Name: phase behavior of charged vesicles under symmetric and asymmetric solution conditions monitored with fluorescence microscopy
Uploaded: 2017-10-24T14:00:00
Duration: 10 min 8 s
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Diese Arbeit ist Teil des Konsortiums MaxSynBio, die gemeinsam durch das Bundesministerium für Bildung und Forschung in Deutschland und der Max-Planck-Gesellschaft finanziert wird.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Erfolgreiche Produktion von GUVs für Phase Zustand Beobachtungen unter symmetrischen und asymmetrischen hohen Salzgehalt Bedingungen
Die hier vorgestellten Protokolle stellt eine Strategie zur Bewertung des Einflusses der hohen Salzgehalt Puffer und Lösung Asymmetrie der Membran Phase Stand der geladenen GUVs über eine Vielzahl von Kompositionen. Eine der großen Herausforderungen zur Erreichung dieses Ziels war die Produktion von geladenen GUVs in hoher Salzgehalt Puffern.
Durch einen einfachen spontanen Schwellung Ansatz, umfasst eine Pre-Hydratation der hinterlegten Lipid-Film und ein über Nacht letzte Hydratation Schritt für Vesikel Wachstum wird erfolgreich GUVs in Zuckerlösung und hoch-Kochsalzlösung Puffer hergestellt. Es ist wichtig zu beachten, dass die Lipid-Ablagerung auf einer aufgerauten PTFE-Platte darauf sogar Lipid Verbreitung zu Unilamellar Vesikel erfolgen sollte. Darüber hinaus gilt es jeden Schritt während der Vesikel Vorbereitung bei einer Temperatur durchführen wo die Lipid-Film in einem homogenen und flüssige Phase Zustand befindet. Sonst, die Vesikel Bevölkerung werden Polydisperse in Zusammensetzung und beeinflussen die abschließende Phase Zustand Populationsanalyse. Das spezifische Protokoll für die spontane Schwellung GUVs Erträge einer Bläschen Klumpen auf der einen Seite bietet die Möglichkeit um es wieder in kleinen Mengen zu unterbrechen hochkonzentriert Vesikel Dispersionen und auf der anderen Seite bietet asymmetrische Lösung Bedingungen durch die Membran bei gleichzeitiger Minimierung der Verdünnung von Vesikeln8,28. Es ist wichtig, dass während der Vesikel Verdünnung oder externe Lösung auszutauschen, innen und draußen Osmolarities abgestimmt, bleiben wie Morphologie Veränderungen durch Osmolarität Diskrepanzen können induzieren oder Lo + Ld Phase Trennung41 verhindern oder bei hypotone Bedingungen führen Bläschen platzen.
Hier führte Versuche, Electroformation Protokolle in hoher Salzgehalt Lösung optimieren in der Produktion keine GUVs während PVA-gestützte Schwellung multilamellar Vesikel ergab. Obwohl es längere Zubereitungszeiten und Ergebnisse in Vesikel Chargen von niedriger Qualität10,17, die erfolgreiche Produktion von geladenen Vesikeln durch spontane erfordert kommt Schwellung mit zusätzlichen Vorteilen. Es erfordert minimalen Aufwand während wodurch ausreichende Erträge für statistische Batch Analysen und im Gegensatz zu Electroformation, waren keine hoch entwickelten Geräten oder Optimierung erforderlich. Darüber hinaus sind keine Verunreinigungen durch Lipidoxidation42,43beobachtet worden. Laut Literatur gibt es keine Unterschiede zwischen den Lipid-Kompositionen von Vesikeln und die entsprechenden Bestände, aus denen sie7,17angebaut wurden. Darüber hinaus fordert die Vesikel Bildung auf einem PTFE-Substrat nicht die Aufnahme Verunreinigungen im Gegensatz zu Gel-gestützte Schwellung Methoden wo fremde Moleküle durch das Substrat23eingeführt werden können. Electroformation kommt mit weiteren Nachteile im Zusammenhang mit übermäßigen Vesikel Verdünnung beim asymmetrischen Lösungsbedingungen erstellen. GUVs, produziert von Electroformation befinden sich in der Regel als homogene Dispersion (im Gegensatz zu der hochkonzentrierten Vesikel Aufhängung in Form von einem Klumpen gebildet während der spontanen Schwellung). Verdünnung der externen Lösung würde die Zahl von Vesikeln sowie erheblich mindern. Darüber hinaus wurde, dass DOPG/eSM/Chol GUVs von Electroformation in Saccharose produziert im Laufe dieser Arbeit, die es beobachtet wurde, instabil, wenn in hoher Salzgehalt Puffer verdünnt. Fluoreszenz von Lipid-Patches auf den Objektträger darauf hingewiesen, dass die Bläschen platzen würde, bevor ihre Sichtkontrolle möglich war. Eine solche Instabilität kann zu einer erhöhten Membran Spannungen von Vesikeln vorbereitet durch Electroformation im Vergleich zu denen, die durch spontane Schwellung10zugeschrieben werden.
