Name: electroconvulsive seizures in rats and fractionation of their hippocampi to examine seizure-induced changes in postsynaptic density proteins
Uploaded: 2017-08-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins at JoVE.com

Авторы благодарят д-р Эрик C. Bolton за предоставленную нам возможность использовать его центрифуги для фракционирования и д-р Грэм х. Diering в лаборатории д-р Ричард л Huganir в университете Джона Хопкинса для предоставления нам с мелким протоколом для фракционирования PSD.

Все экспериментальные процедуры, включая животных темы были одобрены институциональный уход животных и использования Комитетом в Университете Иллинойса в Урбана-Шампейн.
1. поддержание колонии крыс
<ol><li>Порода крысах Sprague-Dawley (см. Таблицу материалы) и сохранят?...

Здесь мы описываем метод индукции ECS крыс, который вызывает глобальные стимуляции активности нейронов в их гиппокампах. ECS — животное модель электросудорожной терапии, которая клинически используется для лечения наркотиков огнеупорных депрессивных расстройств в людей1<su...

Электросудорожной терапии был использован для лечения пациентов с основными депрессивных расстройств, включая лекарственно-тяжелой депрессии, биполярной депрессии, болезни Паркинсона и шизофрении1,2. В этой терапии захват генерируется электрические стимула доставляется глава наркотизированных пациентов через надчерепное электроды1,2,3. Повторяющихся администрация ECS была клинически полезным лекарственно-депрессивные расстройства1,2,3. Однако точный механизм, лежащий в основе долгосрочной эффективности антидепрессивный эффект в организме человека остается недостижимой. ECS животной модели электросудорожной терапии и широко используется расследовать его терапевтический механизм. Грызунов острый ECS и лечение хронических ECS поощрять взрослых нейрогенез в гиппокампах и реорганизовать нейронной сети4,5, который может вносить усовершенствования в когнитивной гибкости. Кроме того глобального повышения активности мозга, ECS изменяет обилие стенограммы, такие, как мозг производные нейротропные фактор6и несколько белков, включая Метаботропные глутамата приемного устройства 17 и N-метил D-аспартат (NMDA) типа глутамата рецептор субблоков7. Эти изменения участвуют в посреднических долгосрочные изменения числа синапсов, структуры и силы в гиппокампе7,8,9.
В моделях ECS электрической стимуляции доставляется грызунов через stereotaxically имплантированных электродов, роговицы электродов или уха электроды вызывают обобщенных тонизирующий клонические судороги10,11. Стереотаксического имплантация электродов предполагает хирургии и требует значительного времени для улучшения экспериментатора хирургических навыков для сведения к минимуму ущерба. Менее инвазивные роговицы электродов может вызвать сухость и роговицы ссадины и требует анестезии. Использование электродов клип ухо обходит эти ограничения, потому что они могут быть использованы на грызунов без хирургического вмешательства или анестезии и вызвать минимальной травмы. Действительно мы обнаружили, что текущий доставлены к просыпаются крыс через электроды клип ухо надежно индуцирует стадии 4-5 тонизирующий клонические судороги и изменяет синаптических белков в их гиппокампах10.
Для изучения ECS-индуцированных обилием синаптических белков в регионах конкретных мозга грызунов, важно выбрать экспериментальные методы, которые являются наиболее подходящими для их обнаружения и количественного определения. Субцеллюлярные фракционирование головного мозга позволяет для сырой изоляции растворимые белки цитозольной; Мембранные белки; органеллы границы белков; и даже белки в специальных внутриклеточных структур, таких как PSD12,,1314. PSD — густой и хорошо организованной субцеллюлярные домен в нейроны, в которых сконцентрированы на и вблизи постсинаптической мембраны12,13,15синаптических белков. Изоляция PSD является полезным для изучения синаптических белков обогащенного в PSD, поскольку динамические изменения в изобилии и функции рецепторов постсинаптической глутамата, леса белков и белков трансдукции сигнала в PSD12 , 15 , 16 , 17 коррелируют с синаптической пластичности и synaptopathy наблюдается в нескольких неврологических расстройств17,18. Предыдущих субцеллюлярные фракционирование метод, используемый для очистки PSD участие изоляции моющих средств нерастворимые дроби от сырой мембранные часть мозга, дифференциального центрифугирования сахарозы градиенты14, 19. Основная проблема с этим традиционным методом является, что она требует большого количества грызунов мозги14,19. Подготовка 10-20 грызунов изолировать PSD фракция за лечение требует обширных стоимости и времени инвестиций и не является практически осуществимым, если есть много лечения.
Чтобы преодолеть эту проблему, мы адаптировали более простой метод, который непосредственно изолирует PSD фракции, без сахарозы градиентного центрифугирования20,21и внес в него должна применяться к PSD изоляции от гиппокампах одного крыса мозг. Наши мелкие метод фракционирования PSD дает о 30-50 мкг PSD белков из 2 гиппокампах, достаточных для использования в нескольких биохимических анализов, включая иммунопреципитации и Западный blotting. Западный blotting демонстрирует успех нашего метода для изоляции PSD, раскрывая обогащения постсинаптических плотность белка 95 (PSD-95) и исключение Пресинаптический маркер synaptophysin и растворимых цитоплазматический белок α-тубулина. Наши ECS индукции и мелких PSD фракционирование методы легко приспосабливаются в другие регионы грызунов мозга и относительно простой и надежный способ для оценки воздействия ECS на экспрессию белков PSD.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1047">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Spargue-Dawley rat</td>
			<td style="width:245px;">Charles River Laboratories</td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:224px;">ECS supplies</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">A pulse generator</td>
