Name: modeling amyloid-&#946;42 toxicity and neurodegeneration in adult zebrafish brain
Uploaded: 2017-10-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Amyloid-ÃŽÂ²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain at JoVE.com

Dit werk werd gesteund door DZNE en de Helmholtz Association (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518), en DFG (KI1524/6) (CK); en door het Leibniz Association (SAW-2011-IPF-2) en goedgekeurd (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Wij ook bedank Ulrike Hofmann voor peptide synthese en Nandini Asokan, Prayag Murawala en Elly Tanaka voor hulp tijdens het filmen van de procedure.

dit protocol is een standaardprocedure die is voorgesteld door de EU-richtsnoeren (2010/63) en de European Society for vis modellen in de biologie en de geneeskunde (EuFishBioMed) in Karlsruhe Instituut van technologie (KIT). Alle methoden die worden beschreven na hier zijn goedgekeurd door de ethische Commissie (Landesdirektion Dresden; documentnummer TVV-52/2015).
 1. voorbereiding van de Peptide van de Aβ42 <ol><li>Synthesize peptiden (Zie tabel 1) met behulp van de sta...

De amyloïde peptiden kunnen worden gewijzigd zodat reeks variaties of verschillende labels. Bijvoorbeeld, een gecodeerde amyloïde peptide kan worden gegenereerd, en de peptiden kunnen worden gelabeld met de fluorescerende labels op de N-terminus van de peptide-einde of gelabeld met vervoerder peptiden39. Ook in dit protocol is de peptide vervoerder de cel-penetrating peptide TR vanwege de doeltreffendheid ervan naar vervoer cargo diep in de hersenen weefsel39. Daarnaast z...

