Name: modeling amyloid-&#946;42 toxicity and neurodegeneration in adult zebrafish brain
Uploaded: 2017-10-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Amyloid-ÃŽÂ²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af DZNE og Helmholtz Association (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) og DFG (KI1524/6) (C.K.); og af Leibniz Association (SAW-2011-IPF-2) og BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Vi vil også gerne takke Ulrike Hofmann for peptidsyntese og Nandini Asokan, Prayag Murawala og Elly Tanaka til hjælp under optagelserne af proceduren.

denne protokol er en standardprocedure, som foreslået af EU 's retningslinjer (2010/63) og det europæiske samfund for fisk modeller i biologi og medicin (EuFishBioMed) i Karlsruhe Insitute af teknologi (KIT). Alle metoder beskrevet efter her er blevet godkendt af etik Kommissionen (Landesdirektion Dresden, bilagsnummer TVV-52/2015).
 1. forberedelse af Aβ42 peptid <ol><li>Synthesize peptider (Se tabel 1) ved hjælp af standard 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) kemi med 2...

De amyloid peptider kan ændres til at omfatte sekvens variationer eller forskellige tags. For eksempel, en scrambled amyloid peptid kan genereres, og peptider kan mærket med fluorescerende tags på N-terminus peptid afslutning eller markeret med carrier peptider39. Ligeledes, i denne protokol, carrier peptid er den celle-gennemtrængende peptid TR på grund af sin effektivitet til transport cargo dybt i hjernen væv39. Derudover tillader vores metode til injektion og anal...

Annonce er en kronisk fremadskridende sygdom karakteriseret ved tab af neuroner og synapser i hjernebarken1,2,3,4,5. Klassisk Neuropatologisk kendetegnende for annonce er aflejring af amyloid peptider og dannelsen af den neurofibrillary tangles (NFTs)6. Senile plaques, også kaldet amyloid plaques, er sammensat af amyloid-β (Aβ) peptider, der danner β-plisseret strukturer i hjernen parenkym5. Ophobning af Aβ42 i AD patienter har en tidlig og kritiske rolle i sygdomsprogression. Annonce udløser en kaskade af begivenheder, der førte til synaptic dysfunktion, nedsat plasticitet og neuronal tab7,8,9,10.
Den voksne hjerne af teleost zebrafisk fungerer som en fremragende model til at studere reguleringen af stamcelle plasticitet11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 og forskellige sygdomme i centralnervesystemet (CNS), herunder AD21,22,23 ,24. På grund af en bred vifte af tilgængelige eksperimentelle metoder19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, disse undersøgelser er informative og gennemførlige. Zebrafisk kan genopbygge CNS13,15,32,33,34,35,36,37, 38, dels ved hjælp af molekylære programmer aktiveres efter neuronal tab19,39,40,41,42,43, 44. Derfor, om oprettelse af en neurodegenerativ sygdom model i zebrafisk kan hjælpe adresse roman spørgsmål vedrørende regenerative evne og stamceller biologi i hvirveldyr hjerner.
For nylig har udviklet vi en amyloid toksicitet model i voksen zebrafisk hjernen ved at indsprøjte syntetiske Aβ42 peptider (tabel 1)39. Denne injektion forårsaget neurodegeneration fænotyper minder om menneskelige hjerne patologi (fxcelledød, microglial aktivering, synaptic degeneration og hukommelse underskud), der angiver, at zebrafisk kan bruges til at fremkalde neurodegeneration i zebrafisk hjernen, Aβ42 peptider kan spores med immunhistokemiske stainings, og molekylære mekanismer for regenerering i voksen zebrafisk CNS kan være identificeret39. I denne protokol vise vi injektion af syntetiske amyloid peptider i zebrafisk hjernen ved hjælp af en cerebroventricular indsprøjtning (CVMI) metode27,39,45,46 at efterligne amyloid aflejring (figur 1). CVMI giver en ny måde at levere peptider, som samlede på injektion som β-plade strukturer og udøve toksicitet. Peptider er fordelt jævnt over hele hjernen, målretning ventrikulær området langs hele rostro-caudale akse45. Derudover tillader denne metode til at analysere de morfologiske og molekylære svar af NSPCs i voksen zebrafisk hjernen efter amyloid optagelser. Disse undersøgelser vil give os et indblik for vellykket hjernen reparation i pattedyr. Vores metode kan bruges til at forstå den nødvendige molekylær mekanisme for en vellykket regenerering svar efter annonce-lignende symptomer til at fremkalde opfyldning af tabte neuroner og funktionel genopretning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fmoc-protected amino acids</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td></td>
			<td>Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU)</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>RL-1030</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxyma</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>RL-1180</td>
			<td>Racemization supressor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>SOL-003</td>
			<td>Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>SOL-004</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methylmorpholine</td>
			<td>Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany</td>
			<td>A12158</td>
			<td>Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>157260 ALDRICH</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piperidine</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>822299</td>
			<td>Fmoc deprotection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichlormethane (DCM)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>106050</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>100264</td>
			<td>Buffer component for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>808260</td>
			<td>Clevage Mixture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane(TIS)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>233781 ALDRICH</td>
			<td>Clevage Mixture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (for UPLC/LCMS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH</td>
			<td>34967-1L</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (for HPLC)</td>
			<td>VWR International Ltd, England</td>
			<td>83639.320</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylether</td>
			<td>VWR International Ltd, England</td>
			<td>23811.326</td>
			<td>Solvent for peptide precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotritol (DTT)</td>
			<td>VWR International Ltd, England</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td>Clevage Mixture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin</td>
			<td>Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany)</td>
			<td>S30023</td>
			<td>Solid phase for SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters</td>
			<td>Intavis AG (Cologne, Germany)</td>
			<td>34.274</td>
			<td>Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter</td>
			<td>Sartorius Stedtim (Aubagne, France)</td>
			<td>11806-50-N</td>
			<td>Filteration of precipitated peptides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe</td>
			<td>KC78.1</td>
			<td>Pre-filteration for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide Synthesizer</td>
			<td>Intavis, Cologne, Germany</td>
			<td>ResPep SL</td>
			<td>Automated solid-phase peptide synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Alliance HPLC</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>Waters 2998, Waters e2695</td>
			<td>Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymerX, bead size 10&#956;m, 250x10 mm</td>
			<td>Phenomenex Ltd. Germany</td>
			<td>00G-4328-N0</td>
			<td>Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter</td>
			<td>EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA</td>
			<td>LCPAK0001</td>
			<td>Water purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration Unit</td>
			<td>Sartorius Stedtim (Aubagne, France)</td>
			<td>16307</td>
			<td>Filtration unit for peptide precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC Aquity with UV Detector</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>M09UPA 664M</td>
			<td>Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 &#956;m, 50x2.1 mm</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>186002350</td>
			<td>Analytical C18 column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY TQ Detector</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>QBB908</td>
			<td>Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6</td>
			<td>Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany</td>
			<td>16706, 101542</td>
			<td>Lyophilizer with vaccum pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paradigm plate reader</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821.472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Life Technologies, GIBCO</td>
			<td>10010-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>305178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus, Leica, Zeiss</td>
			<td>Varies with the manufacturer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gillies Dissecting Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass injection capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TWF10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoNozzle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring illuminator; Ring Light Guide</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>ILL-RLG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling amyloid-&#946;42 toxicity and neurodegeneration in adult zebrafish brain

