Name: a filtration-based method of preparing high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle for chromatin immunoprecipitation
Uploaded: 2017-07-06T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation at JoVE.com

Wir danken Karyn Esser, Nobuya Koike und Noheon Park für hilfsbereite Beratung. Diese Arbeit wurde zum Teil von NIH / NIGMS (R01GM114424) an S.-HY und der Robert A. Welch Foundation (AU-1731) und NIH / NIA (R01AG045828) an ZC unterstützt

Die Tierpflege wurde unter den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) durchgeführt und die Verfahren wurden nach einem Tierprotokoll durchgeführt, das von der University of Texas Health Science Center in Houston genehmigt wurde. 1. Kernisolierung aus vernetzten Skelettmuskeln <ol><li> Wiegen und Hackfleisch-Skelettmuskel, isoliert von etwa 20 Wochen alten C57BL / 6 männlichen Mäusen, in eiskalter Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS), wie im Detail zuv...

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	<li>Bouzakri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA-based+gene+silencing+reveals+specialized+roles+of+IRS-1/Akt2+and+IRS-2/Akt1+in+glucose+and+lipid+metabolism+in+human+skeletal+muscle.">siRNA-based gene silencing reveals specialized roles of IRS-1/Akt2 and IRS-2/Akt1 in glucose and lipid metabolism in human skeletal muscle.</a> Cell Metab. 4 (1), 89-96 (2006).</li><li>Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+receptor+signaling+in+normal+and+insulin-resistant+states.">Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (1), (2014).</li><li>Green, C. B., Takahashi, J. 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Hier beschreiben wir eine robuste Methode, bei der vernetzte Skelettmuskelgewebe verwendet wurden, um qualitativ hochwertige Kerne zu isolieren. Eine sequenzielle Filtration wurde durchgeführt, um die Kerne effektiv von Trümmern zu trennen, und die akustische Ultraschall-Energie aus dem schalenförmigen Wandler scherte das Chromatin für die ChIP-Analyse. Die Ergebnisse zeigten eine zirkadiane zeitspezifische Bindung von BMAL1 an Zielpromotoren. ChIP kann verwendet werden, um Echtzeit-Prot...