Obwohl die Vesikel Verdünnung eine einfache und schnelle Annäherung an asymmetrische GUV Lösungsbedingungen zu schaffen ist, es vollbringt nur einen Teillösung externen Austausch, wenn auch in einem hohen Anteil (hier: 95 %, Abbildung 2), wie bei der Verdünnung, Spuren der Schwellung der Lösung bleiben. Die Wahl des Grades der externe Lösung Exchange ist ein Kompromiss zwischen sich die Bläschen Klumpen zusammen mit der Schwellung (Abschnitt 2) pipettieren und verdünnen es nicht zu viel. Daher haben wir einen alternative mikrofluidischen Ansatz an anderer Stelle erläutert im Detail37 , der eine schnelle und komplette externe Lösung Austausch während der GUV Phase Zustand Beobachtungen ermöglicht zu überprüfen, die Phase Zustand Bemerkungen für verdünnt Vesikel. Die Beobachtungen der Phase Zustand Variationen beim Wechsel von symmetrischen auf asymmetrischen Lösungsbedingungen beobachtet tatsächlich übereinstimmen. Darüber hinaus beide Methoden erzeugen asymmetrische Lösungsbedingungen gezeigt, hier sind vergleichsweise schnell (vgl. Nr.8) und verfügen über keine bekannten Risiken des lokalen Zusammensetzung Veränderungen (vgl. Referenzen30,31), Zunahme der Membran Spannung (Vergleiche Referenz32) oder Nahwärme (Vergleiche Referenz33), alternative Methoden in der Einführung diskutiert. Während das mikrofluidischen fangen ist eine osmotische Gleichgewicht zwischen Vesikel innen und außen nicht nur wesentliche Phase Zustand Artefakte wie oben erwähnt, sondern auch Deflation verursacht durch Hypertone Lösungsbedingungen zu vermeiden die eingeschlossene GUVs, schlüpfen verursachen könnte durch die Beiträge nach einem externen Lösung.
Obwohl spontane Schwellung erfolgreich angewendet wurde, um die ungeladenen wachsen können Vesikel aus einem DOPC/eSM/Chol-System, in anderen Fällen, das Fehlen von Gebühren GUV Schwellungen aufgrund der daraus resultierenden mangelnden Abstoßung zwischen den einzelnen Doppelmembranen44 beeinträchtigen. . Verlängerung vor Schwellungen oder die Einführung von sperrigen Lipid Headgroups kann dieses Problem45entgegen. Darüber hinaus variieren die Vesikel Stabilität nach ihrer Verdünnung in Lösungen anders als für die Schwellung für verschiedene Lipid-Kompositionen und Verdünnung Medien, die wir hier nicht untersucht haben. Wir haben auch die Möglichkeit des Tunings des mittlere Durchmesser der GUV mit der hier vorgestellten Art der Zubereitung nicht erforscht. Aber Parameter wie Vesikel Zusammensetzung und Schwellungen Lösung werden voraussichtlich die Ergebnisse beeinflussen. Die Anwendung von Alternativmethoden46 kann größere Vesikel für die Lipide und die hier eingesetzten Lösungen ergeben, jedoch kommen sie mit anderen Nachteile der Methode zugeordnet. Der oben beschriebene Ansatz GUVs in symmetrische und asymmetrische hohen Salzgehalt Bedingungen zu produzieren stellt ein mögliches Instrument für weitere Studien von Vesikeln aus verschiedenen Lipid-Kompositionen und verstreut in verschiedenen Medien. Wie wir diese Möglichkeiten nicht erforscht haben, werden zukünftige Studien zeigen wie generell die GUV Vorbereitung und Verdünnung Methoden angewendet werden können.
