Name: modeling amyloid-&#946;42 toxicity and neurodegeneration in adult zebrafish brain
Uploaded: 2017-10-25T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Modeling Amyloid-ÃŽÂ²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain at JoVE.com

Detta arbete fick stöd av DZNE och Helmholtz Association (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518), och DFG (KI1524/6) (C.K.); och av Leibniz Association (SAW-2011-IPF-2) och BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Vi vill också tacka Ulrike Hofmann för peptidsyntesen och Nandini Asokan, Prayag Murawala och Elly Tanaka för hjälp under filmning förfarandet.

detta protokoll är ett standardförfarande som föreslagits av de EU-riktlinjerna (2010/63) och European Society for fisk modeller i biologi och medicin (EuFishBioMed) i Karlsruhe Insitute av teknik (KIT). Alla metoder beskrivs efter här har godkänts av etik kommissionen (Landesdirektion Dresden, dokumentnummer TVV-52/2015).
 1. förberedelse av Aβ42 peptid <ol><li>Synthesize peptider (se tabell 1) med standard 9-fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) kemi med 2-(1H-benzotriaz...

De amyloida peptiderna kan modifieras för att inkludera sekvens variationer eller olika taggar. Exempelvis en äggröra amyloid peptid kan genereras och peptiderna kan vara märkta med fluorescerande Taggar vid N-terminalen av peptid slutet eller märkta med transportören peptider39. Likaså, i detta protokoll, transportören peptiden är cell-penetrerande peptiden TR på grund av dess effektivitet att transportera gods djupt in i hjärnans vävnad39. Dessutom ger vår me...