Skelettmuskel spielt eine wichtige Rolle in Physiologie und Verhalten. Die mehrkernige Muskelfaser besteht aus Myofibrillen, in denen Aktin und Myosin funktionale Einheiten bilden, die Sarkomere genannt werden, um kontraktile Kraft zu erzeugen. Skelettmuskel ist auch das größte Stoffwechselorgan im Körper, das für&gt; 80% postprandiale Glukoseaufnahme und regulierende Insulinreaktion und metabolische Homöostase 1 , 2 verantwortlich ist . Die Muskelphysiologie und der Stoffwechsel werden durch die zirkadiane Uhr, einen intrinsischen biologischen Timer 3 , 4 , 5 , 6, genau reguliert. Zum Beispiel führte die Skelettmuskelspezifische Deletion von Bmal1 , einer der Kern-zirkadianen Taktkomponenten , zu einer Insulinresistenz und einer verminderten Glukoseaufnahme im Skelettmuskel, und die Tiere wurden gefunden, um Typ-2-Diabetes 7 zu entwickeln . ichNeben der Skelettmuskulatur wird auch zunehmend ein endokrines Organ 8 geschätzt, das Myokine sekretiert, um den systemischen Stoffwechsel und die Physiologie zu regulieren. Mechanistische Studien sind erforderlich, um diese regulatorischen Funktionen im Skelettmuskel vollständig zu verstehen. ChIP ist ein leistungsfähiger Ansatz zur Abgrenzung der Promotorrekrutierung von DNA-bindenden Proteinen. ChIP wurde ursprünglich entwickelt, um die Nukleosomenorganisation auf Chromatin-DNA 9 , 10 zu identifizieren. Es wurde bisher eine Vielzahl von Verfahren zur Vernetzung von Proteinen und Chromatin-DNA unter Verwendung von Formaldehyd, Dimethylsulfat oder Ultraviolettbestrahlung (UV) 11 , 12 beschrieben . Die Formaldehyd-Vernetzung ist die am häufigsten verwendete, konservierende Chromatinstruktur und DNA-Protein-Wechselwirkungen 9 , 13 , 14 . Vernetztes ChromatIn wird durch Beschallung zerkleinert und mit Antikörper gegen das jeweilige DNA-bindende Protein von Interesse 15 , 16 immunpräzipitiert. In den letzten Jahren wurde die ChIP-Sequenzierung (ChIP-seq), eine Methode, die ChIP mit NGS kombiniert, entwickelt, um die genomweite Transkriptionsfaktorbindung 17 zu untersuchen und in einigen Fällen die dynamischen Veränderungen über einen Zeitverlauf 18 , 19 , 20 zu überwachen . Zum Beispiel haben zirkadiane ChIP-seq-Studien eine hochorchestrierte Sequenz der genomischen Bindung von zirkadianen Taktkomponenten und Histonmarkern, die eine zeitlich präzise Genexpression während des gesamten 24h-zirkadischen Zyklus 18 antreibt. Die meisten verfügbaren ChIP-Protokolle sind für Weichgewebe ( zB Leber, Gehirn, etc. ) konzipiert, und nur sehr wenige wurden für harte Gewebe einschließlich Skele veröffentlichtTal muskel Es ist technisch anspruchsvoll, den faserreichen Skelettmuskel zu homogenisieren und die hochwertigen Kerne 21 zu isolieren, insbesondere für ChIP-Experimente, die eine Vernetzung erfordern. In einer neueren Muskel-ChIP-Studie 22 wurden Satelliten-Zellen von Myofasern getrennt, und die Kerne wurden aus beiden Zelltypen durch ein verlängertes Verfahren mit Gewebeverdauung hergestellt. Der gesamte Prozeß dauerte etwa drei Stunden, bis die Formaldehyd-Vernetzung an isolierten Kernen durchgeführt wurde. Während dieses Verfahren eine vernetzte Muskelfaser vermeidet, die das Muskelgewebe für eine effiziente Homogenisierung noch widerstandsfähiger macht und in der Lage war, qualitativ hochwertige Kerne herzustellen, entsteht die signifikante Zeitverzögerung von der Gewebsansammlung zur Keimvernetzung das Risiko einer veränderten DNA -protein-interaktion Im Gegensatz dazu führten die meisten Studien eine Vernetzung unmittelbar nach der experimentellen Behandlung oder Gewebesammlung durch, um das Echtzeit-DNA-Protei zu erhaltenN Bindung 12 Ein zweiter Nachteil der Kerneisolation vor der Vernetzung besteht darin, dass sie zeitempfindliche Anwendungen wie zirkadiane Probensammlungen ausschließt, die typischerweise in Intervallen von 3 - 4 h auftreten. Ohne Vernetzung der Kerne muss die Isolierung unmittelbar nach der Sezierung erfolgen, während vernetzte Proben nach Beendigung des gesamten Zeitverlaufs zusammen verarbeitet werden können, so dass eine größere experimentelle Konsistenz gewährleistet ist. Andere Protokolle für die Kernenisolation aus dem unvernetzten Skelettmuskel wurden ebenfalls berichtet. Zwei Studien beschreiben die Verwendung von Gradienten-Ultrazentrifugation, um Kerne von verbleibenden Myofibrillen und Zelltrümmern 23 , 24 zu trennen. Während die Saccharose- oder Kolloidgradienten-Ultrazentrifugation mit unvernetzten Muskelgeweben wirksam ist, zeigten unsere Experimente, dass nach der Vernetzung die Gradienten-Ultrazentrifugation die Kerne nicht von der Zelle d trennteEbris auf dem gradienten Wir haben daher ein Verfahren entwickelt, um qualitativ hochwertige Kerne unter Verwendung von vernetzten Maus-Skelettmuskelgeweben zu isolieren. Statt der Gradienten-Ultrazentrifugation haben wir eine serielle Filtrationsmethode entwickelt, um die Kerne effektiv von Trümmern zu trennen. Nach der Ultraschallbehandlung wurden die Chromatinproben erfolgreich für ChIP-Studien angewendet, die ein zirkadianes Muster der BMAL1-Proteinbindung an Ziel-Promotoren zeigten. Unsere Methode kann breit auf verschiedene mechanistische Studien von Muskelgeweben anwendbar sein.

