Name: phase behavior of charged vesicles under symmetric and asymmetric solution conditions monitored with fluorescence microscopy
Uploaded: 2017-10-24T14:00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

עבודה זו היא חלק הקונסורציום MaxSynBio, אשר ממומנת במשותף על ידי משרד החינוך הפדרלי, מחקר של גרמניה ושל חברת מקס פלנק.

המחברים אין לחשוף.

ייצור מוצלח של האנשים שנגדם עבור שלב תצפיות המדינה תחת תנאי מליחות גבוהה סימטרי אסימטרי
הפרוטוקולים המובאת כאן מציג אסטרטגיה כדי להעריך את ההשפעה של אסימטריה מאגר והפתרון מליחות גבוהה על המדינה שלב ממברנה של האנשים שנגדם טעון על מגוון רחב של יצירות. אחד האתגרים הגדולים לקראת השגת מטרה זו היה הייצור של האנשים שנגדם טעונה במאגרי מליחות גבוהה.
אנחנו בהצלחה מיוצר כשמרוגזים סוכרוז פתרון ומאגר גבוהה-תמיסת מלח על ידי פשוטה ספונטנית נפיחות בגישה, הכולל שלב טרום הידרציה של הסרט השומנים הופקדו שלב סופי הידרציה לילה לצמיחה שלפוחית. חשוב לציין כי העדות השומנים נעשה על צלחת PTFE roughened כדי להבטיח השומנים אפילו הפצת להניב unilamellar שלפוחית. יתר על כן, זה חיוני לבצע בכל שלב במהלך שלפוחית ההכנה בטמפרטורה איפה הסרט שומנים בדם במצב שלב הומוגניים ולא נוזל. אחר, האוכלוסייה שלפוחית עשויים להיות polydisperse בהרכב, הטיה הניתוח המדינה שלב האוכלוסייה הסופית. פרוטוקול ספציפי עבור ספונטנית נפיחות של האנשים שנגדם התשואות צליעה שלפוחית אשר מצד אחד מציע את האפשרות להשעות אותו מחדש בכמויות קטנות כדי להשיג המרוכזת דיספרסיות סטירול שלפוחית, מצד ומספק פתרון אסימטרי תנאים על פני קרום תוך מזעור הדילול של שלפוחית8,28. זה חיוני כי במהלך הדילול שלפוחית או פתרון חיצוני להחליף, הבתוך ולהישאר מחוץ osmolarities מתאימים כפי מורפולוגיה השינויים שנגרמו על ידי אי התאמות osmolarity לגרום או למנוע Lo + Ld שלב ההפרדה41 או, במקרה של היפוטוניק תנאים, עלול להוביל שלפוחית מתפוצץ.
כאן, ניסיונות כדי למטב את הפרוטוקולים electroformation בתמיסה מליחות גבוהה כתוצאה בייצור של האנשים שנגדם לא בזמן נפיחות בסיוע PVA הניב שלפוחית multilamellar. אף-על-פי זה דורש זמן הכנה פעמים ואת תוצאות באצוות שלפוחית של איכות נמוכה10,17, ייצור מוצלח של שלפוחית טעון על ידי ספונטנית נפיחות מגיע עם יתרונות נוספים. זה דורש מאמץ מינימלי בזמן וכתוצאה מכך התשואות מספיק עבור ניתוחים סטטיסטיים אצווה, בניגוד electroformation, אין ציוד מתוחכם או אופטימיזציה נדרשו. יתר על כן, לא מציג על ידי חמצון השומנים נצפו42,43. בספרות אין