Name: modeling amyloid-&#946;42 toxicity and neurodegeneration in adult zebrafish brain
Uploaded: 2017-10-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Amyloid-ÃŽÂ²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain at JoVE.com

Diese Arbeit wurde unterstützt von DZNE und die Helmholtz-Gemeinschaft (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) und DFG (KI1524/6) (c.k.); und durch die Leibniz-Gemeinschaft (SAW-2011-IPF-2) und BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z). Wir möchten auch Ulrike Hofmann für die Peptidsynthese und Nandini Asokan, Prayag Murawala und Elly Tanaka für Hilfe während der Dreharbeiten des Verfahrens danken.

dieses Protokoll ist ein Standardverfahren, vorgeschlagen von den EU-Richtlinien (2010/63) und der European Society for Fish Modelle in Biologie und Medizin (EuFishBioMed) im Karlsruher Institut für Technologie (KIT). Alle hier beschriebene Methoden von der Ethikkommission (Landesdirektion Dresden; Belegnummer TVV-52/2015) genehmigt worden.
 1. Vorbereitung der Aβ42 Peptid <ol><li>Synthe Peptide (siehe Tabelle 1) unter Verwendung der standard 9-Fluorenylmethoxycarbonyl (F...

Das Amyloid Peptide können geändert werden, um Sequenzvariationen oder verschiedenen Tags enthalten. Beispielsweise eine Rührei Amyloide-Peptid kann erzeugt werden, und die Peptide können beschriftet mit fluoreszierenden Tags am N-Terminus von Peptid-Ende oder mit dem Stichwort Träger Peptide39. Ebenso ist das Träger-Peptid in diesem Protokoll der Zelle eindringen Peptid TR wegen seiner Wirksamkeit zu Transport Ladung tief in das Gehirn Gewebe39. Darüber hinaus könn...

