Name: isolation and culture of primary mouse keratinocytes from neonatal and adult mouse skin
Uploaded: 2017-07-14T14:00:00
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この研究は、潰瘍性大腸炎（R01AR069653〜Zhang LJ）および国立衛生研究所（5T32AR062496-03〜CA）によって支持された。

すべての動物実験は、UCSD機関動物管理および使用委員会の承認を受けています。 1.新生児皮膚由来の初代マウスKC単離および培養<ol><li> C57B / 6野生型マウス系統の生後0-2日の新生児をハサミを用いた断頭により犠牲にする。手首と足首の関節のすぐ上の手足を切断し、小さな穴を残して尻尾を完全に切断します。 </li><li> 皮膚全体を剥がすには、まず鋭いはさみを...

<ol>
	<li>Mauro, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+barrier+perturbation+abolishes+the+Ca2++and+K++gradients+in+murine+epidermis:+quantitative+measurement+using+PIXE.">Acute barrier perturbation abolishes the Ca2+ and K+ gradients in murine epidermis: quantitative measurement using PIXE.</a> J Invest Dermatol. 111 (6), 1198-1201 (1998).</li><li>Menon, G. K., Grayson, S., Elias, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ionic+calcium+reservoirs+in+mammalian+epidermis:+ultrastructural+localization+by+ion-capture+cytochemistry.">Ionic calcium reservoirs in mammalian epidermis: ultrastructural localization by ion-capture cytochemistry.</a> J Invest Dermatol. 84 (6), 508-512 (1985).</li><li>Elias, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+epidermal+calcium+gradient+coincides+with+key+milestones+of+barrier+ontogenesis+in+the+rodent.">Formation of the epidermal calcium gradient coincides with key milestones of barrier ontogenesis in the rodent.</a> J Invest Dermatol. 110 (4), 399-404 (1998).</li><li>Hennings, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+regulation+of+growth+and+differentiation+of+mouse+epidermal+cells+in+culture.">Calcium regulation of growth and differentiation of mouse epidermal cells in culture.</a> Cell. 19 (1), 245-254 (1980).</li><li>Zhang, L. J., Bhattacharya, S., Leid, M., Ganguli-Indra, G., Indra, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ctip2+is+a+dynamic+regulator+of+epidermal+proliferation+and+differentiation+by+integrating+EGFR+and+Notch+signaling.">Ctip2 is a dynamic regulator of epidermal proliferation and differentiation by integrating EGFR and Notch signaling.</a> J Cell Sci. 125 (Pt 23), 5733-5744 (2012).</li><li>Lai, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commensal+bacteria+regulate+Toll-like+receptor+3-dependent+inflammation+after+skin+injury.">Commensal bacteria regulate Toll-like receptor 3-dependent inflammation after skin injury.</a> Nat Med. 15 (12), 1377-1382 (2009).</li><li>Bernard, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+radiation+damages+self+noncoding+RNA+and+is+detected+by+TLR3.">Ultraviolet radiation damages self noncoding RNA and is detected by TLR3.</a> Nat Med. 18 (8), (2012).</li><li>Zhang, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+Peptide+LL37+and+MAVS+Signaling+Drive+Interferon-beta+Production+by+Epidermal+Keratinocytes+during+Skin+Injury.">Antimicrobial Peptide LL37 and MAVS Signaling Drive Interferon-beta Production by Epidermal Keratinocytes during Skin Injury.</a> Immunity. 45 (1), 119-130 (2016).</li><li>Borkowski, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-Like+Receptor+3+Activation+Is+Required+for+Normal+Skin+Barrier+Repair+Following+UV+Damage.">Toll-Like Receptor 3 Activation Is Required for Normal Skin Barrier Repair Following UV Damage.</a> J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).</li><li>Borkowski, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toll-like+receptor+3+activation+is+required+for+normal+skin+barrier+repair+following+UV+damage.">Toll-like receptor 3 activation is required for normal skin barrier repair following UV damage.</a> J Invest Dermatol. 135 (2), 569-578 (2015).</li><li>Zillessen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+role+of+dipeptidyl+peptidase+4+(DPP4)+in+primary+human+(pre)adipocytes.">Metabolic role of dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) in primary human (pre)adipocytes.</a> Sci Rep. 6, 23074 (2016).</li><li>Wells, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+macrophage-inducible+C-type+lectin,+mincle,+is+an+essential+component+of+the+innate+immune+response+to+Candida+albicans.">The macrophage-inducible C-type lectin, mincle, is an essential component of the innate immune response to Candida albicans.