Name: semi-automated analysis of mouse skeletal muscle morphology and fiber-type composition
Uploaded: 2017-08-31T13:00:00
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우리는이 연구의 그들의 지원을 위해 Boettcher 재단과 루 경화 증 협회 (#17-II-344)에 감사.

쥐와 관련 된 모든 절차는 콜로라도의 대학-Anschutz 의료 캠퍼스 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다 (91813(05)1D).
 1. 주 1: 기본 (1 °)와 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 차단 Immunostaining 마우스 hindlimb 근육 (예를 들어, 앞쪽에 tibialis, soleus)의 <ol><li>Air-dry 냉동된 섹션에 대 한 청구 슬라이드에 장착 ~ 30 분 11. 소수 성 장벽을 PAP 펜을 사용 하 여 섹션...

<ol>
	<li>Engel, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essentiality+of+histo-+and+cytochemical+studies+of+skeletal+muscle+in+the+investigation+of+neuromuscular+disease.">The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease.</a> Neurol. 12, 778-784 (1962).</li><li>Dobrowolny, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+is+a+primary+target+of+SOD1G93A-mediated+toxicity.">Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity.</a> Cell Metab. 8, 425-436 (2008).</li><li>Sultana, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restricting+calcium+currents+is+required+for+correct+fiber+type+specification+in+skeletal+muscle.">Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle.</a> Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).</li><li>Guth, L., Samaha, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Procedure+for+the+histochemical+demonstration+of+actomyosin+ATPase.">Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase.</a> Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).</li><li>Bloemberg, D., Quadrilatero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+myosin+heavy+chain+expression+in+rat,+mouse,+and+human+skeletal+muscle+using+multicolor+immunofluorescence+analysis.">Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis.</a> PLoS One. 7 (4), (2012).</li><li>Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monospecific+antibodies+against+the+three+mammalian+fast+limb+myosin+heavy+chains.">Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains.</a> Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).</li><li>Lee, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++permeation+and/or+binding+to+Cav1.1+fine-tunes+skeletal+muscle+Ca2++signaling+to+sustain+muscle+function.">Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function.</a> Skelet Muscle. 5 (4), (2015).</li><li>Sawano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one-step+immunostaining+method+to+visualize+rodent+muscle+fiber+type+within+a+single+specimen.">A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen.</a> PLoS One. 11 (11), (2016).</li><li>Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+image+analysis+tool+for+the+classification+of+muscle+fibre+type+using+immunohistochemical+staining.">Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining.</a> Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).</li><li>Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+immunohistochemical+classification+of+skeletal+muscle+fibres+in+mouse.">A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse.</a> Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).</li><li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Do's+and+don'ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis.">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), (2015).</li><li>Schiaffino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three+myosin+heavy+chain+isoforms+in+type+2+skeletal+muscle+fibres.">Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres.</a> J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).</li><li>Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+muscle+fiber+types+in+C57Bl6j+mice.">Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice.</a> Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).</li><li>Schiaffino, S., Reggiani, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+types+in+mammalian+skeletal+muscles.">Fiber types in mammalian skeletal muscles.</a> Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).</li><li>Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+and+skeletal+muscle+adaptations+to+voluntary+wheel+running+in+the+mouse.">Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse.</a> J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).</li></ol>

여기, 우리 골격 근육 섬유 종류의 식별에 유용한 방향 제공. 이렇게, 우리는 데이터의 분석을 위한 새로운 알고리즘을 설명 합니다.
때문에 우리의 결과 크게 이전 보고서5,,810 의 확인 하 고 우리 자신의 수동 측정을 반영, 알고리즘은 정확 하 게 나타납니다. 아직도, 우리는 유물 단면에서 결과 불분명 섬?...