הבדלים בין היצירות השומנים של שלפוחית המניות המתאימות שממנו הם גדלו7,17. יתר על כן, היווצרות שלפוחית על מצע PTFE אינו מנחה הכללת כל מציג בניגוד ג'ל בסיוע שיטות נפיחות איפה מולקולות זרות עשוי להיות הציג את המצע23. Electroformation מגיע עם חסרונות נוספים הקשורים דילול שלפוחית מופרז בעת יצירת תנאים פתרון אסימטרי. האנשים שנגדם המיוצר על ידי electroformation נמצאים בדרך כלל כמו פיזור הומוגנית (להבדיל ההשעיה שלפוחית מרוכז בצורה של צליעה נוצר במהלך נפיחות ספונטנית). כל דילול של הפתרון חיצוני באופן משמעותי לדלל את המספר של שלפוחית גם כן. יתר על כן, במהלך עבודה זו שזה היה ציין כי DOPG/eSM/חול כשמרוגזים המיוצר על ידי electroformation ב סוכרוז הפך יציב אם מדולל במאגר מליחות גבוהה. קרינה פלואורסצנטית מן השומנים טלאים על השקופית מיקרוסקופ ציינו כי שלפוחית להתפרץ לפני בדיקה ויזואלית שלהם היה אפשרי. ייתכן ולשייך כל כך יציבות מתח הממברנה מוגברות של שלפוחית שהוכן על-ידי electroformation לעומת הילדים מתקבל על ידי נפיחות ספונטנית10.
למרות דילול שלפוחית היא גישה קלה ומהירה ליצור תנאים אסימטרי של פתרון בוס, זה רק מושג החלפה חלקית פתרון חיצוני, גם אם לשבר גבוהה (כאן: 95%, איור 2), כמו על דילול, עקבות נפיחות פתרון יישאר. הבחירה של מידת ההחלפה פתרון חיצוני היא פשרה בין pipetting למעלה סבך שלפוחית יחד עם הפתרון נפיחות (סעיף 2) לא לדלל אותה יותר מדי. לפיכך, הצגנו גישה אלטרנטיבית microfluidic שעלון במקומות אחרים פרט37 המאפשר החלפה מהירה ושלמה פתרון חיצוני בתצפיות המדינה שלב בוס כדי לאמת את שלב המדינה תצפיותיו עבור מדולל שלפוחית. התצפיות של וריאציות מצב שלב בעת שינוי סימטרי אסימטרי פתרון תנאים נצפו אכן להיות בהסכם. בנוסף, שתי השיטות כדי ליצור פתרון אסימטרי בתנאים המוצגים כאן הם וזהובה מהירה (השווה הפניה למעורר8) ובאים עם אין הסיכונים הידועים של שינויים בהרכב מקומיים (להשוות הפניות30,31), לודיג מתח הממברנה (השווה התייחסות32), או חימום מקומי (השווה התייחסות33), באשר שיטות אלטרנטיביות נדון בהקדמה. במהלך ההשמנה microfluidic, איזון osmotic בין שלפוחית פנים וחוץ אינו חיוני רק כדי להימנע שלב המדינה חפצים כאמור לעיל, אלא גם דפלציה נגרמת על ידי פתרון hypertonic תנאים עלול לגרום את האנשים שנגדם לכוד לחמוק דרך ההודעות לאחר חילופי פתרון חיצוני.