Phasentrennung bei unterschiedlichen Temperaturen zu beobachten
Gibt es verschiedene Versuchsaufbauten geeignet, GUVs bei unterschiedlichen Temperaturen zu studieren. Während diese Setups nicht häufig in der Literatur ausführlich beschrieben sind, stellt die aktuelle Arbeit eine grundlegende Versammlung für solche Studien.
_content "> Kontrollmessungen zeigen, dass die Temperatur dieses im eigenen Hause entwickelt und gebaut Kammer genau durch einen Thermostat gesteuert wird und Temperaturgradienten im Inneren der Kammer innerhalb der experimentellen Temperaturauflösung sind. Es ist sichergestellt, dass die experimentellen Thermik mit der Lesung des Thermostats übereinstimmen.
Bei der Beurteilung der GUV Phase Staaten über einen breiten Temperaturbereich ist es wichtig, dass die beobachteten Vesikel sind gut equilibriert, nachdem die Temperatur geändert wurde. Ein möglicher Weg, um dies zu gewährleisten ist für Hysterese zu überprüfen. Wenn Hysterese vorhanden ist, sollte die Temperatur Schritte verringert werden und/oder Gleichgewichtherstellung Mal erhöht. Als Temperatur Kontrolle in diesem Werk entsteht durch eine wässrige Thermostat die Arbeitstemperaturen im Idealfall auf 0 - 100 ° c begrenzt ist Diese können mithilfe von anderen Temperatur Kontrolle Flüssigkeiten wie Öl oder durch den Einsatz von anderen Installationen, z.B. ein Peltier Gerät erweitert werden. In der Praxis wird die Arbeitstemperatur auch durch mögliche Kondensation oder Verdampfung begrenzt. Darüber hinaus wird das Auftreten von einem Steady-State Temperaturgradienten in der Beobachtung Kammer für Temperaturen weit weg von der Raumtemperatur, wahrscheinlicher. Die bildgebende Geräte kann auch bei extremen Temperaturen geschädigt werden. Für typische Temperaturbereiche geeignet für Lipid Vesikel Studien (~ 10-50 ° C7,9) Schäden an der Ausrüstung der Beobachtung gezogen werden aber ist in der Regel nicht zu erwarten.
Vesikel Domäne Beobachtung Artefakte
Es gibt eine Reihe von Quellen für Beobachtung Artefakte mit Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie. Vor allem sollte einem bewusst sein, dass die maximale Auflösung R des Objekts angewendet für die Sichtprüfung der Vesikel Phase Staaten, die Nachweisgrenze von Lipid-Domänen bestimmt: 
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56034/56034eq2v2.jpg"> wo λ ist die Emissionswellenlänge und NA ist die numerische Apertur des Ziels. Ein typisches Ziel mit einem 40 x Vergrößerung und eine NA von 0,6 der grünen Emission erkennt Licht rund 560 nm erreichen würde eine optische Auflösung von ~0.6 µm. daher Studien, die Phase von Vesikeln hergestellt aus bestimmten Lipid-Mischungen unter verschiedenen vergleichen Bedingungen sollten das gleiche Ziel für die gleichen Lipid-Mischung verwenden.
Ein weiteres Artefakt ist das Auftreten von Lipid-Domains als Folge Foto-Lipidoxidation aufgrund einer längeren Exposition gegenüber Anregung Licht41. Foto-Schaden tritt bevorzugt an ungesättigten Kohlenwasserstoffen Lipid Moieties. In der Tat einige Lipid-Kompositionen, solche Domain Bildung von zunächst homogene Vesikel wurde beobachtet hier nach längerer Belichtung Anregung (~ 30 s). Um diesem Problem entgegenzuwirken, wurde das Anregungslicht auf ein Sichtfeld konzentriert für nur ein paar Sekunden für die Beurteilung der Phase gehalten. DiIC18 war daher für unsere Zwecke geeignet. Andere Farbstoffe jedoch möglicherweise sehr viel empfindlicher und können bei geringer Erregung Intensitäten und mit kürzeren Erregung Belichtung behandelt werden müssen.
Mechanische Schubspannung aus der Pipette Übertragung der Vesikel mischt potenziell Domänen vorübergehend, wodurch die scheinbare Vesikel Phasenverhalten verzerren. Für einige Chargen verschiedener Vesikel zeigten andere Phase Verhalten 0 min und 5 min nach Pipette übertragen auf das Mikroskop-Deckglas. Auch die Scherspannung induziert durch die Strömung in mikrofluidischen Gerät nachweislich mischen47Domäne führen. Vesikel sollte für eine ausreichende Menge an Zeit für Gleichgewichtherstellung vor Beobachtung ungestört bleiben. Im Rahmen dieser Studie wurden Vesikel eingeschlossen auf dem mikrofluidischen Gerät für 1 h nach Vesikel be- und Lösung Austausch vor Beobachtung ungestört.