그것은 골격 근육 많은 종류1의 단일 섬유의 구성 된 시간에 대 한 알려져 있다. 처음, 섬유의 2 개 그룹 그들의 수축 성의 속성에 따라 특징 이었다 하 고, 적절 하 게, 느린-트 위치 (유형 I) 및 빠른 트 위치 (유형 II). 이러한 범주 추가 섬유 물질 대사에 바탕으로 구별 했다. 이후 유형 I 섬유는 미토 콘 드리 아에서 풍부 하 고 산화 물질 대사에 의존, 그들은 견고 하 게 긍정적인 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드-tetrazolium 환 원 효소 (NADH-TR) diaphorase2 또는 호박 효소 (SDH)3 에 의해 해명 되었다 얼룩. 대조적으로, 유형 II 섬유 전시 덜 NADH TR diaphorase 또는 SDH의 가변도 얼룩이 지 고 두 빠른 트 위치 하위 그룹으로 분할 되었다 (유형 IIA 및 IIB 입력) 그들의 상대적인 산화 용량에 따라 다소 조잡. 섬유 사이의 이러한 구분 myosin ATPase 얼룩에 의해 보다 효과적으로 시각화 되어 있다 어디 유형 I 섬유는 pH 4.0에서 사전 부 화 후 어두운 얼룩 및 유형 IIB 섬유 흡수 유형 IIA 섬유와 pH 10.0에서 촉진 다음 사전 부 화 4얼룩 판매인.
더 최근에, myosin 무거운 체인 (MyHC) isoforms의 immunohistochemical 얼룩이 섬유 유형5의 미세한 판별자로 떠오르고 있다. 유형 I, IIA를 입력 하 고 유형 IIB 섬유 확인 될 수 있다 모두 그들의 MyHC 프로 파일에 따라 정밀. 또한, 또 다른 빠른 트 위치-중급 metabolically 섬유 종류, IIX, 입력 되었습니다 확인된6. 하나 이상의 MyHC을 표현 하는 하이브리드 섬유도 확인된5,,78있다. 고양이 개 코 원숭이 등 일부 종 표현 유형 IIB MyHCs6하지 알려져 있습니다. MyHC immunostaining는 현재 근육 구성의-의 상태--예술 평가,이 기술을 통해 얻은 데이터의 분석은 복잡 하 고 자동화 된 도움 없이 소모. 이 위해 이러한 데이터를 분석 하는 반자동된 방법의 개발된5,,910되었습니다. 여기, 우리 소설 반자동된 함께 근육 섬유 타입5,,78,10, 의 immunohistochemical 식별에 대 한 상대적으로 표준 프로토콜 제시 섬유 유형 및 섬유 형태학의 분석 정확도와 가속 알고리즘입니다.

<table width="974">
	<colgroup>
		<col style="width:226pt" width="301" />
		<col style="width:140pt" width="187" />
		<col style="width:172pt" width="229" />
		<col style="width:193pt" width="257" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Bovine Serum Albumin</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Sigma Aldrich</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A9418-100G</td>
			<td class="xl66" style="width:193pt" width="257">5% in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="41" style="height:30.75pt">
			<td class="xl65" height="41" style="width:226pt;height:30.75pt" width="301">Hydrophobic Barrier Pap Pen</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Scientific Device Laboratory</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">9804-02</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Microscope Slides</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Globe Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">1358W</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Coverglass</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">12-544-E</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Immumount</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Thermo Scientific</td>
			<td class="xl68" style="width:172pt" width="229">9990402</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Nail Polish</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">L&#39;Oreal</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="41" style="height:30.75pt">
			<td class="xl65" height="41" style="width:226pt;height:30.75pt" width="301">Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">Discontinued</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">SPOT RT/KE</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">SPOT Imaging Solutions</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">RT940</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Dell Optiplex</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187"></td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">BA-F8 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgG2b; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">SC-71 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monclonal mouse IgG1; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">BF-F3 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgGM; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="61" style="height:45.75pt">
			<td class="xl65" height="61" style="width:226pt;height:45.75pt" width="301">6H1 Primary Antibody</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229"></td>
			<td class="xl70">monoclonal mouse IgGM; 1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 594 anti-IgG2b</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21145</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse; 1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 488 anti-IgG1</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21121</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse;1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Alexa Fluor 594 anti-IgGM</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Invitrogen</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">A21044</td>
			<td class="xl66">goat anti-mouse;1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">OCT</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Sakura Finetek</td>
			<td class="xl68" style="width:172pt" width="229">4583</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">isopentane</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">O3551-4</td>
			<td class="xl66">cool with liguid nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">PBS</td>
			<td class="xl65" style="width:140pt" width="187">Fisher Bioreagents</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">BP665-1</td>
			<td class="xl66">10X, dilute to 1X</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl65" height="21" style="width:226pt;height:15.75pt" width="301">Kim wipes</td>
			<td class="xl66">Kimberly-Clark</td>
			<td class="xl65" style="width:172pt" width="229">06-666A</td>
			<td class="xl66"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