אף-על-פי נפיחות ספונטנית יושם בהצלחה לגדול לא טעונים שלפוחית ממערכת DOPC/eSM/חול, במקרים אחרים, בהיעדר חיובים עשוי לפגום בוס נפיחות עקב המחסור שנוצר דחיה בין הפרט bilayers44 . הארכת תקופת טרום נפיחות או היכרות עם השומנים מגושם headgroups עשויה לסתור זו בעיה45. יתר על כן, היציבות שלפוחית לאחר דילול שלהם בפתרונות שונה מזו המשמש נפיחות עשויים להיות שונים עבור קומפוזיציות שונות השומנים ומדיה דילול, אשר לא חקרנו כאן. גם לא בחנו את האפשרות של כוונון הקוטר בוס ממוצע עם שיטת הכנה המובאת כאן. אבל פרמטרים כגון פתרון קומפוזיציה שלפוחית ונפיחות נוטים להשפיע על התוצאות. היישום של שיטות אלטרנטיביות46 , תניב שלפוחית גדול יותר שומנים ופתרונות המשמש כאן, עם זאת, הם עלולים לבוא עם חסרונות אחרים הקשורים עם השיטה. הגישה המתוארת לעיל כדי לייצר כשמרוגזים בתנאי מליחות גבוהה סימטרי ו אסימטרי מספקת כלי פוטנציאלי ללימודי של שלפוחית מורכב של יצירות שונות השומנים, התפזרו מדיה שונים. כמו לא בחנו את האפשרויות הללו, ניסויים עתידיים יראה איך בדרך כלל ניתן להחיל את השיטות דילול והכנה של בוס.
התבוננות שלב ההפרדה בטמפרטורות שונות
כיוונונים ניסיוני שונים מתאימים ללמוד כשמרוגזים בטמפרטורות שונות קיימים. בעוד כיוונונים אלה לא מתוארים בדרך כלל פירוט בתוך הספרות, העבודה הנוכחית מציגה אסיפה בסיסי ישימה עבור מחקרים כאלה.
_content "> בקרת מדידות להראות כי הטמפרטורה של זה בתוך הבית תוכנן ונבנה קאמרית נשלטת בצורה מדויקת על ידי תרמוסטט, מעברי צבע הטמפרטורה בתוך החדר נמצאים במרחק הרזולוציה טמפרטורה ניסיוני. זה מובטחת כי התנאים התרמיים ניסיוני עקביים עם הקריאה של התרמוסטט.
במהלך המבדק של בוס הברית בשלב מעל טווח טמפרטורה רחב, חשוב כי השלפוחיות המוגלתיות נצפתה גם הם equilibrated לאחר הטמפרטורה השתנה. דרך אפשרית. אחת כדי להבטיח זאת הוא לבדוק עבור היסטרזיס. אם היסטרזיס, השלבים הטמפרטורה צריכה להיות ירד ו/או equilibration פעמים גדל. כמו טמפרטורה שליטה בעבודה זו נוסדה על ידי תרמוסטט על בסיס מים, טווח טמפרטורות עבודה הוא אידיאלי מוגבל ל- 0 - 100 מעלות צלזיוס. טווח זה ניתן להרחיב באמצעות אחרים נוזלים בקרת טמפרטורה כגון שמן או העסקת כיוונונים אחרים, למשל התקן Peltier. בפועל, טמפרטורת מוגבל גם על-ידי עיבוי אפשרי או אידוי. בנוסף, עבור טמפרטורות הרחק מן בטמפרטורת החדר, המופע של מעבר הדרגתי טמפרטורת מצב יציב מעבר לחדר התצפית הופכת יותר סביר. בנוסף, ציוד הדמיה עשויים להיפגע בטמפרטורות קיצוניות. טווחי טמפרטורה אופיינית המתאימה ללימודים שלפוחית השומנים (~ 10-50 ° C7,9) נזק לציוד התצפית צריכה להיחשב אבל הוא בדרך כלל לא צפוי.
שלפוחית תחום תצפית חפצים