AD är en kronisk progressiv sjukdom som kännetecknas av förlust av nervceller och synapser i hjärnbarken1,2,3,4,5. Klassiskt neuropatologiska kännetecken för AD är nedfallet av amyloida peptider och bildandet av de neurofibrillära tangles (NTFS)6. Senila plack, även känd som amyloida plack, består av β-amyloid (Aβ) peptider som bildar β-veckad strukturer i hjärnparenkymet5. Ansamling av Aβ42 i AD patienter har en början och kritisk roll i sjukdomsprogression. AD utlöser en kaskad av händelser som leder till synaptic dysfunktion, nedsatt plasticitet och neuronala förlust7,8,9,10.
Den vuxna hjärnan av lever zebrafiskar fungerar som en utmärkt modell att studera regleringen av stamceller plasticitet11,12,13,14,15, 16,17,18,19,20 och olika sjukdomar i det centrala nervsystemet (CNS), inklusive AD21,22,23 ,24. På grund av en stor mängd tillgängliga experimentella metoder19,20,25,26,27,28,29, 30 , 31, dessa studier är informativ och genomförbart. Zebrafiskar kan fylla på CNS13,15,32,33,34,35,36,37, 38, delvis med hjälp av molekylär program aktiveras efter neuronala förlust19,39,40,41,42,43, 44. Därför kan om en neurodegenerativ sjukdom modell i zebrafiskar hjälpa adress roman frågor om regenerativ förmåga och stamcell biologi i ryggradsdjur hjärnor.
Nyligen har utvecklat vi en amyloid toxicitet modell i vuxen zebrafiskar hjärnan genom att injicera syntetiska Aβ42 peptider (tabell 1)39. Denna injektion orsakade neurodegeneration fenotyper som påminner om hjärnans patologi (t.ex., celldöd, mikrogliala aktiveringen, synaptic degeneration och minne underskott), vilket indikerar att zebrafiskar kan användas för att framkalla neurodegeneration i zebrafiskar hjärna, Aβ42 peptider kan upptäckas med immunhistokemiska färgningar och molekylära mekanismer av förnyelse i vuxen zebrafiskar CNS kan vara identifierade39. I detta protokoll visar vi en injektion av syntetiska amyloida peptider i zebrafiskar hjärnan med hjälp av en cerebroventricular injektion (CVMI) metod27,39,45,46 att efterlikna amyloid nedfall (figur 1). CVMI ger ett nytt sätt att leverera de peptider, som samlade vid injektion som β-ark strukturer och utöva toxicitet. Peptiderna fördelas jämnt i hela hjärnan, inriktning ventrikulära området längs den hela rostro-kaudala axis45. Dessutom tillåter denna metod för att analysera NSPCs i vuxen zebrafiskar hjärnan efter amyloid inneslutningar morfologiska och molekylära svar. Sådana studier kommer att ge oss en inblick för framgångsrika hjärnan reparation hos däggdjur. Vår metod kan användas för att förstå den nödvändiga molekylära mekanismen av en lyckad förnyelse svar efter AD-liknande symtom att inducera påfyllning av förlorade nervceller och funktionell återhämtning.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fmoc-protected amino acids</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td></td>
			<td>Fmoc-based amino acids for solid phase peptide synthesis (SPPS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-O-(1H-benzotriazol-1-yl)uronium hexafluorophosphate (HBTU)</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>RL-1030</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxyma</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>RL-1180</td>
			<td>Racemization supressor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>SOL-003</td>
			<td>Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethylformamide</td>
			<td>IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Germany)</td>
			<td>SOL-004</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methylmorpholine</td>
			<td>Thermo Fisher (Kandel) GmbH, Germany</td>
			<td>A12158</td>
			<td>Base</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Hydroxybenzotriazole hydrate (HOBT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Co. LLC. (St. Louis, MO, USA)</td>
			<td>157260 ALDRICH</td>
			<td>Activator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piperidine</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>822299</td>
			<td>Fmoc deprotection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dichlormethane (DCM)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>106050</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid (FA)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>100264</td>
			<td>Buffer component for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid (TFA)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>808260</td>
			<td>Clevage Mixture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triisopropylsilane(TIS)</td>
			<td>MERCK KGaA (Darmstadt, Germany)</td>
			<td>233781 ALDRICH</td>
			<td>Clevage Mixture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (for UPLC/LCMS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH</td>
			<td>34967-1L</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile (for HPLC)</td>
			<td>VWR International Ltd, England</td>
			<td>83639.320</td>
			<td>Solvent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diethylether</td>
			<td>VWR International Ltd, England</td>
			<td>23811.326</td>
			<td>Solvent for peptide precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotritol (DTT)</td>
			<td>VWR International Ltd, England</td>
			<td>0281-25G</td>
			<td>Clevage Mixture reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TentaGel S RAM Fmoc rink amide resin</td>
			<td>Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Germany)</td>
			<td>S30023</td>
			<td>Solid phase for SPPS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide synthesis 5 ml syringes with included filters</td>
			<td>Intavis AG (Cologne, Germany)</td>
			<td>34.274</td>
			<td>Reaction tube for SPPS and for clevage from the Solid Phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polytetrafluoroethylene (PTFE) filter</td>
			<td>Sartorius Stedtim (Aubagne, France)</td>
			<td>11806-50-N</td>
			<td>Filteration of precipitated peptides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylidenefluoride (PVDF) syringe filter</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG Karlsruhe</td>
			<td>KC78.1</td>
			<td>Pre-filteration for HPLC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptide Synthesizer</td>
			<td>Intavis, Cologne, Germany</td>
			<td>ResPep SL</td>
			<td>Automated solid-phase peptide synthesizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water Alliance HPLC</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>Waters 2998, Waters e2695</td>
			<td>Semi-preparative reverse-phase high pressure liquid chromatography (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolymerX, bead size 10&#956;m, 250x10 mm</td>
			<td>Phenomenex Ltd. Germany</td>
			<td>00G-4328-N0</td>
			<td>Porous polystyrene divinylbenzene HPLC column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Milli-Q Advantage A10, with a Milli-Q filter</td>
			<td>EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA</td>
			<td>LCPAK0001</td>
			<td>Water purification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtration Unit</td>
			<td>Sartorius Stedtim (Aubagne, France)</td>
			<td>16307</td>
			<td>Filtration unit for peptide precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UPLC Aquity with UV Detector</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>M09UPA 664M</td>
			<td>Analytical reverse phase ultra HPLC for LC-MS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC BEH C18, bead size 1.7 &#956;m, 50x2.1 mm</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>186002350</td>
			<td>Analytical C18 column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY TQ Detector</td>
			<td>Waters, Milford Massachusetts, USA</td>
			<td>QBB908</td>
			<td>Electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6</td>
			<td>Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Germany</td>
			<td>16706, 101542</td>
			<td>Lyophilizer with vaccum pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paradigm plate reader</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MESAB (ethyl-m-aminobenzoate methanesulphonate)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>821.472</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline</td>
			<td>Life Technologies, GIBCO</td>
			<td>10010-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>Becton-Dickinson</td>
			<td>305178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus, Leica, Zeiss</td>
			<td>Varies with the manufacturer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont Tweezers</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501985</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gillies Dissecting Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501265</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass injection capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>TWF10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PicoNozzle</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>5430-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pneumatic PicoPump</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>SYS-PV820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ring illuminator; Ring Light Guide</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>ILL-RLG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modeling amyloid-&#946;42 toxicity and neurodegeneration in adult zebrafish brain