Einige der oben genannten Schwierigkeiten sowie die Beschränkung durch die Lichtbeugung Grenze, alternative Methoden wie magnetischen Kernresonanz-Spektroskopie48 oder Superresolution Mikroskopie-Techniken49 zu vermeiden konnte eingesetzt werden.
Fazit und Ausblick
Die vorgestellte Arbeit zeigt eine Reihe von Methoden, die für die Analyse des Einflusses der hohen Salzgehalt symmetrischen und asymmetrischen Lösungsbedingungen auf Membran Phasentrennung ermöglicht. Alle vorgestellten Methoden sind für andere Anwendungen geeignet. Das mikrofluidischen Gerät bietet zum Beispiel eine Plattform, um die Kinetik der Bereich Bildung und verschwinden nach der Induktion der Lösung Asymmetrie zu studieren. Darüber hinaus könnte Domäne Auftritt als eine Funktion der Salzkonzentration auf diese Weise geprüft werden. Alle Methoden können auch verwendet werden, zu betrachten, die Einfluss auf das Phasenverhalten mit anderen Lösungen von Interesse.

Seit die Beobachtung von Mikron mittelständische Domains in flüssig-flüssig Phase getrennt giant Unilamellar Vesikeln (GUVs) durch Fluoreszenz-Mikroskopie wurden GUVs als Modellsystem zur untersuchen die Lipid Floß Hypothese1,2 , 3 . Wie die ihre freistehende Bilayer im Bereich, die von biologischen Zellen liegt, sind sie geeignet Mimik der Plasmamembranen mit der hypothetischen Flöße. Zahlreiche Studien über solche GUVs wurden mit Bläschen, die verstreut in reinem Wasser, Saccharose oder niedrigen Salzgehalt Lösungen4,5,6,7,8aufgeführt. Diese Bedingungen spiegeln jedoch nicht physiologisch relevanten Exposition von Biomembranen zu hoher Salzgehalt Umgebungen und Trans-Membran Lösung Asymmetrie, wie die Bedingungen für die Zellen.
Die Phase Zustände der geladenen Mehrkomponenten GUVs wurden in dieser Arbeit und in einer früheren Publikation aus unserer Gruppe9in Abhängigkeit von der Anwesenheit von Salz und Lösung Asymmetrie durch die Membran untersucht. GUVs bereiteten aus Mischungen von verschiedenen Übersetzungen von Dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), Ei Sphingomyelin (eSM) und Cholesterin (Chol) in Zuckerlösung (mit Osmolarität von 210 mOsm/kg) oder hohen Salzgehalt Puffer (100 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7.5, 210 mOsm/kg). Die Lipid-Wahl wurde durch die bereits erhaltenen Daten über das Phasendiagramm dieser Mischung6,8gerechtfertigt.