ישנם מספר מקורות על התבוננות חפצים באמצעות מיקרוסקופיית שדה רחב זריחה. קודם כל, אחד צריך להיות מודע כי הרזולוציה המרבית r של אובייקט חלה לבדיקה ויזואלית של שלפוחית שלב הברית קובע מגבלת זיהוי של השומנים תחומים לפי: 
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56034/56034eq2v2.jpg"> איפה λ הוא אורך הגל פליטה, נה מספרי הצמצם של המטרה. מטרה טיפוסי עם 40 x הגדלה של נה של 0.6 אשר מזהה ירוק פליטת אור סביב 560 nm היו מגיעות עם רזולוציה אופטית של ~0.6 מיקרומטר. לפיכך, מחקרים המשווים שלב מצבים של שלפוחית זני תערובות השומנים מסוים בין שונים תנאים כדאי להשתמש אותה מטרה התערובת השומנים אותו.
חפץ נוסף הוא המופע של השומנים תחומים אלו צילום-חמצון השומנים עקב חשיפה ממושכת עירור אור41. צילום-נזק מתרחשת מעדיפים על פחמימנים רוויים השומנים moieties. למעשה, עבור כמה יצירות השומנים, כגון תחום היווצרות שלפוחית בתחילה הומוגנית נצפתה כאן לאחר תקופה ארוכה של עירור לאור החשיפה (~ 30 s). כדי להתמודד עם נושא זה, האור עירור נשמר ממוקד אחד שדה ראייה בלבד לכמה שניות הערכת המדינה שלב. לפיכך, DiIC18 היה מתאים למטרות שלנו. צבעים אחרים, עם זאת, עשויים להיות רגישים הרבה יותר, ייתכן שיהיה עליך לטפל ב עוצמות עירור נמוכות, עם זמנים קצרים יותר לאור החשיפה עירור.
גזירה מכני של העברת פיפטה השלפוחיות המוגלתיות מתערבב שעשויות להיות תחומים באופן זמני, ובכך לעוות את התנהגות שלב שלפוחית נראית לעין. עבור כמה סטיות תקן, שלפוחית שונים הראו התנהגויות שונות שלב 0 min ו- 5 דקות לאחר פיפטה להעביר אל coverslip המיקרוסקופ. גם הלחץ הטיה הנגרמת על ידי זרימת נוזל במכשיר microfluidic הוכח לגרום בתחום ערבוב47. שלפוחית צריך להיות שמאל ללא הפרעה על כמות מספקת של זמן equilibration לפני התצפית. במסגרת מחקר זה, שלפוחית לכודים על המכשיר microfluidic נותרו ללא הפרעה לשעה לאחר טעינה שלפוחית וחילופי פתרון לפני התצפית.
כדי להימנע כמה הקשיים הנ ל, כמו גם על האיסור המוטל על ידי הגבלת עקיפה אור, שיטות אלטרנטיביות כגון ספקטרוסקופיה תהודה מגנטית גרעינית48 או סופר רזולוציה מיקרוסקופ טכניקות49 יכול להיות מועסק.
מסקנה ו- outlook
העבודה הציג מדגים ערכה של שיטות המאפשר הניתוח של השפעת תנאים פתרון סימטרי אסימטרי מליחות גבוהה על קרום שלב ההפרדה. כל אחת מהשיטות שהוצגו מתאימים ליישומים אחרים. לדוגמה, המכשיר microfluidic מספק פלטפורמה ללמוד את קינטיקה של היווצרות תחום והעלמות על אינדוקציה פתרון האסימטריה. בנוסף, תחום מראה כפונקציה של ריכוז מלח יכול לבדוק בכיוון הזה. כל השיטות יכול לשמש גם להסתכל על ההשפעה על ההתנהגות שלב באמצעות פתרונות אחרים מעניינים.