			<td>Ugo Bsile, Comerio, Italy</td>
			<td>57800</td>
			<td>ECS supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MilliQ water purifying system</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>Z00Q0VWW</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Sucrose</td>
			<td>Em science</td>
			<td>SX 1075-3</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Na4O7P2</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>221368</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:433px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>E9884</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HEPES</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>H0527</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Okadaic acid</td>
			<td>TOCRIS</td>
			<td>1136</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Halt Protease Inhibitor</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>78429</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">NaVO3</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>72060</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SCGPS05RE</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Iris Scissors</td>
			<td>WPI (World Precision Instruments)</td>
			<td>500216-G</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">30 mm tissue culture dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-772B</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Glass homogenizer and a Teflon pestle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89026-384</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">1.7 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&#160;</td>
			<td>C2170 (1001002)</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:433px;">Sorvall Legend XT/XF Centrifuge&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75004521</td>
			<td>Subcellular fractionation supplies</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:433px;">Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#23228</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:433px;">Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>#1859078</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#4561086S</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Running Buffer</td>
			<td>Made in the lab</td>
			<td></td>
			<td>Western blot supplies.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:433px;">Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1658004</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane&#160;</td>
			<td>Milipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Transfer Buffer</td>
			<td>Made in the lab</td>
			<td></td>
			<td>Western blot supplies.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-1</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glycine</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP381-5</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td>SIGMA-ALDRICH</td>
			<td>436143</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Methanol&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A454-4</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP151-500</td>
			<td>detergent for PSD isolation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Mini Trans-Blot Module&#160;</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>#1703935</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Nonfat instant dry milk</td>
			<td>Great value</td>
			<td></td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Multi-purposee rotator&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model-2314</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Hyblot CL Autoradiography Film</td>
			<td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&#160;</td>
			<td>E3018 (1001365)</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Enhanced chemifluorescence substrate&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">a Konica SRX-101A film processor</td>
			<td>KONICA MINOLTA</td>
			<td>SRX-101A</td>
			<td>Western blot supplies</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Name of Antibody</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">PSD-95</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#2507</td>
			<td>Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &#176;C, Host Species = Rabbit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Synaptophysin</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>#4329</td>
			<td>Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &#176;C, Host Species = Rabbit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">alpha-Tubulin</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>SC-5286</td>
			<td>Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &#176;C, Host Species = Mouse</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">GluN2B</td>
			<td>Neuromab</td>
			<td>75-097</td>
			<td>Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &#176;C, Host Species = Mouse</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">GluA2</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>Sab 4501295</td>
			<td>Antibody dilution = 1:500-1000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &#176;C, Host Species = Rabbit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">STEP</td>
			<td>Santacruz</td>
			<td>SC-23892</td>
			<td>Antibody dilution = 1:200-500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &#176;C, Host Species = Mouse</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td>
			<td>715-035-150</td>
			<td>Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:433px;">Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td>
			<td>711-035-152</td>
			<td>Antibody dilution = 1:2000-5000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electroconvulsive seizures in rats and fractionation of their hippocampi to examine seizure-induced changes in postsynaptic density proteins