AD is een chronische progressieve ziekte die wordt gekenmerkt door het verlies aan neuronen en synapses in de hersenschors1,2,3,4,5. De klassieke neuropathologische kenmerken van AD zijn de afzetting van amyloid peptiden en vorming van de neurofibrillary tangles (NFTs)6. Seniele plaques, ook bekend als amyloïde plaques, zijn samengesteld uit amyloid-β (Aβ) peptiden die vormen van β-geplooid structuren in de hersenen parenchym5. De ophoping van Aβ42 in AD patiënten heeft een vroege en kritische rol bij progressie van de ziekte. AD triggert een cascade van gebeurtenissen die leiden tot synaptic dysfunctie, verminderde plasticiteit en neuronale verlies7,8,9,10.
Het volwassen brein van teleost zebrafish dient als een uitstekend model voor het bestuderen van de regulering van de stamcel plasticiteit11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 en diverse ziekten in het centrale zenuwstelsel (CNS), met inbegrip van AD21,22,23 ,24. Als gevolg van een breed scala van beschikbare experimentele methoden19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, deze studies zijn informatief en haalbaar. Zebrafish kan het aanvullen van de CNS13,15,32,33,34,35,,36,,37, 38, gedeeltelijk met behulp van moleculaire programma's geactiveerd na neuronale verlies19,39,40,41,42,43, 44. Daarom, tot oprichting van een neurodegeneratieve ziekte model in zebrafish kan helpen nieuwe kwesties met betrekking tot de regeneratieve vermogen en stamcel biologie in gewervelde hersenen.
Onlangs, ontwikkelde we een model van de amyloïde toxiciteit in volwassen zebrafish hersenen door het injecteren van synthetische Aβ42 peptiden (tabel 1)39. Deze financiële injectie veroorzaakt neurodegeneratie fenotypen denken aan menselijk brein pathologie (b.v., celdood, microglial activering, synaptic degeneratie en geheugen tekorten), die aangeeft dat zebrafish kan worden gebruikt voor het opwekken neurodegeneratie in zebrafish hersenen, Aβ42 peptiden kunnen worden opgespoord met immunohistochemische technieken, en moleculaire mechanismen van regeneratie in volwassen zebrafish die CNS kan worden geïdentificeerd39. In dit protocol tonen we de injectie van synthetische amyloïde peptiden in de hersenen van de zebravis met behulp van een cerebroventricular injectie (CVMI) methode27,39,45,46 om na te bootsen amyloïde afzetting (Figuur 1). CVMI biedt een nieuwe manier van het leveren van de peptiden, die statistische na injectie als β-sheet structuren en uitoefenen toxiciteit. De peptiden zijn gelijkmatig verspreid in de hersenen, gericht op de ventriculaire gebied langs de gehele rostro-caudal as45. Bovendien kunt deze methode voor het analyseren van de morfologische en moleculair reactie van de NSPCs in volwassen zebrafish hersenen na amyloïde insluitsels. Dergelijk onderzoek levert ons een inzicht voor succesvolle hersenen reparatie bij zoogdieren. Onze methode kan worden gebruikt om te begrijpen van de nodige moleculair mechanisme van de reactie van een succesvolle regeneratie na AD-achtige symptomen voor het opwekken van aanvulling van verloren neuronen en functionele herstel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fmoc-protected amino acids</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td></td>
			<td>Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU)</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>RL-1030</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxyma</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>RL-1180</td>
			<td>Racemization supressor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>SOL-003</td>
			<td>Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>SOL-004</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methylmorpholine</td>
			<td>Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany</td>
			<td>A12158</td>
			<td>Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>157260 ALDRICH</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piperidine</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>822299</td>
			<td>Fmoc deprotection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichlormethane (DCM)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>106050</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>100264</td>
			<td>Buffer component for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>808260</td>
			<td>Clevage Mixture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane(TIS)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>233781 ALDRICH</td>
			<td>Clevage Mixture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (for UPLC/LCMS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH</td>
			<td>34967-1L</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (for HPLC)</td>
			<td>VWR International Ltd, England</td>
			<td>83639.320</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylether</td>
			<td>VWR International Ltd, England</td>
			<td>23811.326</td>
			<td>Solvent for peptide precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotritol (DTT)</td>
			<td>VWR International Ltd, England</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td>Clevage Mixture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin</td>
			<td>Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany)</td>
			<td>S30023</td>
			<td>Solid phase for SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters</td>
			<td>Intavis AG (Cologne, Germany)</td>
			<td>34.274</td>
			<td>Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter</td>
			<td>Sartorius Stedtim (Aubagne, France)</td>
			<td>11806-50-N</td>
			<td>Filteration of precipitated peptides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe</td>
			<td>KC78.1</td>
			<td>Pre-filteration for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide Synthesizer</td>
			<td>Intavis, Cologne, Germany</td>
			<td>ResPep SL</td>
			<td>Automated solid-phase peptide synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Alliance HPLC</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>Waters 2998, Waters e2695</td>
			<td>Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymerX, bead size 10&#956;m, 250x10 mm</td>
			<td>Phenomenex Ltd. Germany</td>
			<td>00G-4328-N0</td>
			<td>Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter</td>
			<td>EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA</td>
			<td>LCPAK0001</td>
			<td>Water purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration Unit</td>
			<td>Sartorius Stedtim (Aubagne, France)</td>
			<td>16307</td>
			<td>Filtration unit for peptide precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC Aquity with UV Detector</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>M09UPA 664M</td>
			<td>Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 &#956;m, 50x2.1 mm</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>186002350</td>
			<td>Analytical C18 column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY TQ Detector</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>QBB908</td>
			<td>Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6</td>
			<td>Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany</td>
			<td>16706, 101542</td>
			<td>Lyophilizer with vaccum pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paradigm plate reader</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821.472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Life Technologies, GIBCO</td>
			<td>10010-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>305178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus, Leica, Zeiss</td>
			<td>Varies with the manufacturer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gillies Dissecting Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass injection capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TWF10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoNozzle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring illuminator; Ring Light Guide</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>ILL-RLG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling amyloid-&#946;42 toxicity and neurodegeneration in adult zebrafish brain