מאז הצפיה בגודל מיקרון תחומים באזור שלפוחית נוזל-נוזל מופרד שלב הענק unilamellar (כשמרוגזים) על ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ, האנשים שנגדם השתמשו כמערכת מודל לחקור את השומנים הרפסודה השערה1,2 , 3 . האזור של bilayer שעמד חופשי שלהם נמצא בטווח של אשר מתאי ביולוגי, הם מתאימים מחקה של ממברנות פלזמה שמציעות ייסחפו ממוצע. בוצעו מחקרים רבים על האנשים שנגדם כזה עם שלפוחית התפזרו במים טהורים, סוכרוז או פתרונות נמוך-מליחות4,5,6,7,8. תנאים אלה, לעומת זאת, אינן משקפות חשיפה רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של biomembranes מליחות גבוהה סביבות ואסימטריה פתרון הטרנס-הממברנה כמו גם התנאים עבור תאים.
בעבודה זו, בפרסום הקודם שלנו קבוצה9המדינות שלב של האנשים שנגדם ל טעונה נבחנו כפונקציה של הנוכחות של אסימטריה מלח והפתרון על פני הקרום. האנשים שנגדם הוכנו של תערובות של יחסים שונים של dioleoylphosphatidylglycerol (DOPG), ביצה ספינגומיילין (eSM) כולסטרול (חול) פתרון סוכרוז (עם osmolarity של mOsm 210/kg) או מאגר מליחות גבוהה (100 מ מ NaCl, 10 מ מ. טריס, pH 7.5, 210 mOsm/kg). הבחירה השומנים היה מוצדק על ידי הנתונים כבר השיג בתרשים שלב של6,זו תערובת8.
מספר שיטות להכנת כשמרוגזים זמינים ב11,10,12 ספרות (שימו לב כי כאן, לא נשקול אלה מעורבים העברת שומנים מן מבוססת על שמן פאזה מימית 13 , 14 בשל הסכנה הטמונה של שאריות שמן הנותרים קרום העשויים להשפיע על ההתנהגות שלב). הכנת האנשים שנגדם במאגר מליחות גבוהה קשורה אתגרים ספציפיים. פתרונות של נמוך כוח יונית, שיטת electroformation15,16 מציג דרך מהירה להכנת כשמרוגזים של התשואות גבוהות עם פגמים קטנים10,17. השיטה מבוססת על הפקדת שכבה של שומנים על משטח מוליך (האלקטרודה), ייבוש להם לחות אותם עם תמיסה מימית תוך יישום שדה AC. עם זאת, שיטה זו דורשת התאמות אם מלח קיים תמיסה מימית18,19. ההנחה היא כי הכוח המניע לצמיחה שלפוחית על-ידי electroformation הוא electroosmosis16 אשר מתעכבת ב conductivities גבוהה20. מכאן, electroswelling של האנשים שנגדם בפתרונות מליחות גבוהה היא לא בגישה ישירה כפי שהוא דורש אופטימיזציה עבור ריכוזים שונים מלח נוכח הפתרון נפיחות. בסיוע ג'ל שלפוחית ונפיחות21,22 היא חלופה אפשרית electroformation עם פעמים היווצרות מהירה אפילו יותר. גישה זו מתבסס על הידרציה הסרט את השומנים משופרת כאשר ג'ל (agarose או אלכוהול (PVA)) משמש מצע. גישות אלה, לעומת זאת, מגיעים עם הסיכון של זיהום הממברנה במקרה מבוססי agarose נפיחות23 ו/או טמפרטורה מגבלות כמו במקרה של נפיחות מבוסס-PVA. באופן דומה, פרוטוקול לגדול כשמרוגזים על מצע של נייר תאית באחרונה הוקמה24. בעיות כלליות של שיטה זו הם חוסר שליטה על טוהר המצע, כמו גם את השימוש של כמויות גדולות של שומנים בדם. בעבודה זו, אנו מציגים, להציג את היתרונות של השיטה המסורתית ביותר להכנה בוס, כלומר ספונטנית נפיחות השיטה25,26. הוא מורכב ייבוש שכבה השומנים על מצע lipophobic, לחות זה האווירה אדי-מים, נפיחות לאחר מכן נפיחות בפתרון הרצוי (ראה איור 1 וכן פירוט בסעיף לפרוטוקול). שיטה זו אינו מציע שליטה על התפלגות גודל שלפוחית ותוצאות שלפוחית הכולל קטן לעומת שיטות איפה ההפקה נעזר שדה חשמלי, פולימר המצע או microfluidic אומר. עם זאת, שלפוחית איכות וגודל מתאימה עבור בדיקת מצב שלב קרום כמו בחנו כאן.
יצירת סימטריה בין הפתרונות על פני קרום שלפוחית מזוהה עם אתגרים מסוימים גם כן. אחד הגישה הנפוצה היא דילול ישירה של המתלה שלפוחית27,הפתרון הרצוי חיצוניים28. עם זאת, זה גם הקטנת הצפיפות הפצה שלפוחית. אסטרטגיה נוספת להחלפת לאט הפתרון חיצוני סביב האנשים שנגדם התיישבו בחלק התחתון של זרימה-תא המאפשר פתרון ב-, outflux. כדי למנוע הפרעה או אפילו מאבדים את שלפוחית עם הזרם, זרם נמוך תעריפי יישומית8, אשר מעניק גישה זו זמן-יעיל. יתר על כן, גם גישות אלה מבטיח פתרון חיצוני מלא exchange. פתרון ברור נועד לשתק שלפוחית על מנת למנוע איבוד אותם במהלך חילופי פתרון חיצוני. למשל, biotinylated האנשים שנגדם יכולה להיות קשורה אל29מצופים streptavidin פני השטח. עם זאת, גישה זו עשויה להוביל וריאציות ההלחנה ב מודבקת, ומכאן הקרום דבקה מגזרים30,31. היישום של מגנטי או שדות חשמליים ללכוד שלפוחית תוצאות הטלת קרום המתח32. העסקת מלקחיים אופטיים כדי ללכוד את שלפוחית דורש בעל ידית המצורפת (קרי חרוז), ואילו השימוש אלונקות אופטי עשויה להיות כרוכה חימום מקומי33. השמנה של האנשים שנגדם יכול להתבצע גם על ידי הגדלה אותם על חוטים פלטינום ללא ניתוק סופי34. זה אולם התשואות שלפוחית אשר אינן מבודדות, אשר בדרך כלל מחובר בחוטים או שלפוחית אחרים על ידי צינורות דקים השומנים (היתדות).