AD ist eine chronisch fortschreitende Erkrankung zeichnet sich durch den Verlust von Neuronen und Synapsen in der Großhirnrinde1,2,3,4,5. Klassische neuropathologische AD zeichnen die Ablagerung von Amyloid Peptide und Bildung von der neurofibrillären Verwicklungen (NFTs)6. Senilen Plaques, auch bekannt als Amyloid-Plaques bestehen aus Amyloid-β (Aβ) Peptide, die β-Plissee Strukturen im Gehirn Parenchym5zu bilden. Die Anhäufung von Aβ42 in Alzheimer-Patienten hat eine frühe und wichtige Rolle im Fortschreiten der Krankheit. Anzeige löst eine Kaskade von Ereignissen zu synaptischen Dysfunktion, beeinträchtigt Plastizität und neuronaler Verlust7,8,9,10.
Die Erwachsene Gehirn teleost Zebrafisch dient als eine ausgezeichnete Modell zur Regulierung der Stammzelle Plastizität11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 und verschiedenen Krankheiten in das zentrale Nervensystem (ZNS), einschließlich AD21,22,23 ,24. Aufgrund einer Vielzahl von verfügbaren experimentellen Methoden19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, sind diese Studien informativ und umsetzbar. Zebrafisch kann die CNS13,15,32,33,34,35,36,37auffüllen, 38, teilweise mit Hilfe molekularer Programme aktiviert nach neuronaler Verlust19,39,40,41,42,43, 44. Daher kann eine Neurodegenerative Krankheitsmodell zu etablieren, im Zebrafisch Adresse neuartige Fragen zu Fähigkeiten und die Stammzelle Regenerationsbiologie in vertebrate Gehirne helfen.
Vor kurzem, entwickelten wir ein Amyloid Toxizität in Erwachsenen Zebrafisch Gehirn durch die Injektion von synthetischem Aβ42 Peptide (Tabelle 1)39. Diese Injektion verursacht Neurodegeneration Phänotypen erinnert an menschliche Gehirnpathologie (z.B., Absterben von Zellen, Mikroglia-Aktivierung, synaptischen Degeneration und Gedächtnisstörungen), darauf hinweist, dass Zebrafisch eignet sich für entlocken Neurodegeneration im Zebrafisch Gehirn identifiziert Aβ42 Peptide erkannt werden können, mit immunhistochemischen Färbungen und molekularen Mechanismen der Regeneration im Erwachsenen Zebrafisch lässt CNS39. In diesem Protokoll zeigen wir Ihnen die Injektion von synthetischem Amyloid Peptide in der Zebrafisch Gehirn mittels eine Cerebroventricular Injektion (CVMI) Methode27,39,45,46 Amyloid-Ablagerungen (Abbildung 1) zu imitieren. CVMI bietet eine neuartige Weise des Lieferns der Peptide, die aggregiert nach Einspritzung als β-Sheet-Strukturen und üben Toxizität. Die Peptide werden gleichmäßig im gesamten Gehirn, gezielt das ventrikuläre Gebiet entlang der gesamten Rostro-kaudalen Achse45. Darüber hinaus ermöglicht diese Methode für die Analyse der morphologischen und molekularen Reaktion des NSPCs im Erwachsenen Zebrafisch Gehirn nach Amyloid Einschlüsse. Solche Studien liefern uns einen Einblick für erfolgreiche Gehirn Reparatur bei Säugetieren. Unsere Methode kann verwendet werden, zu verstehen, die notwendig molekularen Mechanismus für eine erfolgreiche Regeneration Antwort nach AD-ähnliche Symptome, Auffüllung des verlorenen Neuronen und funktionelle Wiederherstellung zu induzieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fmoc-protected amino acids</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td></td>
			<td>Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU)</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>RL-1030</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxyma</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>RL-1180</td>
			<td>Racemization supressor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>SOL-003</td>
			<td>Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>SOL-004</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methylmorpholine</td>
			<td>Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany</td>
			<td>A12158</td>
			<td>Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>157260 ALDRICH</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piperidine</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>822299</td>
			<td>Fmoc deprotection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichlormethane (DCM)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>106050</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>100264</td>
			<td>Buffer component for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>808260</td>
			<td>Clevage Mixture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane(TIS)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>233781 ALDRICH</td>
			<td>Clevage Mixture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (for UPLC/LCMS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH</td>
			<td>34967-1L</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (for HPLC)</td>
			<td>VWR International Ltd, England</td>
			<td>83639.320</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylether</td>
			<td>VWR International Ltd, England</td>
			<td>23811.326</td>
			<td>Solvent for peptide precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotritol (DTT)</td>
			<td>VWR International Ltd, England</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td>Clevage Mixture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin</td>
			<td>Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany)</td>
			<td>S30023</td>
			<td>Solid phase for SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters</td>
			<td>Intavis AG (Cologne, Germany)</td>
			<td>34.274</td>
			<td>Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter</td>
			<td>Sartorius Stedtim (Aubagne, France)</td>
			<td>11806-50-N</td>
			<td>Filteration of precipitated peptides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe</td>
			<td>KC78.1</td>
			<td>Pre-filteration for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide Synthesizer</td>
			<td>Intavis, Cologne, Germany</td>
			<td>ResPep SL</td>
			<td>Automated solid-phase peptide synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Alliance HPLC</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>Waters 2998, Waters e2695</td>
			<td>Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymerX, bead size 10&#956;m, 250x10 mm</td>
			<td>Phenomenex Ltd. Germany</td>
			<td>00G-4328-N0</td>
			<td>Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter</td>
			<td>EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA</td>
			<td>LCPAK0001</td>
			<td>Water purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration Unit</td>
			<td>Sartorius Stedtim (Aubagne, France)</td>
			<td>16307</td>
			<td>Filtration unit for peptide precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC Aquity with UV Detector</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>M09UPA 664M</td>
			<td>Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 &#956;m, 50x2.1 mm</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>186002350</td>
			<td>Analytical C18 column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY TQ Detector</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>QBB908</td>
			<td>Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6</td>
			<td>Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany</td>
			<td>16706, 101542</td>
			<td>Lyophilizer with vaccum pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paradigm plate reader</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821.472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Life Technologies, GIBCO</td>
			<td>10010-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>305178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus, Leica, Zeiss</td>
			<td>Varies with the manufacturer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gillies Dissecting Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass injection capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TWF10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoNozzle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring illuminator; Ring Light Guide</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>ILL-RLG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling amyloid-&#946;42 toxicity and neurodegeneration in adult zebrafish brain