</a> J Immunol. 180 (11), 7404-7413 (2008).</li><li>Vasioukhin, V., Bauer, C., Yin, M., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+actin+polymerization+is+the+driving+force+for+epithelial+cell-cell+adhesion.">Directed actin polymerization is the driving force for epithelial cell-cell adhesion.</a> Cell. 100 (2), 209-219 (2000).</li><li>Zhuang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TNF+receptor+p55+plays+a+pivotal+role+in+murine+keratinocyte+apoptosis+induced+by+ultraviolet+B+irradiation.">TNF receptor p55 plays a pivotal role in murine keratinocyte apoptosis induced by ultraviolet B irradiation.</a> J Immunol. 162 (3), 1440-1447 (1999).</li><li>Lichti, U., Anders, J., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+short-term+culture+of+primary+keratinocytes,+hair+follicle+populations+and+dermal+cells+from+newborn+mice+and+keratinocytes+from+adult+mice+for+in+vitro+analysis+and+for+grafting+to+immunodeficient+mice.">Isolation and short-term culture of primary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newborn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for grafting to immunodeficient mice.</a> Nat Protoc. 3 (5), 799-810 (2008).</li><li>Dlugosz, A. A., Glick, A. B., Tennenbaum, T., Weinberg, W. C., Yuspa, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+utilization+of+epidermal+keratinocytes+for+oncogene+research.">Isolation and utilization of epidermal keratinocytes for oncogene research.</a> Methods Enzymol. 254, 3-20 (1995).</li><li>Jones, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+keratinocytes.">Isolation and culture of mouse keratinocytes.</a> CSH Protoc. 2008, (2008).</li><li>Pirrone, A., Hager, B., Fleckman, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+keratinocyte+culture.">Primary mouse keratinocyte culture.</a> Methods Mol Biol. 289, 3-14 (2005).</li><li>Yuspa, S. H., Kilkenny, A. E., Steinert, P. M., Roop, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+murine+epidermal+differentiation+markers+is+tightly+regulated+by+restricted+extracellular+calcium+concentrations+in+vitro.">Expression of murine epidermal differentiation markers is tightly regulated by restricted extracellular calcium concentrations in vitro.</a> J Cell Biol. 109 (3), 1207-1217 (1989).</li><li>Yuspa, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+for+proliferation+and+differentiation+in+keratinocytes.">Signal transduction for proliferation and differentiation in keratinocytes.</a> Ann N Y Acad Sci. 548, 191-196 (1988).</li><li>Fang, N. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+enhances+mouse+keratinocyte+differentiation+in+vitro+to+differentially+regulate+expression+of+papillomavirus+authentic+and+codon+modified+L1+genes.">Calcium enhances mouse keratinocyte differentiation in vitro to differentially regulate expression of papillomavirus authentic and codon modified L1 genes.</a> Virology. 365 (1), 187-197 (2007).</li><li>Kolly, C., Suter, M. M., Muller, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proliferation,+cell+cycle+exit,+and+onset+of+terminal+differentiation+in+cultured+keratinocytes:+pre-programmed+pathways+in+control+of+C-Myc+and+Notch1+prevail+over+extracellular+calcium+signals.">Proliferation, cell cycle exit, and onset of terminal differentiation in cultured keratinocytes: pre-programmed pathways in control of C-Myc and Notch1 prevail over extracellular calcium signals.</a> J Invest Dermatol. 124 (5), 1014-1025 (2005).</li><li>Marcelo, C. L., Gold, R. C., Fairley, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+1.2+mmol/l+calcium,+triamcinolone+acetonide,+and+retinoids+on+low-calcium+regulated+keratinocyte+differentiation.">Effect of 1.2 mmol/l calcium, triamcinolone acetonide, and retinoids on low-calcium regulated keratinocyte differentiation.</a> Br J Dermatol. 111, 64-72 (1984).</li></ol>

皮膚の表皮は、身体を外部環境から分離し保護し、水分喪失、病原体、熱およびUV照射からの損傷に対する重大な障壁として機能する。 KCは表皮の優勢な細胞系統であり、表皮KCの初代培養は、インビトロでの障壁形成の生物学的プロセスおよび環境傷害に対するKCの応答を研究および理解するのに有用なツールである。 ここでは、初代表皮KCを新生児および成体マ...