העבודה הציג מדגיש אסטרטגיות להתגבר על המגבלות הנ. תחילה נציג את תיאור מפורט של השיטה נפיחות ספונטנית הותאם והם ממוטבים עבור הייצור של האנשים שנגדם במאגרי מליחות גבוהה. לאחר מכן נסקור את שתי הגישות ביעילות ליצור פתרון אסימטרי תנאים על ידי דילול פשוטה או הניצול של מכשיר microfluidic. כי המטרה שלנו היא הניתוח של המדינה שלב ממברנה של האנשים שנגדם בתנאים פיתרון אחר, הסעיפים הבאים מתארים קריטריונים לניתוח סטטיסטי מוצלחת ורמזים הנוכחי עבור הימנעות בסיווג שווא.
הבדיקות בוצעו בתנאים איזותרמי, כמו גם תחת טמפרטורות משתנות. בזמן c טמפרטורהontrol בדרך כלל מועסק, פרטים על טמפרטורה ניסיוני-מיכשור וציוד מתוארים לעתים נדירות. . הנה, התקנה שנבנה ללא צורך במיקור חוץ להתבונן כשמרוגזים-בתנאי טמפרטורה שונים מוצג.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-(1&#39;-rac-glycerol), sodium salt</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840475C</td>
			<td>abbreviated as DOPG in the text</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chicken egg sphingomyelin</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>860061</td>
			<td>abbreviated as eSM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholesterol (ovine wool, &#62; 98 %)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>700000</td>
			<td>abbreviated as Chol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1,1&#129;&#39;-dioctadecyl-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D-282</td>
			<td>abbreviated as DiIC18</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform, HPLC grade (&#8805; 99.8 %)</td>
			<td>Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl (&#62; 99.8 %)</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCl (37 %)</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris (&#8805; 99.9 %)</td>
			<td>Roth</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose (&#8805; 99.5 %)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Threaded vial 45x27 mm, 15 mL</td>
			<td>Kimble</td>
			<td></td>
			<td>Soda flat bottom, white screw cap</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>MP220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer</td>
			<td>Gonotec</td>
			<td>Osmomat030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epi-fluorescence microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Observer D1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>TCS SP5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 40x, 0.6 NA</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LD Achroplan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 40x, 0.75 NA</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Objective 63x, 0.9 NA</td>
			<td>Leica</td>
			<td>506148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slide, 56x26 mm, 0.17 &#177; 0.01 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slip, 22x22 mm, 0.17 &#177; 0.01 mm</td>
			<td>Menzel-Gl&#228;aser</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Bremix Flexible Packaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes, 5 mL, 10 mL</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.45 &#181;m syringe filter</td>
			<td>GVS North America</td>
			<td>Cameo 25AS, 1213723</td>
			<td>Acetate, sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