Alzheimer-Krankheit (AD) ist eine schwächende Neurodegenerative Erkrankung in die Ansammlung der giftigen Amyloid-β42 (Aβ42) Peptide zu synaptischen Degeneration, Entzündung, neuronalen Tod führt, und Defizite zu lernen. Menschen können nicht verlorene Neuronen bei AD teilweise aufgrund eingeschränkter proliferative Kapazität der neurale Stammzellen/Vorläuferzellen (NSPCs) und reduzierte Neurogenese regenerieren. Daher effiziente regenerative Therapien dürfte auch die Verbreitung und neurogene Kapazität des NSPCs Zebrafish (Danio Rerio) ist eine regenerative Organismus, und wir können lernen, molekulare Grundprogramme mit denen wir gestalten könnte therapeutische Ansätze zur Bewältigung von AD. Aus diesem Grund war die Generation der ein AD-ähnliches Modell im Zebrafisch notwendig. Mit unserer Methodik können wir synthetische Derivate von Aβ42 Peptid mit Gewebe durchdringende Fähigkeit in das Gehirn des Erwachsenen Zebrafisch vorstellen und analysieren die Krankheit-Pathologie und die regenerative Antwort. Der Vorteil gegenüber den bestehenden Methoden oder Tiermodellen ist das Zebrafisch kann uns lehren, wie eine Wirbeltiere Gehirn natürlich regenerieren kann, und damit helfen Sie uns, menschliche Neurodegenerative Krankheiten besser zu behandeln, indem Sie auf endogene NSPCs. Daher kann das Amyloid-Toxizität-Modell im Gehirn Erwachsener Zebrafisch etabliert neue Möglichkeiten für die Forschung auf dem Gebiet der Neurowissenschaften und der klinischen Medizin öffnen. Darüber hinaus erlaubt die einfache Ausführung dieser Methode für kostengünstige und effiziente experimentelle Bewertung. Dieses Manuskript beschreibt die Synthese und Injektion von Aβ42 Peptide in Zebrafisch Gehirn.

HPLC wurde verwendet, um das synthetisierte Peptid zu reinigen und Massenspektrometrie wurde verwendet, um die gereinigten Amyloid β-Peptide zu charakterisieren. Die HPLC-Säule wurde erhitzt bis zu 50 ° C, die Trennung von Aβ-Peptide zu verbessern und die Fraktionen wurden gesammelt. Um das korrekt synthetisierte Peptid zu identifizieren, wurde für alle Fraktionen Massenspektroskopie Analyse durchgeführt. UPLC Chromatogramm zeigt die Reinheit der Verbindung. Die HPLC-Fraktion, die e...

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Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modellierung von Amyloid-β42 Toxizität und Neurodegeneration bei Erwachsenen Zebrafisch-Gehirn

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese, Charakterisierung und Injektion von Monomeren Amyloid-β42 Peptide zur Erzeugung von Amyloid Toxizität in Erwachsenen Zebrafisch, eine Alzheimer-Krankheitsmodell, gefolgt von histologische Analyse und Erkennung von Aggregationen.

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In-vivo-Laser Axotomie in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Forschung

Neurowissenschaften

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Mikromanipulation der Genexpression in der Erotik-Zebrafischgehirn Mit cerebroventricular Mikroinjektion von Morpholino Oligonukleotiden

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrophysiologische Aufnahme im Gehirn von erwachsenen Zebrafisch Intact

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Anatomisch inspirierte dreidimensionale Mikro-Gewebe-konstruierte Neuronale Netze für Nervensystem-Rekonstruktion, Modulation und Modellierung

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Ein alternativer Ansatz zur primären Ereignissen in Neurodegeneration mit Ex Vivo Ratte Gehirnscheiben studieren

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Bewertung der Langzeit-Depressionsinduktion bei erwachsenen Cerebellarscheiben

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Visualisierung der synaptischen Degeneration bei erwachsenen Drosophila in Verbindung mit Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

Ein skalierbares Modell zur Untersuchung der Auswirkungen von Stumpfkraftverletzungen bei erwachsenen Zebrafischen

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay als assoziatives Lernwerkzeug zur kognitiven Beurteilung in Lern- und Gedächtnisstudien mit erwachsenen Zebrafischen

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...