皮膚は体の最も大きな臓器であり、最も外側の層は表皮である。表皮は、身体を環境から分離する無傷の表皮障壁を形成する上で決定的に重要な役割を果たし、したがって水分喪失を防ぎ、アレルゲン、病原体およびUVB曝露などの環境傷害から防御する。表皮は、未分化基底ケラチノサイト（KC）の単一層から基底層、棘突起層、顆粒層および角質層からなる多層重層化上皮に発達する。表皮幹細胞および中継増幅細胞の両方からなる基底KCは、増殖性および未分化性である。基本的なKCが細胞周期を終了すると、細胞は分化に拘束され、細胞 - 細胞接合の成熟および表皮透過障壁（EPB）の形成を伴って、表皮の表面に向かって徐々に移動する。棘状層のKCは、早期の差異を示すケラチン10（K10）のようなイオンマーカー; KCが顆粒層に移動すると、細胞はフィラグリン（FLG）、ロリクリン（LOR）およびインボルクリン（INV）などの後期分化マーカーを発現する。角質層では、KCは最終的に分化した角質細胞になり、最終的に新しい細胞がそれらに取って代わると落屑から流出する。 カルシウムは、表皮において最も生理学的に作用する物質であると考えられ、 インビトロおよびインビボで同様の方法で分化を誘発する。正常な皮膚表皮において、カルシウムイオンは、皮膚表面1、2、3に向かって濃度が増加し、特徴的な「濃度勾配」を形成します。カルシウム濃度は、最も低い副層（基底および棘の層）の低レベルから上部の顆粒層のピークまで上昇し、次いで最も表面の層（角質層）において無視できるレベルまで低下する。<html>カルシウム勾配は、カルシウム透過性がKC分化の重要な役割を果たすことを裏付ける成分透過性障壁の出現と同時に発生する。 インビトロでは 、低カルシウム（0.02-0.1mM）は単層としての基底KCの増殖を維持するが、高カルシウム（&gt; 0.1mM）はタイトジャンクション形成および誘導によって示されるように細胞の最終分化への迅速かつ不可逆的なコミットメントを誘導する基底KCS 4、5〜高カルシウム処理時LOR及びINVの。 障壁形成に加えて、表皮KCも皮膚の先天性免疫系の重要な構成要素である。 UVB照射または傷害時に放出される病原体または損傷関連分子パターン（DAMP）に応答して、KCはTNFα、IL6およびIFNβのような大量の炎症性サイトカインを産生し、免疫系の活性化をもたらす&gt; 6、7、8、9。 KCSから適切な炎症性シグナル伝達は、病原体のクリアランスに必要であるが、制御されない炎症性応答は、乾癬および酒6,8として自己炎症性皮膚疾患の発生をトリガすることができます。 全体として、KCは、無傷の皮膚バリアを維持し、病原体侵襲または環境傷害に対する免疫応答を開始する上で重要な役割を果たす。したがって、表皮KCの初代培養は、上皮生物学、KC分化、およびKC刺激による自然免疫応答を研究するための有用な技術である。主要マウス表皮KCの単離および培養は、KCの感受性および様々な外部刺激剤に対する感受性のために、困難なプロセスであり得る。ここでは、新生仔マウスの皮膚からKCを単離して培養する方法を説明します。成体マウスの尾の皮膚。成人のKC単離では、以下の理由により、この組織から十分な量の生存可能なKCを単離することが困難なため、マウス背側皮膚を使用しない：第1に、毛周期（休止期）の休止期における成人背側皮膚は、真皮からの表皮の非効率的な分離をもたらし、これは成功したKC単離のための重要なステップである。第2に、成人の背部皮膚上に存在する高い毛嚢密度は、真皮から表皮を分離することの困難さにさらに寄与する。その代わりに、我々は成体マウスKCsの供給源として尾皮膚を日常的に使用する。なぜなら、この上皮は表皮のKCの3〜5層でより厚いからである。それはまた、表皮の分離を妨げない、より低い毛嚢密度を有し、したがって、マウスの年齢および毛髪サイクリング段階に関係なく、成体マウス尾皮膚からのKC単離を可能にする。孤立した新生児タルKCをゼラチンコート培養皿に播種し、新生児対応細胞と比較して成体細胞が接着する能力が損なわれているため、コラーゲン被覆皿を用いて単離された成体KCを播種する。マウスKCを培養するために、低カルシウム基礎培地に、表皮成長因子（EGF）、ウシトランスフェリン、インスリン様増殖因子c1（IGF1）、プロスタグランジンE2（PGE2）、ウシ血清アルブミン（BSA）およびヒドロコルチゾンを含むdGSを補充する。最初の播種後2〜4日の間に、分化したKCの大部分は毎日の培地交換の間に洗い流すことができ、残りの接着細胞は典型的な敷石形態4を示し 、増殖し、早期分化マーカーK10を発現しない。