phase behavior of charged vesicles under symmetric and asymmetric solution conditions monitored with fluorescence microscopy

שלפוחית מופרד שלב unilamellar ענק (כשמרוגזים) מפגין coexisting נוזלי-הורה, מגרה-נוזל תחומים הם כלי biophysical נפוצות כדי לחקור את ההשערה הרפסודה השומנים. מחקרים רבים, עם זאת, להזניח את ההשפעה של תנאי פיזיולוגית. על חשבון זה, העבודה הנוכחית מציג השפעת מליחות גבוהה מאגר, טרנס-הממברנה פתרון אסימטריה על נוזל-נוזל שלב ההפרדה כשמרוגזים טעונה גדל מ dioleylphosphatidylglycerol, ספינגומיילין ביצה וכולסטרול. ההשפעות נחקרו תחת תנאי טמפרטורה איזותרמי, בדרגות שונות.
אנו מתארים ציוד ואסטרטגיות ניסיוני ישימה עבור ניטור את היציבות של תחומים נוזלי coexisting באזור שלפוחית טעונה בתנאים סימטרי אסימטרי פתרון מליחות גבוהה. זה כולל גישה להכין. את האנשים שנגדם ל טעונה במאגר מליחות גבוהה בטמפרטורה גבוהה. הפרוטוקול מצריכה את האפשרות לבצע החלפה חלקית של הפתרון חיצוני על-ידי צעד דילול פשוטים תוך מזעור דילול שלפוחית. גישה חלופית מוצג ניצול התקן microfluidic המאפשר החלפת פתרון חיצוני מלא. ההשפעות פתרון על שלב ההפרדה נחקרו גם תחת טמפרטורות משתנות. למטרה זו, אנו מציגים את העיצוב הבסיסי ואת התועלת של חדר בקרת טמפרטורה שנבנה ללא צורך במיקור חוץ. יתר על כן, אנו משקפים את ההערכה של המדינה שלב בוס, החסרונות הקשורים עם זה, וכיצד לעקוף אותם.

