Name: semi-automated analysis of mouse skeletal muscle morphology and fiber-type composition
Uploaded: 2017-08-31T13:00:00
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Siamo grati alla Fondazione Boettcher e l'associazione sclerosi laterale amiotrofica (n. 17-II-344) per il loro supporto di questa ricerca.

tutte le procedure che coinvolgono i topi sono state approvate dal comitato di uso e University of Colorado-Anschutz Medical Campus istituzionali Animal Care (91813(05)1D).
 1. giorno 1: primaria (1°) Immunostaining con l'albumina di siero bovino (BSA) blocco <ol><li>asciugato all'aria sezioni congelate del muscolo del hindlimb del mouse (ad esempio, tibiale anteriore, soleo) montate su vetrini caricati per ~ 30 min 11. disegnare un bordo intorno alle sezi...

<ol>
	<li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease.">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li><li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity.">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li><li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle.">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li><li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase.">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li><li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat,+mouse,+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis.">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li><li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. 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(99), (2015).</li><li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres.">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li><li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+fiber+types+in+C57Bl6j+mice.">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li><li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles.">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li><li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse.">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li></ol>

Qui, abbiamo fornito direzione utile per l'identificazione dei tipi di fibra muscolare scheletrica. In tal modo, descriviamo un nuovo algoritmo per l'analisi dei dati.
Poiché in gran parte, i nostri risultati confermano quelli di precedenti rapporti5,8,10 e riflettono le nostre misurazioni manuali, l'algoritmo sembra essere accurata. Ancora, abbiamo incontrato alcuni trabocchetti sperimentale infrequ...

Esso è stato conosciuto per qualche tempo che il muscolo scheletrico è composto da singole fibre di molti tipi1. Inizialmente, due gruppi di fibre sono state caratterizzate in base alle loro proprietà contrattili e denominato, in modo appropriato, slow-twitch (tipo I) e rapide (tipo II). Queste categorie sono stati ulteriormente distinti sulla base del metabolismo della fibra. Da allora tipo I fibre sono ricche di mitocondri e affidamento sul metabolismo ossidativo, essi sono stati chiariti da robustamente positiva nicotinammide adenina dinucleotide-tetrazolio reduttasi (NADH-TR) diaforasi2 o succinato deidrogenasi (SDH)3 la macchiatura. Al contrario, fibre di tipo II hanno esibito minore e gradi variabili di NADH-TR diaforasi o SDH macchiatura e sono stati divisi in due sottogruppi di contrazione rapida (tipo IIA e tipo IIB) un po' rozzamente basato sulle loro capacità ossidativa relativa. Queste distinzioni tra le fibre hanno state visualizzate in modo più efficace di miosina-ATPasi-miosinica dove tipo I fibre macchia scure dopo una pre-incubazione a pH 4.0 e fibre di tipo IIB assorbono precipitato seguenti pre-incubazione a pH 10.0 con le fibre di tipo IIA la macchiatura intermedio4.
Più recentemente, la macchiatura di immunohistochemical delle isoforme della miosina catena pesante (MyHC) è emerso come discriminatore più fine di fibra-tipo5. Tipo I, tipo IIA e tipo IIB fibre possono essere tutti identificati con precisione sulla base del loro profilo MyHC. Inoltre, un altro tipo di contrazione rapida metabolicamente intermedio-fibra, tipo IIX, è stato identificato6. Fibre ibride che esprimono più MyHC inoltre sono stati confermati5,7,8. Alcune specie come il gatto e il babbuino non sono noti a rapidi tipo IIB MyHCs6. Se MyHC immunostaining è attualmente la valutazione dello stato-of-the-art della composizione del muscolo, l'analisi dei dati ottenuti tramite questa tecnica è ingombrante e richiede molto tempo senza assistenza automatizzata. A tal fine, una manciata di metodi semi-automatici per analizzare questi dati sono stati sviluppati5,9,10. Qui, presentiamo un protocollo relativamente standard per l'identificazione immunohistochemical di fibra muscolare-tipo5,7,8,10, insieme a un romanzo semi-automatizzato algoritmo che accelera l'analisi della morfologia del tipo di fibra e fibra con precisione.

