcription+and+chromatin+transitions.">Rhythmic CLOCK-BMAL1 binding to multiple E-box motifs drives circadian Dbp transcription and chromatin transitions.</a> Nat Genet. 38 (3), 369-374 (2006).</li><li>Laplante, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DEPTOR+cell-autonomously+promotes+adipogenesis,+and+its+expression+is+associated+with+obesity.">DEPTOR cell-autonomously promotes adipogenesis, and its expression is associated with obesity.</a> Cell Metab. 16 (2), 202-212 (2012).</li><li>Blechman, J., Amir-Zilberstein, L., Gutnick, A., Ben-Dor, S., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolic+regulator+PGC-1alpha+directly+controls+the+expression+of+the+hypothalamic+neuropeptide+oxytocin.">The metabolic regulator PGC-1alpha directly controls the expression of the hypothalamic neuropeptide oxytocin.</a> J Neurosci. 31 (42), 14835-14840 (2011).</li></ol>

نحن هنا وصف طريقة قوية حيث تم ربط الأنسجة العضلية الهيكلية عبر ربط لعزل نوى عالية الجودة. وقد أجريت الترشيح متسلسل من لفصل نواة فعالة من الحطام، والطاقة الصوتية بالموجات فوق الصوتية من محول على شكل طبق قص الكروماتين لتحليل رقاقة. وأظهرت النتائج ملاحق زمنية محددة في ا...