Alzheimers sjukdom (AD) är en handikappande neurodegenerativ sjukdom i vilken ansamling av giftiga amyloid-β42 (Aβ42) peptider leder till synaptic degeneration, inflammation, neuronala dödsfall, och lärande underskott. Människor kan inte återskapa förlorade nervceller i fallet AD delvis på grund av nedsatt proliferativ kapacitet av neurala stamceller/stamceller (NSPCs) och minskad neurogenes. Därför effektiv regenerativ terapier bör också förbättra spridningen och neurogen kapacitet NSPCs. Zebrafish (Danio rerio) är en regenerativ organism och vi kan lära dig de grundläggande molekylära program som vi kan utforma terapeutiska metoder att tackla AD. Därför var det nödvändigt att generationen av en AD-liknande modell i zebrafiskar. Med vår metod, kan vi införa syntetiska derivat av Aβ42 peptid med vävnad genomträngande anlagen in i vuxen zebrafiskar hjärnan och analysera sjukdom patologi och regenerativ svar. Fördelen över befintliga metoder eller djurmodeller är däri Sebrafisken kan lära oss hur en ryggradsdjurens hjärna kan naturligt regenerera, och därmed hjälpa oss att behandla mänskliga neurodegenerativa sjukdomar bättre genom att rikta endogena NSPCs. Den amyloid-toxicity modellen etablerad i vuxen zebrafiskar hjärnan kan därför öppna nya vägar för forskning inom neurovetenskap och klinisk medicin. Dessutom kan det enkelt utförandet av denna metod för kostnadseffektivt och experimentell utvärdering. Detta manuskript beskriver syntes och injektion av Aβ42 peptider i zebrafiskar hjärnan.

HPLC användes att rena den syntetiserade peptiden och masspektrometri har använts för att karakterisera de rena amyloid β-peptiderna. I HPLC-kolonnen var uppvärmt till 50 ° C att förbättra avskiljningen av Aβ peptiderna och alla fraktioner samlades. För att identifiera korrekt syntetiserade peptiden, utfördes massa spektroskopi analys för alla fraktioner. UPLC kromatogrammet visar renheten av föreningen. Den HPLC-fraktionen som gett en topp på UPLC (dvs, den rätta ...

Watch this Scientific Journal Video about Modeling Amyloid-ÃŽÂ²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain at JoVE.com

Modeling Amyloid-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â²42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

Modellering Amyloid-β42 toxicitet och Neurodegeneration i vuxna zebrafiskar hjärnan

Det här protokollet beskriver den syntes, karakterisering och injektion av monomer amyloid-β42 peptider för att generera amyloid toxicitet i vuxen zebrafiskar att upprätta en Alzheimers sjukdom modell, följt av histologiska analyser och upptäckt av aggregeringar.

Alzheimer's disease (AD) is a debilitating neurodegenerative disease in which accumulation of toxic amyloid-&#946;42 (A&#946;42) peptides leads to ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Modeling Amyloid-&#946;42 Toxicity and Neurodegeneration in Adult Zebrafish Brain

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

In vivo Laser Axotomy i C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides

Mikromanipulation av genuttryck i vuxna zebrafisk hjärnan med Cerebroventricular mikroinjektion av Morpholino Oligonucleotides

Manipulation of gene expression in tissues is  required to perform functional studies. In this paper, we demonstrate the  cerebroventricular ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Elektrofysiologiska inspelning i hjärnan i Intact vuxna zebrafisk

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Sticksår ​​Skada i Zebrafish Adult telencefalon: En metod för att undersöka Vertebrate Brain Neurogenes och Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Engineered Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling

Anatomiskt inspirerade tredimensionella mikrovävnadsgenererade neurala nätverk för nervsystemet återuppbyggnad, modulering och modellering

Functional recovery rarely occurs&#160;following injury or disease-induced degeneration within the central nervous system (CNS)&#160;due to the inhibitory ...

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

En alternativ metod att studera primära händelser i Neurodegeneration använder Ex Vivo råtta hjärnan skivor

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Assessment of Long-term Depression Induction in Adult Cerebellar Slices

Bedömning av långvarig depression induktion hos vuxna cerebellär skivor

Synaptic plasticity provides a mechanism for learning and memory. For cerebellar motor learning, long-term depression (LTD) of synaptic transmissions from ...

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Visualizing Synaptic Degeneration in Adult Drosophila in Association with Neurodegeneration

Visualisera Synaptic Degeneration i Adult Drosophila i samband med Neurodegeneration

Drosophila serves as a useful model for assessing synaptic structure and function associated with neurodegenerative diseases. While much work has focused ...

A Scalable Model to Study the Effects of Blunt-Force Injury in Adult Zebrafish

En skalbar modell för att studera effekterna av trubbig kraftskada hos vuxna zebrafiskar

Blunt-force traumatic brain injuries (TBI) are the most common form of head trauma, which spans a range of severities and results in complex and ...

Shuttle Box Assay as an Associative Learning Tool for Cognitive Assessment in Learning and Memory Studies using Adult Zebrafish

Shuttle Box Assay som ett associativt inlärningsverktyg för kognitiv bedömning i inlärnings- och minnesstudier med vuxen zebrafisk

Cognitive deficits, including impaired learning and memory, are a primary symptom of various developmental and age-related neurodegenerative diseases and ...