<table width="633">
	<tbody>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="width:171px;height:100px;">C57BL/6 neonates or adult wildtype mice</td>
			<td style="width:177px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">000664</td>
			<td style="width:167px;">Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:171px;height:60px;">KC basal medium (EpiLife)</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">MEPICF500</td>
			<td style="width:167px;">basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl2</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:171px;height:60px;">Defined Growth Supplement (dGS)</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">S0125</td>
			<td style="width:167px;">defined growth supplements for culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Dispase powder</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">17105041</td>
			<td style="width:167px;">enzyme to dissociate the epidermis from dermis</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Attachment Factor</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">S006100</td>
			<td style="width:167px;">gelatin-based coating material</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Coating Matrix</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">R011K</td>
			<td style="width:167px;">Collagen-based coating material</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="width:171px;height:80px;">TrypLE</td>
			<td style="width:177px;">Invitrogen, Carlsbad, CA</td>
			<td style="width:119px;">12604-013</td>
			<td style="width:167px;">A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">100 &#956;m Cell Strainer Nylon mesh</td>
			<td style="width:177px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">352360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="width:171px;height:60px;">CCK-8 cell viability Kit</td>
			<td style="width:177px;">Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD</td>
			<td style="width:119px;">CK04-11</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II</td>
			<td style="width:177px;">BD Biosciences, San Jose, CA</td>
			<td style="width:119px;">555268</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Corded Hand-Held UV Lamps</td>
			<td style="width:177px;">Spectronics, Westbury, NY</td>
			<td style="width:119px;">EB-280C</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:171px;height:20px;">8-watt UV tubes</td>
			<td style="width:177px;">Spectronics, Westbury, NY</td>
			<td style="width:119px;">BLE-8T312</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="width:171px;height:40px;">Light Inverted Microscope for cell culture</td>
			<td style="width:177px;">ZEISS, Jena, Germany</td>
			<td style="width:119px;">Axio Observer</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="width:171px;height:20px;">Fluorescent Microscope</td>
			<td style="width:177px;">Olympus</td>
			<td style="width:119px;">BX41</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and culture of primary mouse keratinocytes from neonatal and adult mouse skin

ケラチノサイト（KC）は、皮膚の最外層である表皮の優勢な細胞型である。上皮KCは、UVB照射または病原体などの環境傷害に対するインタクトな皮膚バリアを形成することによって、またそれらの傷害に対して炎症反応を開始することによって、皮膚防御を提供する上で重要な役割を果たす。ここでは、新生児マウス皮膚および成体マウス尾皮膚からKCを単離する方法を説明する。本発明者らはまた、キレキシブウシ胎児血清（cFBS）と比較して規定された成長補助剤（dGS）を用いて培養条件を記載する。機能的には、新生児および成人の両方のKCが、高カルシウム誘発性の分化、タイトジャンクションの形成および層別化に対して高い応答性を有することを示す。さらに、培養された成体KCは、UVB誘発細胞死に感受性であり、UVB照射の際に大量のTNFを放出し得る。一緒に、ここに記載された方法は、インビトロモデルの設定のための研究者にとって有用であろう新生児マウスおよび/または成体マウスの表皮生物学を研究する。

高カルシウムは、新生児および成人のKCの最終分化を誘導した。 0.06mM CaCl 2で平板培養し維持した初代マウス表皮KCは、単層として増殖し、個々の細胞は、明確な細胞間空間を有する多角形を有し、コンフルエントになると、石畳の外観を示した（ 図1Aおよび図2A ）。 CaCl 2を0.2mMまで上昇させる...

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Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

上皮ケラチノサイトは、機能的な皮膚バリアを形成し、外部環境傷害に対する宿主防御の最前線に位置付けられる。ここでは、新生児および成体マウスの皮膚からの表皮ケラチノサイトの単離および初代培養、およびケラチノサイトからの最終分化およびUVB誘発性炎症反応の誘導のための方法を記載する。

新生児および成人マウス皮膚由来の初代マウスケラチノサイトの単離および培養

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

Research

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Biology

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