Eine Reihe von Methoden zur Herstellung von GUVs gibt es in der Literatur10,11,12 (beachten Sie, dass hier, wir werden nicht berücksichtigt, dass diejenigen, die Übertragung von Lipiden aus einer Öl-basierte auf eine wässrige Phase 13 , 14 wegen der inhärenten Gefahr von den verbleibenden Ölreste in der Membran, die das Phasenverhalten beeinträchtigen können). Die Vorbereitung der GUVs im hohen Salzgehalt Puffer ist mit besonderen Herausforderungen verbunden. Für Lösungen von geringer Ionenstärke präsentiert die Electroformation Methode15,16 eine schnelle Möglichkeit, hohe Erträge mit kleinen Mängeln10,17GUVs vorzubereiten. Die Methode basiert auf Abscheiden einer Schicht von Lipiden auf eine leitfähige Oberfläche (Elektrode), trocknen und hydratisierenden sie während der Anwendung eine AC-Bereich mit einer wässrigen Lösung. Diese Methode erfordert jedoch Anpassungen wenn Salz ist in wässriger Lösung18,19. Es wird angenommen, dass die treibende Kraft für das Wachstum der Vesikel durch Electroformation Elektroosmose16 , bei hohen Leitfähigkeiten20behindert ist. Daher ist Electroswelling GUVs in hoher Salzgehalt Lösungen keine einfache Lösung wie es Optimierung für unterschiedliche Salzkonzentrationen in die Schwellung Lösung vorhanden erfordert. Gel-gestützte Vesikel Schwellung21,22 ist eine mögliche Alternative zu Electroformation mit noch schnelleren Bildung Zeiten. Dieser Ansatz stützt sich auf die verbesserte Lipid-Film-Hydratation, wenn eine Gel (Agarose oder Polyvinylalkohol (PVA)) als Substrat verwendet wird. Diese Ansätze jedoch kommen mit der Membran Kontaminationsrisiko bei Agarose-basierte Schwellung23 und/oder Temperatur Grenzen wie im Fall von PVA-basierte Schwellung. Ebenso wurde ein Protokoll GUVs auf ein Zellulose-Papier-Substrat wachsen kürzlich etablierten24. Allgemeine Probleme dieser Methode sind die mangelnde Kontrolle über die Substrat-Reinheit sowie die Verwendung von großen Mengen von Lipid. In dieser Arbeit werden wir vorstellen und präsentieren die Vorteile der traditionellen Methode für GUV-Vorbereitung, nämlich die spontane Schwellung Methode25,26. Es besteht der Trocknung eine Lipidschicht auf einem lipophiler Substrat, in Wasserdampf Atmosphäre und anschließende Schwellung Schwellung Wunschlösung feuchtigkeitsspendende (siehe Abbildung 1 und Details im Abschnitt Protokoll). Diese Methode bietet keine Kontrolle über die Größenverteilung der Vesikel und führt zu insgesamt kleiner Bläschen im Vergleich zu Methoden, wobei die Produktion von elektrischen Feld unterstützt wird, Polymersubstrates oder mikrofluidischen bedeutet. Jedoch eignet die Vesikel Qualität und Größe sich für die Prüfung der Membran Phase Zustand als erforscht hier.
Asymmetrie zwischen den Lösungen durch die Membran Vesikel zu schaffen ist mit bestimmten Herausforderungen sowie verbunden. Eine häufig verwendete Methode ist die direkte Verdünnung der Vesikel Suspension in die gewünschte externe Lösung27,28. Dies verringert jedoch auch die Vesikel Verteilung Dichte. Eine andere Strategie ist, langsam die externe Lösung um GUVs ließ sich am unteren Rand einer Durchflusszelle, die Lösung in - ermöglicht Austausch und viel. Zur Vermeidung von stören oder sogar verlieren die Vesikel mit der Strömung sind niedrige Durchflussmengen angewandte8, die dieser Ansatz Zeit ineffizient macht. Keiner dieser Ansätze garantiert volle externe Lösung Austausch. Eine offensichtliche Lösung ist, Vesikel zu immobilisieren, um zu vermeiden, während eine externe Lösung Austausch zu verlieren. Biotinylierte GUVs kann beispielsweise auf einer Streptavidin beschichteten Oberfläche29angebunden werden. Aber dieser Ansatz kann zu kompositorischen Variationen bei den eingehalten führen und damit die Membran nicht eingehalten Segmente30,31. Die Anwendung der magnetische oder elektrische Felder Vesikel Ergebnisse bei der Verhängung von Membran trap spannen32. Einsatz von optischen Pinzette zum Abfangen eines Vesikels erfordert, dass einen Griff angebracht (d.h. eine Perle), während die Verwendung von optischen Bahren Nahwärme33verbunden sein kann. Trapping von GUVs kann auch erfolgen durch auf Platindrähte ohne endgültige Loslösung34wachsen. Dies ergibt aber Vesikel, die nicht isoliert sind und die in der Regel mit den Drähten verbunden sind, oder andere Vesikel von dünnen Lipid-Röhren (Leinen).
Die vorgestellte Arbeit zeigt Strategien um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden. Dabei präsentieren wir zunächst eine detaillierte Beschreibung der spontanen Schwellung Methode angepasst und optimiert für die Herstellung von GUVs in hoher Salzgehalt Puffern. Danach führen wir zwei Ansätze, um asymmetrische Lösungsbedingungen durch einfache Verdünnung oder die Nutzung eines Geräts mikrofluidischen effizient zu erstellen. Denn unser Ziel die Analyse der Membran Phase Bundesstaat GUVs in verschiedenen Lösungsbedingungen ist, beschreiben die nachfolgenden Abschnitte Kriterien für erfolgreiche statistische Analysen und vorliegenden Hinweise zur Vermeidung von falschen Kategorisierung.
