Name: modeling amyloid-&#946;42 toxicity and neurodegeneration in adult zebrafish brain
Uploaded: 2017-10-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Amyloid-ÃŽÂ²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי DZNE, האגודה הלמהולץ (VH-NG-1021), CRTD, ט ו דרזדן (FZ-111, 043_261518) ולאחר DFG (KI1524/6) (סי. קיי); על ידי לייבניץ ההתאגדות (ראה-2011-IPF-2) ו BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). כן נרצה להודות אולריקה הופמן פפטיד סינתזה, וכדי נאנדיני אשוקה, Prayag Murawala וטאנאקה אלי לעזרה במהלך הצילומים ההליך.

פרוטוקול זה הוא הליך סטנדרטי שהוצעה על ידי המנחים של האיחוד האירופי (2010/63) החברה האירופית דגים מודלים בביולוגיה ורפואה (EuFishBioMed) ב קרלסרוה המכון של טכנולוגיה (קיט). כל השיטות המתוארות לאחר כאן אושרו על ידי ועדת האתיקה (Landesdirektion דרזדן; מספר המסמך לך טלוויזיה-52/2015).
 1. הכנה של פפטיד...

ניתן לשנות את פפטידים עמילואיד שיכלול וריאציות ברצף או תגיות שונות. למשל, מקושקשות פפטיד עמילואיד יכול להיווצר, פפטידים יכול להיות המסומנות בתגי פלורסנט-קצה אמיני של הסוף פפטיד או מתויג עם פפטידים נושאת39. באופן דומה, פרוטוקול זה, הינו פפטיד נושאת חודר לתא פפטיד TR בגלל היעילות ...