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	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Materials</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:288px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Formaldehyde solution</td>
			<td style="width:143px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F8775&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP381-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Trypan Blue solution (0.4%)</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">RNase A</td>
			<td style="width:143px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10109142001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Protease K</td>
			<td style="width:143px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">3115887001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:216px;">Chicken Anti-BMAL1 antibody</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:288px;">Generated in chicken (Cocalico Biologicals) against antigen aa 318-579, and IgY was affinity purified using the same antigen.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Chicken IgY Precipitating Resin</td>
			<td style="width:143px;">GenScript</td>
			<td style="width:119px;">L00405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Equipment</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">KINEMATICA&#160;Polytron PT2100 Benchtop Homogenizer</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-451-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">15mL Dounce tissue grinder</td>
			<td style="width:143px;">Whearton</td>
			<td style="width:119px;">357544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Falcon Cell Strainers 100&#181;m</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-19</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Falcon Cell Strainers 70&#181;m</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Falcon Cell Strainers 40&#181;m</td>
			<td style="width:143px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">08-771-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">pluriStrainer 30 &#181;m</td>
			<td style="width:143px;">PluriSelect</td>
			<td style="width:119px;">43-50030-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">pluriStrainer 20 &#181;m</td>
			<td style="width:143px;">PluriSelect</td>
			<td style="width:119px;">43-50020-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">pluriStrainer 10 &#181;m</td>
			<td style="width:143px;">PluriSelect</td>
			<td style="width:119px;">43-50010-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Covaris S2 Focused-ultrasonicator</td>
			<td style="width:143px;">Covaris</td>
			<td style="width:119px;">Model S2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Labquake&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>C415110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCD Microscope Camera</td>
			<td>&#160;Leica Microsystems</td>
			<td>DFC3000 G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Reagent Kit</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">DNA extraction kit</td>
			<td style="width:143px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">K0691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;"></td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Buffers</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="76">
			<td height="76" style="height:76px;width:216px;">All buffer components are discribed in the protocol. Each component was purchased from Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a filtration-based method of preparing high-quality nuclei from cross-linked skeletal muscle for chromatin immunoprecipitation

Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) ist eine leistungsfähige Methode zur Bestimmung der Proteinbindung an Chromatin-DNA. Faserreicher Skelettmuskel war jedoch eine Herausforderung für ChIP aufgrund technischer Schwierigkeiten bei der Isolierung von hochwertigen Kernen mit minimaler Kontamination von Myofibrillen. Bisherige Protokolle haben versucht, Kerne vor der Vernetzung zu reinigen, was das Risiko einer veränderten DNA-Protein-Wechselwirkung während des verlängerten Keimpräparationsverfahrens verursacht. In dem aktuellen Protokoll haben wir zuerst das Skelettmuskelgewebe, das von Mäusen gesammelt wurde, vernetzt und die Gewebe wurden gehackt und beschallt. Da wir festgestellt haben, dass die Ultrazentrifugation nicht in der Lage war, Kerne von Myofibrillen unter Verwendung von vernetzten Muskelgeweben zu trennen, entwickelten wir ein sequentielles Filtrationsverfahren, um qualitativ hochwertige Kerne ohne signifikante Myofibrillenverunreinigung zu erhalten. Anschließend wurden Chromatin unter Verwendung eines Ultraschallgerätes hergestellt und ChIP-Assays mit anti-BMAL1-Antikörper zeigten eine robuste zirkadiane BindungMuster von BMAL1 zu Zielgen-Promotoren. Dieses Filtrationsprotokoll stellt eine leicht anwendbare Methode dar, um qualitativ hochwertige Kerne aus vernetzten Skelettmuskelgeweben zu isolieren, was eine konsistente Probenverarbeitung für zirkadiane und andere zeitempfindliche Studien ermöglicht. In Kombination mit der Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) kann unsere Methode für verschiedene mechanistische und genomische Studien eingesetzt werden, die sich auf die Skelettmuskelfunktion konzentrieren.