Die Analysen wurden unter isothermen Bedingungen sowie unter schwankenden Temperaturen durchgeführt. Während Temperatur camerikanischem wird häufig eingesetzt, Details über experimentelle Temperaturregelung Kammern sind selten beschrieben. Hier präsentiert eine hauseigene gebaute Installation GUVs bei verschiedenen Temperaturbedingungen zu beobachten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol), sodium salt</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840475C</td>
			<td>abbreviated as DOPG in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chicken egg sphingomyelin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td>abbreviated as eSM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62; 98 %)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700000</td>
			<td>abbreviated as Chol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#129;&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D-282</td>
			<td>abbreviated as DiIC18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade (&#8805; 99.8 %)</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (&#62; 99.8 %)</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (37 %)</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (&#8805; 99.9 %)</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (&#8805; 99.5 %)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded vial 45x27 mm, 15 mL</td>
			<td>Kimble</td>
			<td></td>
			<td>Soda flat bottom, white screw cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MP220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Gonotec</td>
			<td>Osmomat030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epi-fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 40x, 0.6 NA</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LD Achroplan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 40x, 0.75 NA</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 63x, 0.9 NA</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 &#177; 0.01 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip, 22x22 mm, 0.17 &#177; 0.01 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;aser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Bremix Flexible Packaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 5 mL, 10 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>GVS North America</td>
			<td>Cameo 25AS, 1213723</td>
			<td>Acetate, sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phase behavior of charged vesicles under symmetric and asymmetric solution conditions monitored with fluorescence microscopy

Phase getrennt giant Unilamellar Vesikeln (GUVs) ausstellen, nebeneinander Flüssigkeit bestellt und Flüssigkeit ungeordnet Domains sind ein gemeinsames biophysikalische Instrument um die Lipid-Raft-Hypothese zu untersuchen. Zahlreiche Studien, vernachlässigen aber die Auswirkungen der physiologischen Lösungsbedingungen. Auf diesem Konto präsentiert die aktuelle Arbeit die Wirkung des hohen Salzgehalt Puffer und Trans-Membran Lösung Asymmetrie auf flüssig / flüssig Phasentrennung in aufgeladenen GUVs von Dioleylphosphatidylglycerol, Ei Sphingomyelin und Cholesterin gewachsen. Die Effekte wurden unter Isothermen und unterschiedlichen Temperaturen untersucht.
Ausrüstung und experimentelle Strategien für die Überwachung der Stabilität des koexistierende flüssige Domänen in aufgeladenen Vesikel unter symmetrischen und asymmetrischen hohen Salzgehalt Lösungsbedingungen beschrieben. Dies beinhaltet einen Ansatz zur geladenen Mehrkomponenten GUVs in hoher Salzgehalt Puffer bei hohen Temperaturen zu bereiten. Das Protokoll beinhaltet die Möglichkeit, einen teilweisen Austausch der externe Lösung für eine einfache Verdünnungsschritt durchführen, bei gleichzeitiger Minimierung der Vesikel-Verdünnung. Ein alternativer Ansatz wird vorgestellt mit einem mikrofluidischen Gerät, der eine externe Komplettlösung Austausch ermöglicht. Die Lösung-Auswirkungen auf die Phasentrennung wurden auch unter schwankenden Temperaturen untersucht. Zu diesem Zweck stellen wir die Grundkonstruktion und Dienstprogramm eine intern eingebaute Temperatur Kontrollkammer. Darüber hinaus denken wir über die Bewertung des GUV Phase, zugeordnet: Fallstricke und wie diese zu umgehen.

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Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy

Experimente an Phase getrennt giant Unilamellar Vesikeln (GUVs) vernachlässigen häufig physiologische Lösungsbedingungen. Dieses Werk stellt Ansätze, um die Auswirkungen der hohen Salzgehalt Puffer auf flüssig / flüssig Phasentrennung in aufgeladenen Mehrkomponenten GUVs als Funktion des Trans-Membran Lösung Asymmetrie und Temperatur zu studieren.

Phasenverhalten von geladenen Vesikeln unter symmetrischen und asymmetrischen Lösungsbedingungen überwacht mit Fluoreszenz-Mikroskopie

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