Электросудорожная захват (ECS) является модель экспериментальных животных электросудорожной терапии, наиболее эффективное лечение для тяжелой депрессии. ECS индуцирует обобщенных тоник клонические припадки с низкой смертности и нейрональных смерти и представляет собой широко используется модель экрана анти-эпилептических наркотиков. Здесь мы описываем метод индукции ECS в которой краткий 55-мА ток поставляется для 0.5 s для мужчин крысы 200-250 г веса через электроды клип ухо. Такие двусторонние стимуляции производства стадии 4-5 клонические судороги, которые длились около 10 s. После прекращения острой или хронической ECS большинство крыс, восстановлены быть поведенчески неотличим от липовые «не взятие» крыс. Потому что ECS глобально повышает активность мозга, он также использовался для изучения деятельности зависимые изменения синаптических белков и их воздействие на синаптической силы, используя несколько методов. В частности субцеллюлярные фракционирование постсинаптических плотности (PSD) в сочетании с Западный blotting позволяет для количественного определения обилие синаптических белков в этой специализированной структуре синаптических. В отличие от предыдущих метод фракционирования, который требует большого количества грызунов мозги опишем здесь мелких фракционирование метод, чтобы изолировать PSD от гиппокампах одной крысы, без сахарозы градиентного центрифугирования. С помощью этого метода, мы показывают, что изолированные фракции PSD содержит белки постсинаптической мембраны, включая PSD95, GluN2B и GluA2. Пресинаптический маркер synaptophysin и растворимых цитоплазматический белок α-тубулина были исключены из PSD дроби, демонстрируя успешное PSD изоляции. Кроме того хронические ECS уменьшилось GluN2B выражение в PSD, указав, что наши мелкие PSD фракционирование метод может применяться для обнаружения изменений в гиппокампа PSD белки от одного крыс после генетических, фармакологическим или механических обработок .

Подробная процедура с использованием представленные здесь, один электрическим током (55 мА, 100 импульсов в секунду для 0.5 s) доставлено через ухо клип электроды индуцированной неповторяющегося стадии 4-5 тонизирующий клонические судороги у крыс (рис. 1<strong...

Watch this Scientific Journal Video about Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins at JoVE.com

Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Электросудорожная захват (ECS) является модель экспериментальных животных электросудорожной терапии для тяжелой депрессии. ECS глобально стимулирует активность в гиппокампе, приводит к synaptogenesis и синаптической пластичности. Здесь мы описываем методы для ECS индукции в крыс и внутриклеточных фракционирование их гиппокампах захват индуцированные изменения в синаптических белков.

Электросудорожная изъятий в крыс и фракционирование их гиппокампах для изучения захват индуцированные изменения в постсинаптической плотность белки

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A General Method for Evaluating Incubation of Sucrose Craving in Rats

Общий метод оценки Инкубация Сахароза Тяга у крыс

For someone on a food-restricted diet, food craving in response to food-paired cues may serve as a key behavioral transition point between abstinence and ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Двойной Электрофизиологические Записи синаптически-вызванных астроглиального и нейрональных ответов, при остром срезов гиппокампа

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Подготовка Synaptic плазматической мембраны и Постсинаптических белков плотности с использованием разрывной градиента сахарозы

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

The Neuromuscular Junction: Measuring Synapse Size, Fragmentation and Changes in Synaptic Protein Density Using Confocal Fluorescence Microscopy

Нервно-мышечном соединении: Synapse размер измерение, фрагментации и изменения в синаптической белка плотности с использованием конфокальной флуоресцентной микроскопии

The neuromuscular junction (NMJ) is the large, cholinergic relay synapse through which mammalian motor neurons control voluntary muscle contraction. ...

Using Fluorescence Activated Cell Sorting to Examine Cell-Type-Specific Gene Expression in Rat Brain Tissue

The brain is comprised of four primary cell types including neurons, astrocytes, microglia and oligodendrocytes. Though they are not the most abundant ...

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Simultaneous Two-photon In Vivo Imaging of Synaptic Inputs and Postsynaptic Targets in the Mouse Retrosplenial Cortex

Одновременная Двухфотонное<em&gt; В Vivo</em&gt; Визуализации синаптических входов и Постсинаптических цели в коре головного мозга мыши ретроспленальной

This video shows the craniotomy procedure that allows chronic imaging of neurons in the mouse retrosplenial cortex (RSC) using in vivo two-photon ...

The Optical Fractionator Technique to Estimate Cell Numbers in a Rat Model of Electroconvulsive Therapy

Методика оптического фракционирования для оценки номеров клеток в модели крыс с электросудорожной терапией

Stereological methods are designed to describe quantitative parameters without making assumptions about size, shape, orientation and distribution of cells ...

Quantifying Acute Changes in Renal Sympathetic Nerve Activity in Response to Central Nervous System Manipulations in Anesthetized Rats

Количественная оценка острой изменения почечной симпатической нервной деятельности в ответ на центральной нервной системы манипуляции наркотизированных крыс

Renal sympathetic nerve activity (RSNA) and mean arterial pressure are important parameters in cardiovascular and autonomic research; however, there are ...

Quantitative Measurement of Intrathecally Synthesized Proteins in Mice

Количественное измерение интратекалливых синтезированных белков у мышей

Cerebrospinal fluid (CSF), a fluid found in the brain and the spinal cord, is of great importance to both basic and clinical science. The analysis of the ...

Combining Behavior and EEG to Study the Effects of Mindfulness Meditation on Episodic Memory

Сочетание поведения и ЭЭГ для изучения влияния медитации осознанности на эпизодическую память

Although there has been recent interest in how mindfulness meditation can affect episodic memory as well as brain structure and function, no study has ...