Hier haben wir die Formaldehyd-Vernetzung unmittelbar nach der Gewebesammlung durchgeführt, um die DNA-Protein-Wechselwirkung in Echtzeit zu bewahren. Jedoch fanden wir, dass Saccharose oder kolloidaler Gradient, der üblicherweise für die Kerneisolation 23 , 24 verwendet wurde , bei der Trennung von Kernen von Myofibrillen (Daten nicht gezeigt) wirksam war. Der Grund mag sein, dass die Vernetzung eine ähnliche Schwerkraft fü...

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A Filtration-based Method of Preparing High-quality Nuclei from Cross-linked Skeletal Muscle for Chromatin Immunoprecipitation

Wir präsentieren ein Filtrations-basiertes Protokoll, um qualitativ hochwertige Kerne aus vernetzten Mäuseskelettmuskeln zu isolieren, wobei wir die Notwendigkeit einer Ultrazentrifugation entfernt haben, wodurch es leicht anwendbar ist. Wir zeigen, dass das aus den Kernen hergestellte Chromatin für die Chromatin-Immunpräzipitation und wahrscheinlich Chromatin-Immunpräzipitations-Sequenzierungsstudien geeignet ist.

Eine Filtrations-basierte Methode zur Herstellung von hochwertigen Nuklei aus vernetzten Skelettmuskeln für Chromatin-Immunpräzipitation

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful method to determine protein binding to chromatin DNA. Fiber-rich skeletal muscle, however, has been a ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Eine leichte und effiziente Ansatz für die Produktion von Reversible Disulfid Vernetzte Mizellen

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

Forschung

Biochemie

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Eine einfache Fraktionierte Extraktionsmethode für die umfassende Analyse von Metaboliten, Lipiden und Proteinen aus einer einzigen Probe

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Improved Protocol for Chromatin Immunoprecipitation from Mouse Skeletal Muscle

Verbesserte Protokoll für Chromatin Immunopräzipitation aus Maus skelettartiger Muskel

We describe an efficient and reproducible protocol for the preparation of chromatin from adult mouse skeletal muscle, a physically resistant tissue with a ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Aktivierte vernetzte Agarose für die schnelle Entwicklung von Affinity Chromatography Resins - Antikörpererfassung als Fallstudie

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Quantifizierung der Protein-Interaktionsnetzwerkdynamik mit Multiplex-Co-Immunopräzipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Preparation of High-Quality Fermented Fish Product

Herstellung von hochwertigem fermentiertem Fischprodukt

This protocol provides a method for preparation of industrialized fermented fish product with sturgeon (Aquilaria sinensis) meat product. The procedures ...

Obtaining High-Quality Transcriptome Data from Cereal Seeds by a Modified Method for Gene Expression Profiling

Beschaffung hochwertiger Transkriptomdaten von Getreidesamen durch eine modifizierte Methode zur Genexpressionsprofilierung

The characterization of gene expression is dependent on RNA quality. In germinating, developing and mature cereal seeds, the extraction of high-quality ...

Preparing Lamellae from Vitreous Biological Samples Using a Dual-Beam Scanning Electron Microscope for Cryo-Electron Tomography

Präparation von Lamellen aus glasartigen biologischen Proben mit einem Zweistrahl-Rasterelektronenmikroskop für die Kryo-Elektronentomographie

Presented here is a protocol for preparing cryo-lamellae from plunge-frozen grids of Plasmodium falciparum-infected&#160;human erythrocytes, which could ...

Measurement of Protein Import Capacity of Skeletal Muscle Mitochondria

Messung der Proteinimportkapazität der Mitochondrien der Skelettmuskulatur

Mitochondria are key metabolic and regulatory organelles that determine the energy supply as well as the overall health of the cell. In skeletal muscle, ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

Quantifizierung der subzellulären Glykogenverteilung in Skelettmuskelfasern mittels Transmissionselektronenmikroskopie

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...