המודעה היא מחלה פרוגרסיבית כרונית המאופיינת על ידי האובדן של נוירונים, synapses קליפת המוח1,2,3,4,5. גולת neuropathological הקלאסית של AD הן בתצהיר של פפטידים עמילואיד וסבך היווצרות neurofibrillary (NFTs)6. שלטי סנילי, הידוע גם בשם עמילואיד הפלאק, מורכבים של פפטידים עמילואיד-β (Aβ) שיוצרים מבנים קפלים β parenchyma המוח5. ההצטברות של Aβ42 בחולים לספירה יש תפקיד מוקדם וקריטיים התקדמות המחלה. המודעה מפעילה מפל של האירועים שהובילו סינפטית בתפקוד לקוי פלסטיות, אובדן עצביים7,8,9,10.
המוח למבוגרים של דג זברה teleost משמש מודל מצויין ללמוד ברגולציה של תאי גזע פלסטיות11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 ומחלות שונות במערכת העצבים המרכזית (CNS), לרבות לספירה21,22,23 ,24. בשל מגוון רחב של שיטות נסיוניות זמין19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, מחקרים אלה הן אינפורמטיבי ריאלי. דג זברה יכול לחדש את מערכת העצבים המרכזית13,15,32,33,34,35,36,37, 38, בין השאר באמצעות תוכניות מולקולרי מופעל לאחר אובדן עצביים19,39,40,41,42,43, 44. לכן, קביעת מודל מחלות ניווניות דג זברה יכול לעזור כתובת הרומן שאלות הנוגעות משובי יכולת גזע ביולוגיה של התא במוח חוליות.
לאחרונה, פיתחנו מודל רעילות עמילואיד במוח דג זברה למבוגרים באמצעות הזרקת Aβ42 סינתטי פפטידים (טבלה 1)39. זריקה זו גרמה הקשורים ניוון מוחיים פנוטיפים מזכיר הפתולוגיה במוח האנושי (למשלמוות של תאים, microglial הפעלה, ניוון סינפטית, גירעונות זיכרון), המציין את דג זברה יכול לשמש עבור העלאת הקשורים ניוון מוחיים במוח דג זברה, Aβ42 פפטידים יכולים להתגלות עם immunohistochemical stainings, המנגנונים המולקולריים של התחדשות של דג זברה בוגרת ש-CNS יכול להיות מזוהה39. ב פרוטוקול זה, נדגים ההזרקה של peptides סינתטי עמילואיד למוח דג זברה באמצעות של cerebroventricular הזרקה (CVMI) שיטה27,39,45,46 כדי לחקות את התצהיר עמילואיד (איור 1). CVMI מספק דרך מקורית להעביר את פפטידים, אשר צבירה בעת הזרקת כמבני β-גיליון ולעשות מאמץ רעילות. פפטידים מפוזרים באופן אחיד ברחבי המוח, פילוח האזור חדרית לאורך כל ציר rostro-סימטרית45. בנוסף, שיטה זו מאפשרת ניתוח התגובה מולקולרית מורפולוגיים של NSPCs במוח דג זברה בוגרת בעקבות תכלילים עמילואיד. מחקרים כאלה תספק לנו תובנה עבור תיקון מוצלח המוח ביונקים. השיטה שלנו יכול לשמש כדי להבין את המנגנון המולקולרי הכרחי של תגובה התחדשות מוצלחת אחרי לספירה תסמינים לזירוז חידוש המלאי של נוירונים לאיבוד שחזור פונקציונלי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fmoc-protected amino acids</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td></td>
			<td>Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU)</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>RL-1030</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxyma</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>RL-1180</td>
			<td>Racemization supressor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>SOL-003</td>
			<td>Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>SOL-004</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methylmorpholine</td>
			<td>Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany</td>
			<td>A12158</td>
			<td>Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>157260 ALDRICH</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piperidine</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>822299</td>
			<td>Fmoc deprotection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichlormethane (DCM)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>106050</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>100264</td>
			<td>Buffer component for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>808260</td>
			<td>Clevage Mixture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane(TIS)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>233781 ALDRICH</td>
			<td>Clevage Mixture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (for UPLC/LCMS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH</td>
			<td>34967-1L</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (for HPLC)</td>
			<td>VWR International Ltd, England</td>
			<td>83639.320</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylether</td>
			<td>VWR International Ltd, England</td>
			<td>23811.326</td>
			<td>Solvent for peptide precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotritol (DTT)</td>
			<td>VWR International Ltd, England</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td>Clevage Mixture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin</td>
			<td>Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany)</td>
			<td>S30023</td>
			<td>Solid phase for SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters</td>
			<td>Intavis AG (Cologne, Germany)</td>
			<td>34.274</td>
			<td>Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter</td>
			<td>Sartorius Stedtim (Aubagne, France)</td>
			<td>11806-50-N</td>
			<td>Filteration of precipitated peptides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe</td>
			<td>KC78.1</td>
			<td>Pre-filteration for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide Synthesizer</td>
			<td>Intavis, Cologne, Germany</td>
			<td>ResPep SL</td>
			<td>Automated solid-phase peptide synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Alliance HPLC</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>Waters 2998, Waters e2695</td>
			<td>Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymerX, bead size 10&#956;m, 250x10 mm</td>
			<td>Phenomenex Ltd. Germany</td>
			<td>00G-4328-N0</td>
			<td>Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter</td>
			<td>EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA</td>
			<td>LCPAK0001</td>
			<td>Water purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration Unit</td>
			<td>Sartorius Stedtim (Aubagne, France)</td>
			<td>16307</td>
			<td>Filtration unit for peptide precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC Aquity with UV Detector</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>M09UPA 664M</td>
			<td>Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 &#956;m, 50x2.1 mm</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>186002350</td>
			<td>Analytical C18 column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY TQ Detector</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>QBB908</td>
			<td>Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6</td>
			<td>Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany</td>
			<td>16706, 101542</td>
			<td>Lyophilizer with vaccum pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paradigm plate reader</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821.472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Life Technologies, GIBCO</td>
			<td>10010-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>305178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus, Leica, Zeiss</td>
			<td>Varies with the manufacturer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gillies Dissecting Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass injection capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TWF10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoNozzle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring illuminator; Ring Light Guide</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>ILL-RLG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling amyloid-&#946;42 toxicity and neurodegeneration in adult zebrafish brain