<table width="974">
	<colgroup>
		<col style="width:226pt" width="301" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:172pt" width="229" />
		<col style="width:193pt" width="257" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Bovine Serum Albumin</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A9418-100G</td>
			<td class="xl66" style="width:193pt" width="257">5% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="41" style="height:30.75pt">
			<td class="xl65" height="41" style="width:226pt;height:30.75pt" width="301">Hydrophobic Barrier Pap Pen</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Scientific Device Laboratory</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">9804-02</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Microscope Slides</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Globe Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">1358W</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Coverglass</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">12-544-E</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Immumount</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:172pt" width="229">9990402</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Nail Polish</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">L&#39;Oreal</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="41" style="height:30.75pt">
			<td class="xl65" height="41" style="width:226pt;height:30.75pt" width="301">Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">Discontinued</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">SPOT RT/KE</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">SPOT Imaging Solutions</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">RT940</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Dell Optiplex</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">BA-F8 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgG2b; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">SC-71 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monclonal mouse IgG1; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">BF-F3 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgGM; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">6H1 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgGM; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 594 anti-IgG2b</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21145</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 488 anti-IgG1</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21121</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse;1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 594 anti-IgGM</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21044</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse;1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">OCT</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Sakura Finetek</td>
			<td class="xl68" style="width:172pt" width="229">4583</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">isopentane</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">O3551-4</td>
			<td class="xl66">cool with liguid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">PBS</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Bioreagents</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">BP665-1</td>
			<td class="xl66">10X, dilute to 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Kim wipes</td>
			<td class="xl66">Kimberly-Clark</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">06-666A</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated analysis of mouse skeletal muscle morphology and fiber-type composition

Per anni, distinzioni tra tipi di fibre muscolari scheletriche sono state visualizzate meglio macchiando di miosina-atpasi. Più recentemente, la macchiatura di immunohistochemical delle isoforme della miosina catena pesante (MyHC) è emerso come discriminatore più preciso del tipo di fibra. Tipo I, tipo IIA, tipo IIX e fibre di tipo IIB possono ora essere identificati con precisione sulla base del loro profilo MyHC; Tuttavia, l'analisi manuale di questi dati può essere lento e giù-destra noioso. A questo proposito, rapida e accurata valutazione della morfologia e composizione di fibra-tipo è uno strumento molto desiderabile. Qui, presentiamo un protocollo per la macchiatura di immunohistochemical di state-of-the-art di MyHCs nelle sezioni congelate ottenute dal muscolo del hindlimb del mouse in concerto con un algoritmo romanzo semi-automatizzato che accelera l'analisi della morfologia del tipo di fibra e fibra. Come previsto, il muscolo soleo visualizzato macchiatura per tipo I e fibre IIA, ma non per fibre di tipo IIX o tipo IIB. D'altra parte, il muscolo anteriore di tibialis era composto principalmente da fibre di tipo IIX e tipo IIB, una piccola frazione delle fibre di tipo IIA e poco o nessun fibre di tipo I. Varie trasformazioni di immagine sono state utilizzate per generare mappe di probabilità ai fini della misurazione di diversi aspetti della morfologia delle fibre (cioè, area della sezione trasversale (CSA), diametro Feret massima e minima). I valori ottenuti per questi parametri sono stati poi confrontati con valori ottenuti manualmente. Sono state osservate differenze significative tra una delle due modalità di analisi per quanto riguarda il CSA, diametro Feret massima o minima (tutti p &#62; 0,05), che indica la precisione del nostro metodo. Così, il nostro protocollo di analisi immunostaining può essere applicato per l'indagine degli effetti sulla composizione del muscolo in molti modelli di invecchiamento e di miopatia.

Muscoli del hindlimb (cioè, tibiale anteriore, soleo) sezionati da un topo C57BL/6 maschio di età sconosciuta erano flash congelati affondando una muffa di plastica che contiene il muscolo in OCT composto in isopentano raffreddato ad azoto liquido. Quindi, utilizzando un cryotome, erano taglio a-20 ° C e trasferite al vetro caricati positivamente diverse diapositive12sezioni di serie di 8-10 µm.
<p class="jove_content" fo:keep-together.within-page=...

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Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

La macchiatura di Immunohistochemical delle isoforme della catena pesante della miosina è emerso come il discriminatore di state-of-the-art di fibra del muscolo scheletrico-tipo (cioè, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Qui, presentiamo un protocollo di colorazione insieme a un algoritmo romanzo semi-automatico che facilita la rapida valutazione della morfologia del tipo di fibra e fibra.

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