Watch this Scientific Journal Video about Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy at JoVE.com

Phase Behavior of Charged Vesicles Under Symmetric and Asymmetric Solution Conditions Monitored with Fluorescence Microscopy

ניסויים שלב מופרדים unilamellar ענק שלפוחית (כשמרוגזים) לעתים קרובות להזניח את התנאים פיזיולוגית. עבודה זו מציג גישות לחקר השפעת מליחות גבוהה מאגר על נוזל-נוזל שלב ההפרדה בין האנשים שנגדם ל טעונה כפונקציה של טרנס-הממברנה לפתרון האסימטריה ואת הטמפרטורה.

שלב התנהגות של שלפוחית טעונה בתנאים פתרון סימטרי אסימטרי במעקב עם מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית

Phase-separated giant unilamellar vesicles (GUVs) exhibiting coexisting liquid-ordered and liquid-disordered domains are a common biophysical tool to ...

Research

JoVE Journal

Chemistry

Determination of the Gas-phase Acidities of Oligopeptides

קביעת Acidities גז השלב של Oligopeptides

Amino acid residues located at different positions in folded proteins often exhibit different degrees of acidities. For example, a cysteine residue ...

Particles without a Box: Brush-first Synthesis of Photodegradable PEG Star Polymers under Ambient Conditions

חלקיקים ללא תיבה: סינתזה המברשת הראשונה של Photodegradable פולימרים הכוכבים PEG בתנאי הסביבה

Convenient methods for the rapid, parallel synthesis of diversely functionalized nanoparticles will enable discovery of novel formulations for drug ...

Mizoroki-Heck Cross-coupling Reactions Catalyzed by Dichloro{bis[1,1',1''-(phosphinetriyl)tripiperidine]}palladium Under Mild Reaction Conditions

Mizoroki-Heck Cross-coupling Reactions Catalyzed by Dichloro{bis[1,1',1''-phosphinetriyltripiperidine]}palladium Under Mild Reaction Conditions

תגובות חוצה צימוד Mizoroki-לעזאזל האיצו ידי dichloro {bis [1,1 &#39;, 1&#39;&#39; - tripiperidine (phosphinetriyl)]} פלדיום בתנאי תגובה מתון

Dichloro-bis(aminophosphine) complexes of palladium with the general formula of [(P{(NC5H10)3-n(C6H11)n})2Pd(Cl)2] (where n = 0-2), belong to a new family ...

Synthetic Methodology for Asymmetric Ferrocene Derived Bio-conjugate Systems via Solid Phase Resin-based Methodology

מתודולוגיה סינתטית למערכות ביו-המצומד Asymmetric Ferrocene נגזרו באמצעות מתודולוגיה המבוססת על שרף שלב מוצקה

Early detection is a key to successful treatment of most diseases, and is particularly imperative for the diagnosis and treatment of many types of cancer. ...

A Simple Method for the Size Controlled Synthesis of Stable Oligomeric Clusters of Gold Nanoparticles under Ambient Conditions

שיטה פשוטה עבור סינתזת מבוקרת הגודל של אשכולות Oligomeric היציבים של זהב חלקיקים בתנאי סביבה

Reducing dilute aqueous HAuCl4 with sodium thiocyanate (NaSCN) under alkaline conditions produces 2 to 3 nm diameter nanoparticles. Stable grape-like ...

Construction and Systematical Symmetric Studies of a Series of Supramolecular Clusters with Binary or Ternary Ammonium Triphenylacetates

בינוי שיטתי סימטריים מחקרים של סדרה של אשכולות מולקולריים עם Triphenylacetates בינארי או המשולש אמוניום

Functions of clusters in nano or sub-nano scale significantly depend on not only kinds of their components but also arrangements, or symmetry, of their ...

A Protocol for Electrochemical Evaluations and State of Charge Diagnostics of a Symmetric Organic Redox Flow Battery

פרוטוקול הערכות אלקטרוכימיות ומדינת האבחון הממונה על סוללת חמזור תזרים אורגנית סימטרי

Redox flow batteries have been considered as one of the most promising stationary energy storage solutions for improving the reliability of the power grid ...

Probing the Structure and Dynamics of Interfacial Water with Scanning Tunneling Microscopy and Spectroscopy

חיטוט את המבנה ואת הדינמיקה של מים פנים עם סריקה מיקרוסקופ מינהור וספקטרוסקופיה

Water/solid interfaces are ubiquitous and play a key role in many environmental, biophysical, and technological processes. Resolving the internal ...

Fabricating High-viscosity Droplets using Microfluidic Capillary Device with Phase-inversion Co-flow Structure

בדיית טיפות צמיגות גבוהה באמצעות המכשיר נימי Microfluidic עם שלב-היפוך זרימה ושיתוף מבנה

The generation of monodisperse droplets with high viscosity has always been a challenge in droplet microfluidics. Here, we demonstrate a phase-inversion ...

Solid-phase Synthesis of [4.4] Spirocyclic Oximes

מוצק-שלב הסינתזה של Oximes Spirocyclic [4.4]

A convenient synthetic route for spirocyclic heterocycles is well sought after due to the molecule&#39;s potential use in biological systems. By means of ...