De ziekte van Alzheimer (AD) is een slopende neurodegeneratieve ziekte in welke accumulatie van giftige amyloid-β42 (Aβ42) peptiden leidt tot synaptic degeneratie, ontsteking, neuronale dood, en leren van tekorten. Mensen kunnen niet verloren neuronen in het geval van AD ten dele als gevolg van verminderde proliferatieve capaciteit van de neurale stamcellen/voorlopercellen (NSPCs) en de verlaagde neurogenese regenereren. Daarom, efficiënte regeneratieve therapie moeten ook het versterken van de proliferatie neurogene capaciteit van NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) is een regeneratieve organisme, en we kunnen leren van de fundamentele moleculaire programma's waarmee we kunnen ontwerpen therapeutische benaderingen aan te pakken van AD. Om deze reden was de generatie van een AD-achtig model in zebrafish noodzakelijk. Met behulp van onze methodologie, kunnen we introduceren synthetische derivaten van Aβ42 peptide met weefsel indringend vermogen in het brein van volwassen zebrafish, en analyseren van de pathologie van de ziekte en de regeneratieve reactie. Het voordeel ten opzichte van de bestaande methoden of dierlijke modellen is dat zebrafish kan ons leren hoe een gewervelde brein kan natuurlijk regenereren, en dus helpen ons voor de behandeling van menselijke neurodegeneratieve ziekten beter richten op endogene NSPCs. Dus, het model van de amyloid-toxiciteit vastgesteld in de hersenen van volwassen zebrafish kan openen nieuwe mogelijkheden voor onderzoek op het gebied van de neurowetenschappen en klinische geneeskunde Bovendien is de eenvoudige uitvoering van deze methode zorgt voor kosteneffectieve en efficiënte experimentele evaluatie. Dit manuscript beschrijft de synthese en de injectie van Aβ42 peptiden in zebrafish hersenen.

HPLC werd gebruikt voor het zuiveren van de gesynthetiseerde peptide en massaspectrometrie is gebruikt voor het karakteriseren van de gezuiverde amyloïde β-peptiden. De HPLC-kolom werd verwarmd tot 50 ° C om de scheiding van de Aβ peptiden en alle fracties werden verzameld. Om te identificeren van de correct samengestelde peptide, werd massaspectrometrie analyse uitgevoerd voor alle fracties. Het chromatogram UPLC toont de zuiverheid van de stof. De HPLC-fractie dat leverde één piek...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Amyloid-ÃŽÂ²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain at JoVE.com

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modelleren van Amyloid-β42 toxiciteit en neurodegeneratie in volwassen Zebrafish hersenen

Dit protocol beschrijft de synthese, karakterisering en injectie van monomeer amyloid-β42 peptiden voor het genereren van amyloïde toxiciteit in volwassen zebrafish om een model van de ziekte van Alzheimer, gevolgd door histologische analyses en detectie van samenvoegingen.

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Micromanipulatie van genexpressie in de Adult zebravis hersenen met behulp Cerebroventricular Micro-injectie van Morfolino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrofysiologische opname in de hersenen van Intact Adult zebravis

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Steekwond Letsel van de zebravis Adult Telencephalon: Een methode om Onderzoek gewervelde Brain Neurogenese and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Anatomisch Geïnspireerde Driedimensionale Microweefsel Geanimeerde Neurale Netwerken voor Nervous System Reconstructie, Modulatie en Modellering

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Een alternatieve benadering te bestuderen van primaire gebeurtenissen in neurodegeneratie Ex Vivo Rat hersenen segmenten gebruiken

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Beoordeling van langdurige depressie inductie in volwassen cerebellaire schijfjes

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Synaptische degeneratie visualiseren bij volwassen drosofie in combinatie met neurodegeneratie

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Een schaalbaar model om de effecten van blunt-force letsel bij volwassen zebravissen te bestuderen

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay als een associatief leermiddel voor cognitieve beoordeling bij leer- en geheugenstudies met behulp van volwassen zebravissen

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...