מחלת אלצהיימר (AD) היא מתישה מחלות ניווניות איזה הצטברות עמילואיד רעיל-β42 פפטידים (Aβ42) מוביל ניוון סינפטית, דלקת, מוות עצביים, למידה גירעונות. בני אדם לא יכול להתחדש נוירונים אבוד במקרה של המודעה בחלקו בשל קיבולת proliferative לקוי של תאי גזע עצביים/קדמון (NSPCs) ושל נוירוג'נסיס מופחת. לכן, טיפולים משובי יעיל צריך גם לשפר את ההתפשטות neurogenic קיבולת של NSPCs-דג זברה (רזבורה rerio) הוא יצור משובי ואני נוכל ללמוד את התוכניות מולקולרי בסיסי שבו היינו יכולים לעצב גישות טיפוליות כדי להתמודד עם AD. מסיבה זו, הדור של דגם AD-כמו בדג זברה היה הכרחי. באמצעות המתודולוגיה שלנו, אנחנו יכולים להציג נגזרות סינתטי של פפטיד Aβ42 עם יכולת חדירה לרקמות לתוך המוח דג זברה למבוגרים, ולנתח המחלה פתולוגיה ואת התגובה משובי. היתרון מעל שיטות קיימות או בבעלי חיים הוא שדג זברה הזאת יכולה ללמד אותנו איך מוח חוליות יכול להתחדש באופן טבעי, ובכך לסייע לנו להתייחס מחלות ניווניות אנושי טוב יותר על ידי מיקוד NSPCs אנדוגני. לפיכך, המודל עמילואיד רעילות הוקמה במוח דג זברה למבוגרים עשוי להיפתח דרכים חדשות למחקר בתחום של מדעי המוח, רפואה קלינית. בנוסף, ביצוע פשוט בשיטה זו מאפשר הערכת ניסיוני חסכונית ויעילה. כתב יד זה מתאר את סינתזה של הזרקה של פפטידים Aβ42 למוח דג זברה.

HPLC שימש לטהר את פפטיד מסונתז, ספקטרומטר מסה שימש לאפיין את פפטידים β עמילואיד מטוהרים. העמודה HPLC היה מחומם ל 50 מעלות כדי לשפר את ההפרדה של פפטידים Aβ, נאספו כל השברים. כדי לזהות את פפטיד כראוי מסונתז, בוצע ניתוח לספקטרומטרית לשברים כל. Chromatogram UPLC מציג את הטוהר של המתחם. השבר HP...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Amyloid-ÃŽÂ²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain at JoVE.com

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

מידול עמילואיד-β42 רעילות, הקשורים ניוון מוחיים במוח דג זברה למבוגרים

פרוטוקול זה מתאר את סינתזה אפיון, הזרקה של פפטידים עמילואיד monomeric-β42 ליצירת עמילואיד רעילות של דג זברה בוגרת כדי ליצור מודל של מחלת אלצהיימר, ואחריו ניתוחים היסטולוגית וזיהוי של הסיכומים.

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

בשנת vivo לייזר Axotomy ב C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

מיקרומניפולציה של ביטוי גנים במוח דג הזברה למבוגר באמצעות Microinjection Cerebroventricular של oligonucleotides morpholino

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

הקלטת אלקטרו במוח של דג הזברה למבוגר שלמה

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

פציעה דקירת פצע של דג הזברה telencephalon מבוגרים: שיטה לחקר המוח של בעלי החוליות Neurogenesis והתחדשות

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

אנטומיה השראה תלת מימדי מיקרו רקמות מתוכנן רשתות עצביות עבור שחזור מערכת העצבים, אפנון, דוגמנות

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

גישה חלופית ללמוד העיקרי אירועים הקשורים ניוון מוחיים לשעבר Vivo עכברוש המוח בפרוסות

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

הערכה של האינדוקציה לטווח ארוך של דיכאון פרוסות למבוגרים בלבד

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

הדמיה ניוון סינפטי ב דרוזופילה למבוגרים בשיתוף עם ניוון עצבי

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

מודל מדרגי לחקר ההשפעות של פגיעה בוטה בכוח בדגי זברה בוגרים

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

מעבורת Box Assay ככלי למידה אסוציאטיבי להערכה קוגניטיבית בלימודי למידה וזיכרון באמצעות דגי זברה למבוגרים

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...