Alzheimers sygdom (AD) er en invaliderende neurodegenerativ sygdom i hvilken ophobning af giftige amyloid-β42 (Aβ42) peptider fører til synaptic degeneration, betændelse, neuronal død, og lære underskud. Mennesker kan ikke regenerere tabte neuroner for annonce delvis på grund af nedsat proliferativ kapacitet af neurale stem/stamceller (NSPCs) og reduceret neurogenese. Derfor, effektive regenerative behandlinger bør også forbedre spredningen og neurogen NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) er en regenerativ skadegoereren, og vi kan lære de grundlæggende molekylære programmer, som vi kunne designe terapeutiske tilgange til at tackle annonce. Af denne grund var generation af en AD-lignende model i zebrafisk nødvendigt. Ved hjælp af vores metodik, kan vi indføre syntetiske derivater af Aβ42 peptid hos væv gennemtrængende evne i voksen zebrafisk hjernen og analysere sygdom patologi og regenerativ respons. Fordelen i forhold til eksisterende metoder eller dyremodeller er at zebrafisk kan lære os, hvordan en hvirveldyr hjerne kan naturligvis regenerere og således hjælpe os med at behandle menneskelige neurodegenerative sygdomme bedre ved at målrette endogene NSPCs. Derfor, den amyloid-toksicitet model etableret i hjernen, voksen zebrafisk kan åbne nye muligheder for forskning inden for neurovidenskab og klinisk medicin. Derudover simpel udførelse af denne metode giver mulighed for omkostningseffektiv og effektiv eksperimentelle vurdering. Dette manuskript beskriver syntese og injektion af Aβ42 peptider i zebrafisk hjernen.

HPLC blev brugt til at rense den syntetiserede peptid og massespektrometri er blevet brugt til at karakterisere renset amyloid β peptider. HPLC kolonne blev opvarmet til 50 ° C til at forbedre adskillelse af Aβ peptider og alle fraktioner blev indsamlet. For at identificere den korrekt syntetiserede peptid, blev masse spektroskopi analyse udført for alle fraktioner. UPLC kromatogrammet viser renheden af sammensat. HPLC brøkdel, der gav et højdepunkt på UPLC (dvs., den korr...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Amyloid-ÃŽÂ²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain at JoVE.com

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modellering Amyloid-β42 toksicitet og Neurodegeneration i voksen zebrafisk hjerne

Denne protokol beskriver syntese, karakterisering og injektion af monomere amyloid-β42 peptider til at generere amyloid toksicitet i voksen zebrafisk at etablere en Alzheimers sygdom model, efterfulgt af histologiske analyser og påvisning af sammenlægninger.

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Mikromanipuleringer af genekspression i Adult zebrafisk Brain Brug Cerebroventricular mikroinjektion af Morpholino oligonukleotider

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrofysiologiske optagelse i hjernen af ​​intakte Voksen Zebrafisk

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Stiksår Skade af zebrafisk Adult telencephalon: En metode til at undersøge Vertebrate Brain Neurogenese og Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Anatomisk inspirerede tredimensionale mikrovæv-konstruerede neurale netværk til nervesystem rekonstruktion, modulering og modellering

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

En alternativ metode til at studere primære begivenheder i Neurodegeneration ved hjælp af Ex Vivo rotte hjernen skiver

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Vurdering af langvarig depression induktion i voksne cerebellar skiver

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Visualisering af synaptisk degeneration hos Adult Drosophila i samarbejde med neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

En skalerbar model til at studere virkningerne af Blunt-Force Skade i voksen zebrafisk

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay som et associativt læringsværktøj til kognitiv vurdering i lærings- og hukommelsesstudier ved hjælp af voksne zebrafisk

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...