العضلات الهيكلية تلعب أدوارا مهمة في علم وظائف الأعضاء والسلوك. تتكون الألياف العضلية متعددة الأنوية من الليفي العضلي حيث وحدات أكتين وميوسين وظيفية تسمى ساركوميريز لتوليد قوة مقلص. العضلات والهيكل العظمي هو أيضا أكبر جهاز التمثيل الغذائي في الجسم، وهو ما يمثل&gt; 80٪ تناول الجلوكوز بعد الأكل وتنظيم استجابة الأنسولين والتمثيل الغذائي التمثيل الغذائي 1 ، 2 . وينظم علم وظائف الأعضاء العضلات والتمثيل الغذائي عن كثب من قبل الساعة البيولوجية، وهو توقيت البيولوجي الجوهري 3 ، 4 ، 5 ، 6 . على سبيل المثال، أدى الحذف الخاص بالهيكل العظمي الخاص بالعضلات Bmal1 ، أحد مكونات الساعة اليومية الأساسية، إلى مقاومة الإنسولين وانخفاض امتصاص الجلوكوز في العضلات الهيكلية، وتم العثور على الحيوانات لتطوير داء السكري من النوع الثاني 7 . أنان بالإضافة إلى ذلك، يتم أيضا على نحو متزايد يجري تقدير العضلات والهيكل العظمي باعتباره جهاز الغدد الصماء 8 ، إفراز ميوكينس لتنظيم الأيض النظامية وعلم وظائف الأعضاء. مطلوب دراسات آلية لفهم كامل هذه الوظائف التنظيمية في العضلات والهيكل العظمي. رقاقة هو نهج قوي لتحديد مروج توظيف الحمض النووي ملزم البروتينات. تم تطوير رقاقة في البداية لتحديد منظمة نوكليوسوم على الحمض النووي الكروماتين 9 ، 10 . وقد تم الإبلاغ عن مجموعة متنوعة من الأساليب لربط عبر البروتينات والحمض النووي الكروماتين باستخدام الفورمالديهايد، كبريتات ثنائي ميثيل أو الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) 11 ، 12 . الفورمالديهايد عبر ربط هو الأكثر استخداما، والحفاظ على بنية الكروماتين والتفاعلات الحمض النووي البروتين 9 ، 13 ، 14 . كرومات متصالبةفي تمزيقه بواسطة سونيكاتيون و إمونوبريسيبيتاتد مع الأجسام المضادة ضد بروتين ملزمة الحمض النووي محددة من الفائدة 15 ، 16 . في السنوات الأخيرة، تم تطوير رقاقة رقاقة (تشيب-سيق)، وهي طريقة تجمع بين رقاقة مع نغس، لاستجواب عامل النسخ على نطاق الجينوم ملزمة 17 ، وفي بعض الحالات لمراقبة التغيرات الديناميكية على مدى دورة بالطبع 18 ، 19 ، 20 . على سبيل المثال، وقد كشفت الدراسات التي أجريت على رقاقة تشيق سيقان جدا تسلسل مدبرة للغاية من ملزمة الجينومية لمكونات الساعة البيولوجية الساعة هيستون علامات، والذي يدفع مؤقتا التعبير الجيني دقيقة طوال دورة 24 ساعة ~ ساعة البيولوجية 18 . تم تصميم معظم بروتوكولات رقاقة المتاحة للأنسجة الرخوة ( مثل الكبد والدماغ، وما إلى ذلك )، وعدد قليل جدا تم نشرها للأنسجة الصلبة بما في ذلك سكيلالعضلات. فمن الناحية الفنية تحدي تجانس الألياف الغنية بالهيكل العظمي العضلات وعزل نوى عالية الجودة 21 ، وخاصة بالنسبة للتجارب رقاقة التي تتطلب عبر ربط. في دراسة رقاقة العضلات الأخيرة 22 ، تم فصل الخلايا الأقمار الصناعية من ميوفيبرز، وأعدت نويات من كل من أنواع الخلايا من خلال إجراء لفترات طويلة تنطوي على هضم الأنسجة. استغرقت العملية برمتها حوالي ثلاث ساعات لإكمال قبل الفورمالديهايد عبر ربط تم تنفيذها على نوى معزولة. في حين تجنب هذا الإجراء عبر ربط الألياف العضلية، مما يجعل الأنسجة العضلية أكثر صهر إلى التجانس كفاءة، وكان قادرا على إنتاج نوى ذات جودة عالية، والتخلف الوقت كبير من جمع الأنسجة إلى نوى عبر ربط يتكبد خطر الحمض النووي المتغير -البروتين التفاعل. في المقابل، أجرى معظم الدراسات عبر ربط مباشرة بعد العلاج التجريبي أو جمع الأنسجة من أجل الحفاظ على الوقت الحقيقي الحمض النووي بروتين ملزمة 12 . والعيب الثاني لعزل النوى قبل الربط المتبادل هو أنه يحول دون تطبيقات حساسة للوقت مثل جمع العينات البيولوجية التي تحدث عادة على فترات تتراوح بين 3 و 4 ساعات. دون ربط عبر النوى، والعزلة يحتاج إلى الشروع فورا بعد تشريح، في حين يمكن معالجة عينات عبر ربط معا بعد اكتمال بالطبع كامل الوقت، وبالتالي ضمان الاتساق التجريبي أكبر. كما تم الإبلاغ عن بروتوكولات أخرى للعزل النوى من العضلات والهيكل العظمي أونكروسلينكد. وقد وصفت دراستان استخدام تنظير فائق التدرج لفصل نوى من الخلايا الليفية المتبقية والحطام الخلية 23 ، 24 . في حين أن السكروز أو الغروية التدرج النابض للضوء فعالة مع أنسجة العضلات أونكروسلينكد، كشفت تجاربنا أنه بعد التشابك، فشلت الطرد المركزي التدرج التدريجي لفصل نوى من الخلية دإبريس، عن، ال التعريف، التدرج. ولذلك وضعنا إجراء لعزل نوى ذات جودة عالية باستخدام عبر ربط الماوس العضلات والهيكل العظمي الأنسجة. بدلا من التدرج الطرد المركزي، وضعنا طريقة الترشيح التسلسلي لفصل فعال نوى من الحطام. بعد أولتراسونيكاتيون، تم تطبيق عينات لونين بنجاح لدراسات رقاقة التي أظهرت نمط الساعة البيولوجية من البروتين BMAL1 ملزمة لمروجي الهدف. طريقة لدينا يمكن تطبيقها على نطاق واسع لمختلف الدراسات الميكانيكية من أنسجة العضلات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="765">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Materials</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Formaldehyde solution</td>
			<td style="width:143px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8775&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Trypan Blue solution (0.4%)</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">RNase A</td>
			<td style="width:143px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10109142001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Protease K</td>
			<td style="width:143px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">3115887001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Chicken Anti-BMAL1 antibody</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:288px;">Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318-579, and IgY was affinity purified using the same antigen.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Chicken IgY Precipitating Resin</td>
			<td style="width:143px;">GenScript</td>
			<td style="width:119px;">L00405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Equipment</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">KINEMATICA&#160;Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-451-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">15mL Dounce tissue grinder</td>
			<td style="width:143px;">Whearton</td>
			<td style="width:119px;">357544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Falcon Cell Strainers 100&#181;m</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Falcon Cell Strainers 70&#181;m</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Falcon Cell Strainers 40&#181;m</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">pluriStrainer 30 &#181;m</td>
			<td style="width:143px;">PluriSelect</td>
			<td style="width:119px;">43-50030-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">pluriStrainer 20 &#181;m</td>
			<td style="width:143px;">PluriSelect</td>
			<td style="width:119px;">43-50020-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">pluriStrainer 10 &#181;m</td>
			<td style="width:143px;">PluriSelect</td>
			<td style="width:119px;">43-50010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Covaris S2 Focused-ultrasonicator</td>
			<td style="width:143px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">Model S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Labquake&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C415110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCD Microscope Camera</td>
			<td>&#160;Leica Microsystems</td>
			<td>DFC3000 G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Reagent Kit</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">DNA extraction kit</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Buffers</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:216px;">All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a filtration-based method of preparing high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle for chromatin immunoprecipitation