semi-automated analysis of mouse skeletal muscle morphology and fiber-type composition

수년간, 골격 근육 섬유 유형 사이 구분 했다 myosin ATPase 얼룩에 의해 최고의 시각 됩니다. 더 최근에, myosin 무거운 체인 (MyHC) isoforms의 immunohistochemical 얼룩이 섬유 타입의 미세한 판별자로 떠오르고 있다. 유형 I, IIA, IIX 입력 입력 하 고 유형 IIB 섬유는 정밀 프로필 기반으로 MyHC; 지금 확인 될 수 있다 그러나, 이러한 데이터의 수동 분석 느리고 다운 오른쪽 수 지루한. 이와 관련, 섬유 형 구성과 형태학의 신속, 정확한 평가 매우 바람직한 도구입니다. 여기, 우리는 최신의 immunohistochemical 마우스 hindlimb 근육 섬유 유형 및 섬유 형태 분석 가속 소설 반자동된 알고리즘으로 콘서트에서에서 얻은 냉동된 섹션에 MyHCs의 얼룩에 대 한 프로토콜을 제시. 표시 soleus 근육 유형 I에 얼룩이 지 고 입력 IIA 섬유, 예상 대로, 하지만 형식 IIX 또는 유형 IIB 섬유. 다른 한편으로, 앞쪽에 tibialis 근육 유형 IIX 및 유형 IIB 섬유, 유형 IIA 섬유의 작은 일부분의 주로 구성 되었고 거의 또는 전혀 유형 I 섬유. 여러 이미지 변환 섬유 형태 (즉, 횡단면 지역 (CSA), 최대 및 최소 Feret 직경)의 다양 한 측면을 측정 하기 위해 확률 지도 생성 하기 위해 사용 되었다. 이러한 매개 변수 값이 수동으로 얻은 다음 비교 했다에 대 한 얻은 값입니다. 체코, 최대 또는 최소 Feret 직경에 관하여 분석의 두 모드 사이의 중요 한 차이가 관찰 되었다 (모든 p &#62; 0.05), 우리의 방법의 정확도 나타내는. 따라서, 우리의 immunostaining 분석 프로토콜 노화와 myopathy의 많은 모델에서 근육 구성에 대 한 효과의 조사에 적용할 수 있습니다.

알 수 없는 나이의 남성 C57BL/6 마우스 해 부 Hindlimb 근육 (즉, 앞쪽에 tibialis, soleus) 액체 질소 냉각 isopentane 화합물 10 월에는 근육을 포함 하는 플라스틱 금형을 침 몰 하 여 냉동 플래시 했다. 그런 다음는 cryotome를 사용 하 여, 8-10 µ m 직렬 섹션-20 ° C에서 잘라 되었고 다른 긍정적으로 위탁 유리 슬라이드12전송.
<p class="jove_content" fo:keep-together.withi...

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Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition

골격 근육 섬유 타입의 최신의 판별자로 떠오르고 있다 Immunohistochemical myosin 무거운 체인 isoforms의 얼룩 (즉, 유형 I, 유형 IIA, IIX 입력, IIB를 입력). 여기, 우리는 섬유 유형 및 섬유 형태학의 급속 한 평가 용이 하 게 하는 소설 반 자동화 알고리즘 함께 얼룩 프로토콜을 제시.

마우스 골격 근육 형태와 섬유 형 구성의 반 자동화 된 분석

For years, distinctions between skeletal muscle fiber types were best visualized by myosin-ATPase staining. More recently, immunohistochemical staining of ...

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