Name: modeling amyloid-&#946;42 toxicity and neurodegeneration in adult zebrafish brain
Uploaded: 2017-10-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Amyloid-ÃŽÂ²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av DZNE og Helmholtz Association (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) og DFG (KI1524/6) (ck); og av Leibniz Association (så-2011-IPF-2) og BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Vi vil også gjerne takke Ulrike Hofmann for peptid syntese og Nandini Asokan, Prayag Murawala og Elly Tanaka for hjelp under filmingen prosedyren.

denne protokollen er en standard prosedyre foreslått av EU retningslinjene (2010/63) og European Society for fisk modeller i biologi og medisin (EuFishBioMed) i Karlsruhe Insitute av teknologi (KIT). Alle metodene beskrevet etter her er godkjent av etikk commission (Landesdirektion Dresden, bilagsnummer TVV-52/2015).
 1. forberedelse av Aβ42 peptid <ol><li>syntetisere peptider (se tabell 1) standard 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) kjemi med 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,...

Amyloid peptidene kan endres for å inkludere sekvens variasjoner eller ulike koder. For eksempel, en kryptert amyloid peptid kan genereres og peptidene kan være merket med fluorescerende koder på N-terminus peptid slutten eller merket med transportør peptider39. Tilsvarende i denne protokollen er bærer peptid i celle-gjennomtrengende peptid TR på grunn av effektiviteten til transport Last dypt i hjernen vev39. I tillegg gir vår metode for injeksjon og analyser av uli...

Annonsen er en kronisk progressiv sykdom preget av tapet av nevroner og synapser i hjernebarken1,2,3,4,5. Klassisk neuropathological kjennetegnene av Annonsen er avsettelse av amyloid peptider og dannelsen av den neurofibrillary floker (NFTs)6. Senil plaketter, også kjent som amyloid plaques, består av amyloid-β (Aβ) peptider som danner β-pleated strukturer i hjernen parenchyma5. Oppsamling av Aβ42 i Annonsen pasienter har en tidlig og kritisk rolle i sykdomsprogresjon. AD utløser en kaskade av hendelser som førte til synaptic dysfunksjon, svekket plastisitet og neuronal tap7,8,9,10.
Voksen hjerne teleost sebrafisk fungerer som en utmerket modell å studere regulering av stilk cellen plastisitet11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 og ulike sykdommer i sentralnervesystemet (CNS), inkludert AD21,22,23 ,24. På grunn av en lang rekke eksperimentelle metoder for tilgjengelig19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, disse studiene er informativ og gjennomførbart. Sebrafisk kan fylle CNS13,15,32,33,34,35,36,37, 38, delvis ved hjelp av molekylære programmer aktivert etter neuronal tap19,39,40,41,42,43, 44. Derfor kan etablere en neurodegenerative sykdom modell i sebrafisk hjelpe adresse roman spørsmål angående regenerativ evne og stamcelleforskningen biologi i virveldyr hjernen.
Nylig har utviklet vi en amyloid toksisitet modell i voksen sebrafisk hjernen ved å injisere syntetisk Aβ42 peptider (tabell 1)39. Denne injeksjon forårsaket neurodegeneration fenotyper minner om menneskelige hjerne patologi (f.eks, celledød, microglial aktivisering, synaptic degenerasjon og minne underskudd), som indikerer at sebrafisk kan brukes for fremlokkende neurodegeneration i sebrafisk hjernen, Aβ42 peptider kan oppdages med immunohistochemical stainings og molekylære mekanismer av gjenfødelse voksen sebrafisk CNS kan bli identifisert39. Denne protokollen viser vi injeksjon av syntetiske amyloid peptider i sebrafisk hjernen med en cerebroventricular injeksjon (CVMI) metoden27,39,45,46 å etterligne amyloid avsetning (figur 1). CVMI gir en ny måte å levere peptidene som samlet ved injeksjon som β arks strukturer og utøve toksisitet. Peptidene er jevnt fordelt i hele hjernen, målretting ventrikkel området langs hele rostro-caudal aksen45. I tillegg gir denne metoden for å analysere NSPCs i voksen sebrafisk hjernen etter amyloid Inneslutninger morfologiske og molekylære svar. Slike studier vil gi oss innsikt for vellykket hjernen reparasjon i pattedyr. Vår metode kan brukes å forstå nødvendig molekylær mekanismen for vellykket gjenfødelse svar etter AD-lignende symptomer å indusere påfyll av tapt neurons og funksjonelle utvinning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fmoc-protected amino acids</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td></td>
			<td>Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU)</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>RL-1030</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxyma</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>RL-1180</td>
			<td>Racemization supressor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>SOL-003</td>
			<td>Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>SOL-004</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methylmorpholine</td>
			<td>Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany</td>
			<td>A12158</td>
			<td>Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>157260 ALDRICH</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piperidine</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>822299</td>
			<td>Fmoc deprotection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichlormethane (DCM)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>106050</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>100264</td>
			<td>Buffer component for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>808260</td>
			<td>Clevage Mixture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane(TIS)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>233781 ALDRICH</td>
			<td>Clevage Mixture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (for UPLC/LCMS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH</td>
			<td>34967-1L</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (for HPLC)</td>
			<td>VWR International Ltd, England</td>
			<td>83639.320</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylether</td>
			<td>VWR International Ltd, England</td>
			<td>23811.326</td>
			<td>Solvent for peptide precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotritol (DTT)</td>
			<td>VWR International Ltd, England</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td>Clevage Mixture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin</td>
			<td>Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany)</td>
			<td>S30023</td>
			<td>Solid phase for SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters</td>
			<td>Intavis AG (Cologne, Germany)</td>
			<td>34.274</td>
			<td>Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter</td>
			<td>Sartorius Stedtim (Aubagne, France)</td>
			<td>11806-50-N</td>
			<td>Filteration of precipitated peptides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe</td>
			<td>KC78.1</td>
			<td>Pre-filteration for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide Synthesizer</td>
			<td>Intavis, Cologne, Germany</td>
			<td>ResPep SL</td>
			<td>Automated solid-phase peptide synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Alliance HPLC</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>Waters 2998, Waters e2695</td>
			<td>Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymerX, bead size 10&#956;m, 250x10 mm</td>
			<td>Phenomenex Ltd. Germany</td>
			<td>00G-4328-N0</td>
			<td>Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter</td>
			<td>EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA</td>
			<td>LCPAK0001</td>
			<td>Water purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration Unit</td>
			<td>Sartorius Stedtim (Aubagne, France)</td>
			<td>16307</td>
			<td>Filtration unit for peptide precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC Aquity with UV Detector</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>M09UPA 664M</td>
			<td>Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 &#956;m, 50x2.1 mm</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>186002350</td>
			<td>Analytical C18 column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY TQ Detector</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>QBB908</td>
			<td>Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6</td>
			<td>Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany</td>
			<td>16706, 101542</td>
			<td>Lyophilizer with vaccum pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paradigm plate reader</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821.472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Life Technologies, GIBCO</td>
			<td>10010-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>305178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus, Leica, Zeiss</td>
			<td>Varies with the manufacturer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gillies Dissecting Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass injection capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TWF10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoNozzle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring illuminator; Ring Light Guide</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>ILL-RLG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling amyloid-&#946;42 toxicity and neurodegeneration in adult zebrafish brain