الكروماتين مناعي (رقاقة) هو وسيلة قوية لتحديد البروتين ملزم الحمض النووي الكروماتين. ومع ذلك، فقد كانت العضلات الهيكلية الغنية بالألياف تحديا ل تشيب بسبب صعوبة تقنية في عزل نوى ذات جودة عالية مع الحد الأدنى من التلوث من ميوفيبريلز. وقد حاولت البروتوكولات السابقة لتنقية النوى قبل عبر ربط، مما يتكبد خطر تغير التفاعل الحمض النووي البروتين خلال عملية إعداد النوى لفترات طويلة. في البروتوكول الحالي، ونحن أولا عبر ربط الأنسجة العضلية والهيكل العظمي التي تم جمعها من الفئران، وكانت مفروم الأنسجة و سونيكاتد. منذ وجدنا أن تنبيذ فائق لم يكن قادرا على فصل نوى من ميوفيبريلز باستخدام الأنسجة العضلية عبر ربط، وضعنا إجراء الترشيح متتابعة للحصول على نوى عالية الجودة خالية من التلوث ميوفيبريل كبير. أعدنا في وقت لاحق لونين باستخدام أولتراسونيكاتور، ومقايسات رقاقة مع مكافحة الأجسام المضادة BMAL1 كشف قوية الإيقاعية ملزمةنمط BMAL1 لاستهداف المروجين الجينات. ويشكل بروتوكول الترشيح هذا طريقة قابلة للتطبيق بسهولة لعزل نوى عالية الجودة من الأنسجة العضلية الهيكلية عبر ربط، مما يسمح معالجة عينة متسقة للدراسات الساعة البيولوجية الحساسة وغيرها من الوقت. في تركيبة مع الجيل المقبل من التسلسل (نغس)، ويمكن نشر طريقتنا لمختلف الدراسات الميكانيكية والجينومية مع التركيز على وظيفة العضلات والهيكل العظمي.

<html> هنا أجرينا الفورمالديهايد عبر ربط مباشرة بعد جمع الأنسجة للحفاظ على الوقت الحقيقي التفاعل الحمض النووي البروتين. ومع ذلك، وجدنا أن السكروز أو الغروية التدرج، وتستخدم عادة لعزل النوى 23 ، 24 ، لم يكن فعالا في فصل نوى...

Watch this Scientific Journal Video about A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation at JoVE.com

A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

نقدم بروتوكول القائمة على الترشيح لعزل نوى ذات جودة عالية من عبر ربط الماوس العضلات والهيكل العظمي حيث أزلنا الحاجة لتنبيذ فائق، مما يجعلها قابلة للتطبيق بسهولة. وتبين لنا أن الكروماتين أعدت من نوى مناسبة للكروماتين مناعي ودراسات تسلسل مناعي لونين المرجح.

A طريقة الترشيح القائم على إعداد نوى عالية الجودة من عبر ربط العضلات والهيكل العظمي للكروماتين مناعي

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

مقاربة سطحية وكفاءة لإنتاج المذيلات عكسية ثاني كبريتيد عبر ربط

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

وهناك طريقة استخراج مجزأة بسيطة للتحليل الشامل من الأيض، والليبيدات، والبروتينات من عينة واحدة

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

تحسين بروتوكول إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين من الماوس الهيكل العظمى والعضلات

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

تنشيط عبر مرتبطة Agarose للتنمية السريعة من الراتنجات الكروماتوغرافيا تقارب - التقاط الأجسام المضادة كدراسة حالة

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

القياس الكمي لديناميات شبكة تفاعل البروتين باستخدام الترسيب المناعي المشترك المتعدد

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

إعداد منتجات الأسماك المخمرة عالية الجودة

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

الحصول على بيانات النسخ عالية الجودة من بذور الحبوب من خلال طريقة معدلة لتنميط التعبير الجيني

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

تحضير الصفائح من العينات البيولوجية الزجاجية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ثنائي الحزمة للتصوير المقطعي الإلكتروني بالتبريد

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

قياس قدرة استيراد البروتين للميتوكوندريا العضلية الهيكلية

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

القياس الكمي لتوزيع الجليكوجين تحت الخلوي في ألياف العضلات الهيكلية باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...