Alzheimers sykdom (AD) er en ødeleggende nevrodegenerative sykdommer som opphopning av giftige amyloid-β42 (Aβ42) peptider fører til synaptic degenerasjon, betennelse, neuronal død, og lære underskudd. Mennesker kan ikke generere tapt neurons i AD delvis på grunn av nedsatt proliferativ kapasitet av nevrale stammen/stamfar celler (NSPCs) og redusert neurogenesis. Derfor effektiv regenerativ Therapy også burde styrke spredning og neurogenic NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) er en regenerativ organisme, og vi kan lære grunnleggende molekylær programmene som vi kunne utforme terapeutiske metoder å takle AD. Derfor var generering av en annonse som modell i sebrafisk nødvendig. Med vår metodikk, kan vi introdusere syntetiske derivater av Aβ42 peptid med vev gjennomtrengende evnen til voksen sebrafisk hjernen og analysere sykdom patologi og regenererende svaret. Fordelen over eksisterende metoder eller dyremodeller er at sebrafisk kan lære oss hvordan virveldyr hjernen kan naturlig regenerere, og dermed hjelpe oss å behandle menneskelige nevrodegenerative sykdommer bedre av målretting endogene NSPCs. Derfor åpne amyloid-toksisitet modellen i voksen sebrafisk hjernen nye muligheter for forskning i nevrovitenskap og klinisk medisin. I tillegg gir enkel utførelsen av denne metoden for billig og effektiv eksperimentelle vurdering. Dette manuskriptet beskriver syntese og injeksjon av Aβ42 peptider i sebrafisk hjernen.

HPLC ble brukt til å rense den syntetiserte peptid og massespektrometri har blitt brukt til å beskrive renset amyloid β peptidene. Kolonnen HPLC ble oppvarmet til 50 ° C å forbedre separasjon av Aβ-peptider og alle fraksjoner ble samlet. For å identifisere det korrekt syntetisert peptid, ble masse spectroscopy analyse utført for alle fraksjoner. UPLC-chromatogram viser renheten av sammensatte. HPLC brøken som ga en topp på UPLC (dvs., riktig massen lade forholdet mellom...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Amyloid-ÃŽÂ²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain at JoVE.com

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modellering Amyloid-β42 giftighet og Neurodegeneration i voksen sebrafisk hjernen

Denne protokollen beskriver syntese, karakterisering og injeksjon av monomerisk amyloid-β42 peptider for generering av amyloid toksisitet i voksen sebrafisk å etablere en Alzheimers sykdom modell, etterfulgt av histologiske analyser og påvisning av samlinger.

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Mikromanipulasjonsprosedyre av Gene Expression i voksen sebrafisk Brain hjelp Cerebroventricular Mikroinjeksjon av morpholino Oligonukleotider

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektro opptak i hjernen til Intakt Adult Sebrafisk

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Stab Wound Skade av sebrafisk Adult Telencephalon: En metode for å etterforske Virveldyr Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Anatomisk inspirerte tredimensjonale mikrovev-konstruerte nevrale nettverk for nervesystemet Rekonstruksjon, modulering og modellering

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

En alternativ tilnærming til studere primære hendelser i Neurodegeneration bruker Ex Vivo rotte hjernen skiver

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Vurdering av lang tids depresjon induksjon i voksen lillehjernen skiver

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Visualisere synaptisk degenerasjon hos voksne Drosophila i forbindelse med nevrodegenerasjon

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

En skalerbar modell for å studere effekten av stump kraftskade hos voksen sebrafisk

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay som et assosiativt læringsverktøy for kognitiv vurdering i lærings- og minnestudier ved hjelp av voksen sebrafisk

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...